Модель культуры клеток адипоцитов для изучения влияния модуляции белка и микро-РНК на функцию адипоцитов

Резюме

Здесь представлен протокол для доставки олигонуклеотидов, таких как малоинтерферная РНК (siRNA), микро-РНК-мимики (miRs) или анти-микро-РНК (anti-miR) в зрелые адипоциты для модуляции экспрессии белка и микро-РНК.

Аннотация

Изменение функции адипоцитов способствует патогенезу метаболических заболеваний, включая диабет 2 типа и резистентность к инсулину. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Модуляция экспрессии белков и микро-РНК в адипоцитах остается очень сложной задачей. В данной работе описан протокол дифференцировки мышиных фибробластов в зрелые адипоциты и модуляции экспрессии белков и микро-РНК в зрелых адипоцитах посредством обратной трансфекции с использованием малоинтерферирующих РНК (siRNA) и микро-РНК, имитирующих (miR-mimic) олигонуклеотидов. Этот протокол обратной трансфекции включает инкубацию трансфекционного реагента и олигонуклеотидов с образованием комплекса в пластине клеточной культуры, к которой добавляются зрелые адипоциты. Затем адипоцитам дают повторно прикрепиться к поверхности адгезивной пластины в присутствии комплекса олигонуклеотидов/трансфекционных реагентов. Функциональные анализы, такие как изучение передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липогенеза и липолиза, могут быть выполнены на трансфектированных зрелых адипоцитах 3T3-L1 для изучения влияния манипуляций с белком или микро-РНК на функцию адипоцитов.

Введение

Ожирение считается основным фактором риска для многочисленных метаболических заболеваний, включая резистентность к инсулину (IR), диабет 2 типа (T2D) и сердечно-сосудистые заболевания^1. Современные методы лечения не смогли остановить постоянно растущую распространенность этих заболеваний, и управление ИК пациентов с ожирением и диабетом остается важной клинической проблемой. Жировая ткань играет важнейшую роль в контроле энергетического гомеостаза, а ее патологическое расширение при ожирении способствует развитию ИК и^СД22,3. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Многие исследования изучали роль кодирующих белок РНК в физиологии адипоцитов и их связь с ожирением.

Совсем недавно открытие некодирующих РНК (ncRNAs), особенно микро-РНК (miRs), создало новые концепции, связанные с механизмом регуляции программ экспрессии генов. Исследования показали, что нРНК являются важными регуляторами функции адипоцитов, и что их дисрегуляция играет важную роль при метаболических заболеваниях^4. Таким образом, манипуляции с белками и ncРНК в адипоцитах имеют решающее значение для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их влияния на такие патологии, как СД2. Тем не менее, манипулирование экспрессией белков и ncRNAs in vivo, а также в первичных адипоцитах остается очень сложным, что способствует использованию моделей адипоцитов in vitro.

Мышиные фибробласты 3T3-L1 легко дифференцируются в зрелые, функциональные и инсулин-чувствительные адипоциты, которые представляют собой хорошо охарактеризованные клеточные линии, используемые для изучения функции адипоцитов (например, передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липолиза и секреции адипокинов)^{5,6,7,8,9,10.} Эти свойства делают адипоциты 3T3-L1 привлекательной моделью для модуляции экспрессии кодирующих белок и nc-РНК для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их потенциальной роли в заболеваниях, связанных с ожирением. К сожалению, в то время как фибробласты 3T3-L1 легко трансфектируются с использованием коммерчески доступных реагентов, дифференцированные адипоциты 3T3-L1 являются одной из самых сложных клеточных линий для трансфектации. Вот почему многочисленные исследования, манипулируя экспрессией генов в клетках 3T3-L1, были сосредоточены на дифференцировке адипоцитов, а не на функции адипоцитов.

Долгое время единственным эффективным методом трансфектации адипоцитов была электропорация^5,которая утомительна, дорога и может вызвать повреждение клеток. В этой статье сообщается о методе обратной трансфекции с использованием общего трансфекционного реагента, который сокращает практическое время для трансфекции, не влияет на жизнеспособность клеток и намного дешевле, чем электропорация. Этот протокол идеально подходит для трансфекции siRNA и других олигонуклеотидов, таких как микро-РНК-мимики (miR-мимики) и антимир-мимики. Принцип протокола обратной трансфекции заключается в инкубации трансфекционного реагента и олигонуклеотидов для образования комплекса в пластине клеточной культуры, а затем посева зрелых адипоцитов в колодцы. Затем адипоциты повторно прикрепляются к поверхности адгезивной пластинки в присутствии комплекса реагентов олигонуклеотидов/трансфекции. Эта простая, эффективная и недорогая методология позволяет изучать роль кодирующих белок РНК и миР в функции адипоцитов и их потенциальную роль в заболеваниях, связанных с ожирением.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные методы для выполнения всех этапов протокола в ламинарной проточной культуре клеток. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех реагентах и оборудовании.

1. Дифференцировка фибробластов мысиной 3T3-L1 в адипоциты

1. Выращивают фибробласты 3T3-L1 в посуде по 100 мм в культуральном среде-ДМЭМ без пирувата, глюкозы 25 мМ, 10% сыворотки новорожденных телят и 1% пенициллина и стрептомицина(рисунок 1А). Поместите посуду в инкубатор для культивации тканей (7% CO₂ и 37 °C).
2. Через два дня после слияния изменяют культуральную среду, заменяя ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% сыворотки для телят плода (FCS) и 1% пенициллина и стрептомицина, дополненных 0,25 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), 0,25 мкМ дексаметазона, 5 мкг / мл инсулина и 10 мкМ росиглитазона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения слияния требуется 5 дней, когда клетки засеиваются по 300 000 клеток на чашку размером 100 мм.
3. Через два дня замените культуральный среду ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина с добавлением инсулина 5 мкг/мл и 10 мкМ росиглитазона и инкубата в течение 2 дней. Затем кормите клетки каждые 2 дня ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина(Рисунок 1B).
4. Трансфектируют адипоциты 3T3-L1 через 7-8 дней после начала протокола дифференцировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно достичь высокого уровня дифференцировки (>80%) до трансфекции, чтобы избежать пролиферации оставшихся фибробластов после трансфекции, что приведет к смешанной популяции клеток, которые могут сузить результаты.

2. Подготовка плит с предварительным покрытием

1. За сутки до или за несколько часов до трансфекции готовят раствор коллагена I типа по 100 мкг/мл в 30% этаноле из запасного раствора по 1 мг/мл. Добавьте 250 мкл коллагена на скважину 12-скважинной пластины и 125 мкл на скважину 24-скважинной пластины и распределите раствор по поверхности скважины.
2. Оставьте тарелку без крышки под культуральным капюшоном до тех пор, пока коллаген не высохнет. Дважды промыть фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (D-PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты с покрытием доступны для покупки.

3. Приготовление трансфекционной смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация siRNA составляет от 1 до 100 нМ (от 1 до 100 пмоль siRNA на скважину 12-скважинной пластины). Конечная концентрация miR-мимики составляет 10 нМ (10 пмоль/колодец). Определите наилучшую концентрацию каждой siRNA, miR-мимики или другого олигонуклеотида до начала эксперимента, чтобы избежать нецелевых эффектов. Проводите трансфекционные эксперименты в трех количествах, чтобы облегчить статистический анализ результатов. Подготовьте все реагенты в избытке, чтобы учесть нормальные потери во время пипетки.

1. Смешайте путем пипетирования (объем/объем) siRNA (или других олигонуклеотидов) с улучшенной минимальной существенной средой(таблица 1). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Добавьте трансфекционный реагент и улучшенную минимальную необходимую среду к siRNA и пипетку для смешивания(таблица 1). Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (в течение этого времени переходить к разделу 4). Добавьте трансфекционную смесь в каждый кладезы коллагеновой пластины.

4. Получение адипоцитов 3T3-L1

1. Дважды вымойте ячейки в 100-миллиметровой чашке Петри с помощью D-PBS. Добавьте в ячейки 5 трипсина (1 мл на 100 мм тарелки), обязательно покрывая трипсином всю поверхность. Подождите 30 с и аккуратно удалите трипсин.
2. Высиживать чашку Петри в течение 5-10 мин при 37 °C в инкубаторе. Коснитесь тарелки 100 мм, чтобы отсоедать ячейки.
3. Добавьте 10 мл DMEM без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина для нейтрализации трипсина. Осторожно пипетируйте среду вверх и вниз, чтобы отсоедать клетки и гомогенизировать клеточную суспензию.
4. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Malassez или автоматизированного счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 6,25^{х 10 5} клеток / мл среды. Посев 800 мкл клеточной суспензии/скважины 12-скважинной пластины (5 х 10⁵ ячеек) или 400 мкл клеточной суспензии/скважины 24-скважинной пластины (2,5 х 10⁵ клеток), содержащей трансфекционную смесь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одна 100-миллиметровая чашка Петри адипоцитов позволит подготовить одну 12-скважинную пластину или одну 24-скважинную пластину. Тарелка толщиной 100 мм обычно содержит 6-7 х 10⁶ адипоцитов, что соответствует 5 х 10⁵ адипоцитов на колодец 12-колодезной пластины.
5. Инкубируют пластины в инкубаторе клеточной культуры (7% CO₂ и 37 °C) и не нарушают работу клеток в течение 24 ч. На следующий день осторожно замените супернатант свежим ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно засеять клетки в коллагеновые предварительно покрытые 48- и 96-колодезными пластинами, но принять больше мер предосторожности при замене среды, чтобы избежать отслоения адипоцитов.

5. Функциональный анализ трансфектированных адипоцитов 3T3-L1

1. Исследование целевого нокдауна через 24-48 ч и 48-96 ч после симумической доставки siRNA или miR для мРНК и белка соответственно.
2. Выполняйте функциональный анализ трансфефицированных адипоцитов для изучения передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, секреции адипокина, липолиза и липогенеза.

Результаты

Используя описанную здесь процедуру обратной трансфекции для модуляции экспрессии белков или микро-РНК в адипоцитах 3T3-L1, было показано, что адипоциты сохраняют свою морфологию после трансфекции(рисунок 1B,C). Действительно, через 2 дня после тр...

Обсуждение

В данной работе представлен подробный протокол дифференцировки и трансфекции зрелых адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов, таких как, но не ограничиваясь ими, siRNAs, микро-РНК-мимика и анти-ми?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL