Модель культуры клеток адипоцитов для изучения влияния модуляции белка и микро-РНК на функцию адипоцитов

Резюме

Здесь представлен протокол для доставки олигонуклеотидов, таких как малоинтерферная РНК (siRNA), микро-РНК-мимики (miRs) или анти-микро-РНК (anti-miR) в зрелые адипоциты для модуляции экспрессии белка и микро-РНК.

Аннотация

Изменение функции адипоцитов способствует патогенезу метаболических заболеваний, включая диабет 2 типа и резистентность к инсулину. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Модуляция экспрессии белков и микро-РНК в адипоцитах остается очень сложной задачей. В данной работе описан протокол дифференцировки мышиных фибробластов в зрелые адипоциты и модуляции экспрессии белков и микро-РНК в зрелых адипоцитах посредством обратной трансфекции с использованием малоинтерферирующих РНК (siRNA) и микро-РНК, имитирующих (miR-mimic) олигонуклеотидов. Этот протокол обратной трансфекции включает инкубацию трансфекционного реагента и олигонуклеотидов с образованием комплекса в пластине клеточной культуры, к которой добавляются зрелые адипоциты. Затем адипоцитам дают повторно прикрепиться к поверхности адгезивной пластины в присутствии комплекса олигонуклеотидов/трансфекционных реагентов. Функциональные анализы, такие как изучение передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липогенеза и липолиза, могут быть выполнены на трансфектированных зрелых адипоцитах 3T3-L1 для изучения влияния манипуляций с белком или микро-РНК на функцию адипоцитов.

Введение

Ожирение считается основным фактором риска для многочисленных метаболических заболеваний, включая резистентность к инсулину (IR), диабет 2 типа (T2D) и сердечно-сосудистые заболевания^1. Современные методы лечения не смогли остановить постоянно растущую распространенность этих заболеваний, и управление ИК пациентов с ожирением и диабетом остается важной клинической проблемой. Жировая ткань играет важнейшую роль в контроле энергетического гомеостаза, а ее патологическое расширение при ожирении способствует развитию ИК и^СД22,3. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные методы для выполнения всех этапов протокола в ламинарной проточной культуре клеток. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех реагентах и оборудовании.

1. Дифференцировка фибробластов мысиной 3T3-L1 в адипоциты

1. Выращивают фибробласты 3T3-L1 в посуде по 100 мм в культуральном среде-ДМЭМ без пирувата, глюкозы 25 мМ, 10% сыворотки новорожденных телят и 1% пенициллина и стрептомицина(рисунок 1А). Поместите посуду в инкубатор для культивации тканей (7% CO₂ и 37 °C).
2. Через два дня после слияния изменяют ку....

Результаты

Используя описанную здесь процедуру обратной трансфекции для модуляции экспрессии белков или микро-РНК в адипоцитах 3T3-L1, было показано, что адипоциты сохраняют свою морфологию после трансфекции(рисунок 1B,C). Действительно, через 2 дня после тр.......

Обсуждение

В данной работе представлен подробный протокол дифференцировки и трансфекции зрелых адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов, таких как, но не ограничиваясь ими, siRNAs, микро-РНК-мимика и анти-ми?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL