아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

요약

여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.

초록

adipocyte 기능의 변경은 타입-2 당뇨병및 인슐린 저항을 포함하여 신진 대사 질병의 병발생에 기여합니다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 지방세포에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 이 논문은 소염성 RNA(siRNA) 및 마이크로 RNA 모방(miR 모방) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 후색 성 전환체에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하고, 소염포 세포로 소명 섬유아세포를 분화시키는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 역형 형질 프로토콜은 성숙한 송신세포가 첨가되는 세포 배양판에서 복합체를 형성하기 위해 트랜스페션 시약및 올리고뉴클레오티드의 배양을 포함한다. 그런 다음 고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체가 있는 경우 부착판 표면에 다시 부착할 수 있다. 인슐린 신호, 포도당 섭취, 리포발생 및 lipolypolysis의 연구와 같은 기능성 분석은 단백질 또는 마이크로 RNA 조작이 백혈구 기능에 미치는 영향을 연구하기 위해 트랜스페드 3T3-L1 성숙한 지방세포에서 수행될 수 있다.

서문

비만은 인슐린 저항성 (IR), 타입-2 당뇨병 (T2D), 및 심장 혈관 질병을 포함하여 수많은 신진 대사 질병을 위한 중요한 위험 요소로 간주됩니다^1. 현재 치료는 이 질병의 끊임없이 상승 보급을 중단하는 것을 실패하고, 비만과 당뇨병 환자의 IR의 관리는 중요한 임상 문제점 남아 있습니다. 지방 조직은 에너지 항상성의 제어에 중요한 역할을하며, 비만 중 병리학적 확장은 IR 및 T2D^2,3의개발에 기여한다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 많은 연구 결과는 지방 세포 생리학에 있는 단백질 코딩 RNA의 역할 및 비만과의 그들의 협회를 조사했습니다.

최근에는 비코딩 RNA(ncRNA), 특히 마이크로 RNA(miRs)의 발견은 유전자 발현 프로그램의 조절 메커니즘과 관련된 새로운 개념을 위조했다. 연구 결과는 ncRNA가 adipocyte 기능의 중요한 레귤레이터이고, 그들의 dysregulation는 신진 대사 질병^4에중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 백심세포에서 단백질과 ncRNA의 조작은 백혈구 기능에서 그들의 역할및 T2D와 같은 병리에 그들의 충격을 해독하기 위하여 결정적입니다. 그러나, 생체 내뿐만 아니라 1 차 성 구도에서 단백질과 ncRNAs의 발현을 조작하는 것은 시험관 내 분비 세포의 사용을 선호, 매우 도전 남아있다.

Murine 3T3-L1 섬유아세포는 성숙하고 기능적이며 인슐린 반응성 세포세포로 쉽게 분화되며, 이는 세포세포를 연구하는 데 사용되는 잘 특징적인 세포주(예를 들어, 인슐린 신호, 포도당 섭취, lipolysis 및 adipokines 분비)^{5,6,7,8,9,10.} 이러한 특성은 3T3-L1 아디포사이클을 단백질 코딩 및 NC-RNA의 발현을 조절하여 안도 세포 기능에서의 역할과 비만 관련 질환에서의 잠재적 역할을 해독하는 매력적인 모델입니다. 불행히도, 3T3-L1 섬유아세포는 시판기 시약을 사용하여 쉽게 트랜스펙트를 할 수 있지만, 분화된 3T3-L1 세포세포는 트랜스펙트에 가장 어려운 세포주 중 하나입니다. 이것이 3T3-L1 세포에서 유전자 발현을 조작하는 수많은 연구가 교포세포 기능보다는 지방세포 분화에 초점을 맞춘 이유입니다.

장시간, 선포세포를 경화시키는 유일한 효율적인 기술은^{전기기공5였으며,}이는 지루하고 비용이 많이 들며 세포 손상을 일으킬 수 있다. 이 논문은 일반적인 트랜스펙트 시약을 사용하여 역경 질염 기술을 보고하여, 이는 트랜스펙트에 대한 실습 시간을 줄이고, 세포 생존에 영향을 미치지 않으며, 전기기보다 훨씬 저렴합니다. 이 프로토콜은 siRNA 및 마이크로 RNA 모방 (miR 모방) 및 항 miR와 같은 그밖 올리고뉴클레오티드의 질입에 완벽하게 적합합니다. 역형 형질 프로토콜의 원리는 세포 배양판에 복합체를 형성하기 위해 트랜스페트 시약및 올리고뉴클레오티드를 배양한 다음 성숙한 지방세포를 우물로 시드하는 것이다. 이어서, 송신세포는 올리고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체의 존재에서 부착판 표면에 재부착한다. 이 간단하고 효율적이며 저렴한 방법론은 지방 세포 기능에서 단백질 코딩 RNA 및 miRs의 역할과 비만 관련 질병에 대한 잠재적 역할에 대한 연구를 허용합니다.

프로토콜

참고: 멸균 기술을 사용하여 라미나르 유동 세포 배양 후드에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다. 모든 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 뮤린 3T3-L1 섬유아세포를 지방세포로 분화

1. 3T3-L1 섬유아세포는 피루바테 없이 배양 배지-DMEM, 25mM 포도당, 10% 신생아 종아리 혈청, 1% 페니실린 및 연쇄절제술(도1A)으로 3T3-L1섬유아세포를 성장시한다. 조직 배양 인큐베이터(7% CO₂ 및 37°C)에 접시를 놓습니다.
2. 인플루언서 후 이틀, 배양 배지를 변경, 피루바테, 25mM 포도당, 10% 태아 종아리 혈청(FCS), 1% 페니실린 및 연쇄상 구균신으로 대체하여 0.25mM 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 0.25 μM dexamethasone, 5 μg/mL
   참고: 세포가 100mm 접시당 300,000개의 세포에서 종자될 때 합의에 도달하는 데 5일이 걸립니다.
3. 이틀 후, 배양 배지를 피루바테, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균시(1% 페니실린 및 연쇄상 구균)로 대체하여 5 μg/mL 인슐린과 10μM 로시글리타존을 2일 동안 배양한다. 이어서, 피루바테, 25mM포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균(도1B)없이DMEM으로 2일마다 세포를 공급한다.
4. 3T3-L1 분화는 분화 프로토콜의 시작 후 7-8 일 트랜스펙트.
   참고: 트랜스펙트 후 남은 섬유아세포의 확산을 피하기 위해 과잉 변환 전에 높은 수준의 분화(>80%)에 도달하는 것이 중요하며, 이는 결과를 편향시킬 수 있는 세포의 혼합된 집단으로 이어질 것이다.

2. 프리코트 플레이트 준비

1. 전 또는 몇 시간 전에, 1 mg/mL의 스톡 용액에서 30% 에탄올에 100 μg/mL에서 콜라겐 타입 I의 용액을 준비한다. 12웰 플레이트의 웰당 250 μL, 24웰 플레이트의 웰당 125 μL을 추가하고 용액을 우물 표면에 퍼놓습니다.
2. 콜라겐이 건조 될 때까지 배양 후드 아래에 뚜껑없이 접시를 둡니다. 덜벡코의 인산염 완충식식염(D-PBS)으로 두 번 씻으시다.
   참고: 프리코트 플레이트를 구매할 수 있습니다.

3. 형질 전환 믹스의 준비

참고: siRNA의 최종 농도는 1과 100 nM (12 웰 플레이트의 웰 당 siRNA의 1 ~ 100 pmol)사이입니다. miR 모방의 최종 농도는 10 nM (10 pmol /well)입니다. 오프 타겟 효과를 피하기 위해 실험을 시작하기 전에 각 siRNA, miR 모방 또는 기타 올리고뉴클레오티드의 최상의 농도를 결정한다. 결과의 통계 분석을 용이하게하기 위해 삼중에서 형질 전환 실험을 수행합니다. 파이펫팅 중 정상적인 손실을 고려하여 모든 시약을 초과하여 준비합니다.

1. 파이펫팅(부피/부피)을 개선된 최소 필수매체(표 1)와함께 siRNA(또는 기타 올리고뉴클레오티드)로 혼합한다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
2. 회광 시약과 개선된 최소 필수 매체를 siRNA에 추가하고 파이펫을 혼합한다(표1). 실온에서 20분 동안 배양하십시오(이 기간 동안 4절로 진행). 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 트랜스펙트 믹스를 추가합니다.

4. 3T3-L1 분리구 준비

1. D-PBS로 100mm 페트리 접시에 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 5배 트립신을 셀에 추가합니다(100mm 접시당 1mL)를 추가하여 트립신으로 모든 표면을 덮습니다. 30 s를 기다렸다 조심스럽게 트립신을 제거합니다.
2. 인큐베이터에서 37°C에서 5-10분 동안 페트리 접시를 배양합니다. 100mm 접시를 탭하여 세포를 분리합니다.
3. 피루바테, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄절제술없이 DMEM 10ml를 추가하여 트립신을 중화시합니다. 배지를 위아래로 조심스럽게 파이프하여 세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화합니다.
4. 말라세즈 카운팅 챔버 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 세포의 농도를 6.25 x 10⁵ 세포/mL로 조정한다. 종자 800 μL의 셀 서스펜션/웰의 12웰 플레이트(5 x 10⁵ 셀) 또는 24웰 플레이트(2.5 x 10⁵ 셀)의 셀 서스펜션/웰의 400 μl이 형질 혼합을 함유하고 있다.
   참고: 100mm 페트리 접시 1개에 12웰 플레이트 또는 24웰 플레이트 1개를 준비할 수 있습니다. 100mm 접시에는 보통 6-7 x 10⁶ 개의 교포세포가 포함되어 있으며, 이는 12 웰 플레이트의 웰 당 5 x 10⁵ 교포구에 해당합니다.
5. 세포 배양 인큐베이터(7% CO₂ 및 37°C)에서 플레이트를 배양하고 24시간 동안 세포를 방해하지 않는다. 다음 날, 조심스럽게 피루바테, 25 mM 포도당, 10 % FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 절제술없이 신선한 DMEM으로 상체를 교체하십시오.
   참고: 세포를 콜라겐 전코팅 된 48- 및 96 웰 플레이트로 시드할 수도 있지만, 분포세포의 분리를 피하기 위해 미디어를 교체할 때 더 많은 예방 조치를 취할 수 있습니다.

5. 감염된 3T3-L1 선포세포의 기능분석

1. 연구 대상 녹다운 24-48 h 및 48-96 h siRNA 또는 miR 모방 후 mRNA와 단백질에 대 한 전달, 각각.
2. 인슐린 신호, 포도당 섭취, 아디포핀 분비, lipolysis 및 리포발생을 연구하기 위해 감염된 지방세포의 기능적 분석을 수행합니다.

결과

3T3-L1 분광구에서 단백질 또는 마이크로 RNA의 발현을 조절하기 위해 여기에 설명된 역형 형질의 절차를 사용하여, 형포세포는 트랜스펙션 후 그들의 형태를 보존하는 것으로나타났다(도 1B,C). 실제로, 2일 후, 대포세포는 잘 퍼지고 접시에 부착되어 성숙한 3T3-L1 의 특징인 다중 지질 방울을 제시했다. 지질 함량은 전과 감염및 비과감염형(...

토론

이 논문은 성숙한 지방세포의 분화 및 트랜스포션을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 역형 형질 방법은 시나, 마이크로 RNA 모방, 항마이크로 RNA 모방, 항마이크로RNA 와 같은 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙트하는 가장 어려운 세포주 중 하나인 3T3-L1 아디포사이클로 전환하는 간단하고 경제적이며 매우 효율적인 방법입니다. 이 메서드에는 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL