Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires

Résumé

Présenté ici est un protocole pour délivrer des oligonucléotides tels que l’ARN interférent petit (siRNA), les imitations de micro-ARN (miRs) ou les anti-micro-ARN (anti-miR) dans les adipocytes matures pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN.

Résumé

L’altération de la fonction adipocytaire contribue à la pathogenèse des maladies métaboliques, y compris le diabète de type 2 et la résistance à l’insuline. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. La modulation de l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes reste très difficile. Cet article décrit un protocole pour différencier les fibroblastes murins en adipocytes matures et pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes matures par transfection inverse en utilisant des oligonucléotides imitant l’ARN (siRNA) et le micro-ARN (miR mimic). Ce protocole de transfection inverse implique l’incubation du réactif de transfection et des oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire à laquelle les adipocytes matures sont ajoutés. Les adipocytes sont ensuite autorisés à se rattenir à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Des analyses fonctionnelles telles que l’étude de la signalisation de l’insuline, de l’absorption du glucose, de la lipogenèse et de la lipolyse peuvent être effectuées sur les adipocytes matures 3T3-L1 transfectés pour étudier l’impact de la manipulation des protéines ou des micro-ARN sur la fonction adipocytaire.

Introduction

L’obésité est considérée comme un facteur de risque majeur pour de nombreuses maladies métaboliques, y compris la résistance à l’insuline (RI), le diabète de type 2 (DT2) et les maladies^{cardiovasculaires 1.} Les thérapies actuelles n’ont pas réussi à arrêter la prévalence sans cesse croissante de ces maladies, et la prise en charge de l’IR des patients obèses et diabétiques reste un problème clinique important. Le tissu adipeux joue un rôle crucial dans le contrôle de l’homéostasie énergétique, et son expansion pathologique pendant l’obésité contribue au développement de l’IR et du DT2D2,³. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. De nombreuses études ont étudié le rôle des ARN codant pour les protéines dans la physiologie des adipocytes et leur association avec l’obésité.

Plus récemment, la découverte d’ARN non codants (ARNnc), en particulier de micro-ARN (miR), a forgé de nouveaux concepts liés au mécanisme de régulation des programmes d’expression génique. Des études ont montré que les ARNnc sont d’importants régulateurs de la fonction adipocytaire, et que leur dérèglement joue un rôle important dans les maladies métaboliques⁴. Ainsi, la manipulation des protéines et des ARNnc dans les adipocytes est cruciale pour déchiffrer leurs rôles dans la fonction adipocytaire et leur impact sur des pathologies telles que le DT2. Cependant, la manipulation de l’expression des protéines et des ARNnc in vivo ainsi que dans les adipocytes primaires reste très difficile, favorisant l’utilisation de modèles adipocytaires in vitro.

Les fibroblastes murins 3T3-L1 se différencient facilement en adipocytes matures, fonctionnels et sensibles à l’insuline, qui sont une lignée cellulaire bien caractérisée utilisée pour étudier la fonction adipocytaire (par exemple, la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipolyse et la sécrétion d’adipokines)^5,6,^7,8,9,10. Ces propriétés font des adipocytes 3T3-L1 un modèle attrayant pour moduler l’expression des protéines codant et des ARN nc afin de déchiffrer leur rôle dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité. Malheureusement, alors que les fibroblastes 3T3-L1 sont faciles à transfecter à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce, les adipocytes 3T3-L1 différenciés sont l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. C’est pourquoi de nombreuses études manipulant l’expression des gènes dans les cellules 3T3-L1 se sont concentrées sur la différenciation des adipocytaires plutôt que sur la fonction adipocytaire.

Pendant longtemps, la seule technique efficace pour transfecter les adipocytes était l’électroporation⁵, qui est fastidieuse, coûteuse et peut causer des dommages cellulaires. Cet article rapporte une technique de transfection inverse utilisant un réactif de transfection commun, qui réduit le temps de transfection pratique, n’a aucun effet sur la viabilité cellulaire et est beaucoup moins coûteuse que l’électroporation. Ce protocole est parfaitement adapté à la transfection de siRNA et d’autres oligonucléotides tels que les mimiques de micro-ARN (miR mimics) et les anti-miR. Le principe du protocole de transfection inverse est d’incuber le réactif de transfection et les oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire, puis d’ensemencer les adipocytes matures dans les puits. Ensuite, les adipocytes se rattachent à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Cette méthodologie simple, efficace et peu coûteuse permet d’étudier le rôle des ARN et des miR codant pour les protéines dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité.

Protocole

REMARQUE: Utilisez des techniques stériles pour effectuer toutes les étapes du protocole dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et l’équipement.

1. Différenciation des fibroblastes murins 3T3-L1 en adipocytes

1. Cultiver les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 mm en milieu de culture DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pénicilline et de streptomycine (Figure 1A). Placer les plats dans un incubateur de culture tissulaire (7% de CO₂ et 37 °C).
2. Deux jours après la confluence, changer le milieu de culture, en remplaçant par du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 1 % de pénicilline et de streptomycine complétées par 0,25 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 0,25 μM de dexaméthasone, 5 μg/mL d’insuline et 10 μM de rosiglitazone.
   REMARQUE: Il faut 5 jours pour atteindre la confluence lorsque les cellules sont ensemencées à 300 000 cellules par plat de 100 mm.
3. Deux jours plus tard, remplacer le milieu de culture par du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine complétées par 5 μg/mL d’insuline et 10 μM de rosiglitazone et incuber pendant 2 jours. Ensuite, nourrissez les cellules tous les 2 jours avec du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% FCS, et 1% de pénicilline et de streptomycine (Figure 1B).
4. Transfecter les adipocytes 3T3-L1 7-8 jours après le début du protocole de différenciation.
   NOTE: Il est important d’atteindre un niveau élevé de différenciation (>80%) avant la transfection pour éviter la prolifération des fibroblastes restants après la transfection, ce qui conduirait à une population mixte de cellules qui pourrait biaiser les résultats.

2. Préparation des plaques prélaquées

1. La veille ou quelques heures avant la transfection, préparer une solution de collagène de type I à 100 μg/mL dans de l’éthanol à 30 % à partir d’une solution type à 1 mg/mL. Ajouter 250 μL de collagène par puits d’une plaque de 12 puits et 125 μL par puits d’une plaque de 24 puits, et étaler la solution sur la surface du puits.
2. Laissez la plaque sans couvercle sous la hotte de culture jusqu’à ce que le collagène sèche. Laver deux fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco.
   REMARQUE: Des plaques pré-revêtues sont disponibles à l’achat.

3. Préparation du mélange de transfection

REMARQUE: La concentration finale de siRNA est comprise entre 1 et 100 nM (1 à 100 pmol de siRNA par puits d’une plaque de 12 puits). La concentration finale de l’imitation miR est de 10 nM (10 pmol/puits). Déterminez la meilleure concentration de chaque siRNA, miR mimique ou autre oligonucléotide avant de commencer l’expérience pour éviter les effets hors cible. Effectuer des expériences de transfection en trois exemplaires pour faciliter l’analyse statistique des résultats. Préparez tous les réactifs en excès pour tenir compte de la perte normale pendant le pipetage.

1. Mélanger par pipetage (volume/volume) le siRNA (ou d’autres oligonucléotides) avec un milieu essentiel minimal amélioré(tableau 1). Incuber pendant 5 min à température ambiante.
2. Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNi, et pipeter pour mélanger (Tableau 1). Incuber pendant 20 min à température ambiante (pendant ce temps, passer à la section 4). Ajouter le mélange de transfection à chaque puits de la plaque enduite de collagène.

4. Préparation des adipocytes 3T3-L1

1. Lavez les cellules dans la boîte de Petri de 100 mm deux fois avec du D-PBS. Ajouter 5x trypsine aux cellules (1 mL par plat de 100 mm), en veillant à couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 s et retirez soigneusement la trypsine.
2. Incuber la boîte de Petri pendant 5-10 min à 37 °C dans l’incubateur. Appuyez sur le plat de 100 mm pour détacher les cellules.
3. Ajouter 10 ml de DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de FCS et 1% de pénicilline et de streptomycine pour neutraliser la trypsine. Pipetez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire.
4. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur de cellules automatisé et ajustez la concentration des cellules à 6,25 x^{10 5} cellules/mL de milieu. Ensemencer 800 μL de la suspension/puits cellulaire d’une plaque de 12 puits (5 x^{10 5} cellules) ou 400 μl de la suspension cellulaire/puits d’une plaque de 24 puits (2,5 x 10⁵ cellules) contenant le mélange de transfection.
   REMARQUE: Une boîte de Petri de 100 mm d’adipocytes permettra la préparation d’une plaque de 12 puits ou d’une plaque de 24 puits. Un plat de 100 mm contient généralement 6-7 x 10⁶ adipocytes, ce qui correspond à 5 x 10⁵ adipocytes par puits d’une plaque de 12 puits.
5. Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire (7% de CO₂ et 37 °C), et ne pas perturber les cellules pendant 24 h. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de FCS et 1% de pénicilline et de streptomycine.
   REMARQUE: Il est également possible d’ensemencer les cellules dans des plaques de 48 et 96 puits précoucheuses de collagène, mais prenez plus de précautions lors du remplacement du milieu pour éviter le détachement des adipocytes.

5. Analyse fonctionnelle des adipocytes 3T3-L1 transfectés

1. L’étude cible knockdown 24-48 h et 48-96 h après l’administration d’ARNs ou de miR pour l’ARNm et la protéine, respectivement.
2. Effectuer des analyses fonctionnelles des adipocytes transfectés pour étudier la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la sécrétion d’adipokine, la lipolyse et la lipogenèse.

Résultats

En utilisant la procédure de transfection inverse décrite ici pour moduler l’expression de protéines ou de micro-ARN dans les adipocytes 3T3-L1, il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection (Figure 1B,C). En effet, 2 jours après la transfection, les adipocytes étaient bien étalés et attachés à la plaque et présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires qui sont une caracté...

Discussion

Cet article présente un protocole détaillé pour la différenciation et la transfection des adipocytes matures. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides tels que, mais sans s’y limiter, les siRNA, les imitations de micro-ARN et les anti-micro-ARN en adipocytes 3T3-L1, qui est l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. Cette méthode présente certaines limites qui doivent être prises en compte. Ce pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL