Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli

Özet

Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.

Özet

Adiposit fonksiyonunun değiştirilmesi Tip 2 diyabet ve insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Adipositlerde proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunun modülei son derece zorlu olmaya devam etmektedir. Bu makalede, murine fibroblastları olgun adipositlere ayırt etmek ve küçük müdahaleci RNA (siRNA) ve mikro RNA taklit (miR mimik) oligonükleotidler kullanarak ters transfeksiyon yoluyla olgun adipositlerdeki proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ters transfeksiyon protokolü, olgun adipositlerin eklenme hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak için transfeksiyon reaktifinin ve oligonükleotidlerin inkübasyonunu içerir. Adipozitlerin daha sonra oligonükleotidler/ transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden dikilmesine izin verilir. Protein veya mikro-RNA manipülasyonunun adiposit fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için transfected 3T3-L1 olgun adipositler üzerinde insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz çalışması gibi fonksiyonel analizler yapılabilir.

Giriş

Obezite, insülin direnci (IR), Tip 2 Diyabet (T2D) ve kardiyovasküler hastalıklar¹dahil olmak üzere çok sayıda metabolik hastalık için önemli bir risk faktörü olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler bu hastalıkların sürekli yükselen yaygınlığını durduramadı ve obez ve diyabetik hastaların IR'lerinin yönetimi önemli bir klinik konu olmaya devam ediyor. Yağ dokusu enerji homeostazının kontrolünde çok önemli bir rol oynar ve obezite sırasında patolojik genişlemesi IR ve T2D^2,3gelişimine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Birçok araştırma çalışması protein kodlayan RNA'ların adiposit fizyolojislerindeki rolünü ve obezite ile ilişkisini araştırmıştır.

Daha yakın zamanlarda, kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar), özellikle mikro RNA'ların (MIR'ler) keşfi, gen ekspresyon programlarının düzenleme mekanizmasıyla ilgili yeni kavramlar ortaya çıkarmıştır. Çalışmalar, ncRNA'ların adiposit fonksiyonunun önemli düzenleyicileri olduğunu ve düzensizliklerinin metabolik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını göstermiştir⁴. Bu nedenle, adipositlerdeki proteinlerin ve ncRNA'ların manipülasyonu, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve T2D gibi patolojiler üzerindeki etkilerini çözmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, in vivo proteinlerin ve ncRNA'ların yanı sıra birincil adipozitlerde ekspresyonunun manipüle edilmesi, in vitro adiposit modellerinin kullanımını destekleyen son derece zorlu olmaya devam etmektedir.

Murine 3T3-L1 fibroblastları, adiposit fonksiyonunu incelemek için kullanılan iyi karakterize edilmiş bir hücre hattı olan olgun, fonksiyonel ve insülin duyarlı adipositlere kolayca farklılaşır (örneğin, insülin sinyali, glikoz alımı, lipoliz ve adipokines salgısı)⁵,^6,7,8,9,10. Bu özellikler, 3T3-L1 adipositlerini, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerini çözmek için protein kodlama ve nc-RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için çekici bir model haline getirir. Ne yazık ki, 3T3-L1 fibroblastların ticari olarak mevcut reaktifler kullanılarak transfect'i kolayken, farklılaştırılmış 3T3-L1 adipositler transfect için en zor hücre çizgilerinden biridir. Bu nedenle 3T3-L1 hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle eden çok sayıda çalışma, adiposit fonksiyonu yerine adiposit farklılaşmasına odaklanmıştır.

Uzun bir süre boyunca, adipositleri transfect etmek için tek etkili teknik elektroporasyon⁵, sıkıcı, pahalı ve hücre hasarına neden olabilir. Bu makale, transfeksiyon için uygulamalı zamanı azaltan, hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan ve elektroporasyondan çok daha ucuz olan ortak bir transfeksiyon reaktifi kullanarak ters transfeksiyon tekniğini rapor eder. Bu protokol, siRNA ve mikro-RNA mimikleri (miR mimikleri) ve anti-miR'ler gibi diğer oligonükleotidlerin transfeksiyonu için mükemmel bir şekilde uygundur. Ters transfeksiyon protokolünün prensibi, transfeksiyon reaktifini ve oligonükleotidleri kuluçkaya yatırarak hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak ve daha sonra olgun adipositleri kuyulara tohumlamaktır. Daha sonra, adipositler oligonükleotidler / transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden yapışır. Bu basit, verimli ve ucuz metodoloji, protein kodlayan RNA'ların ve MIR'lerin adiposit fonksiyonundaki rolünün ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerinin incelenmesine izin vermektedir.

Protokol

NOT: Protokolün tüm adımlarını laminer akış hücresi kültür başlığında gerçekleştirmek için steril teknikler kullanın. Tüm reaktifler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'nu görün.

1. Murine 3T3-L1 fibroblastlarının adipositlere farklılaştırılması

1. 3T3-L1 fibroblastlarını kültür orta-DMEM'de 100 mm'lik yemeklerde piruvatsız, 25 mM glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve %1 penisilin ve streptomisinin yetiştirin (Şekil 1A). Bulaşıkları bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin (%7 CO₂ ve 37 °C).
2. Birleşmesinden iki gün sonra, kültür ortamını değiştirin, piruvatsız DMEM ile değiştirin, 25 mM glikoz, %10 fetal baldır serumu (FCS) ve %1 penisilin ve streptomisin 0.25 mM 3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX), 0.25 μM deksametason, 5 μg/mL insülin ve 10 μM rosiglitazone ile desteklenmiştir.
   NOT: Hücreler 100 mm çanak başına 300.000 hücrede tohumlandığında izdiah süresine ulaşmak 5 gün sürer.
3. İki gün sonra, kültür ortamını piruvatsız DMEM, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve 5 μg / mL insülin ve 10 μM rosiglitazon ile desteklenmiş% 1 penisilin ve streptomisin ile değiştirin ve 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Daha sonra, hücreleri her 2 günde bir DMEM ile piruvatsız, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisinin olmadan besleyin (Şekil 1B).
4. 3T3-L1 adipositlerini farklılaşma protokolünün başlangıcından 7-8 gün sonra transfect.
   NOT: Transfeksiyondan sonra kalan fibroblastların çoğalmasını önlemek için transfeksiyondan önce yüksek bir farklılaşma seviyesine (%>80) ulaşmak önemlidir, bu da sonuçları önyargılı hale getirecek karışık bir hücre popülasyonu sağlar.

2. Ön kaplamalı plakaların hazırlanması

1. Transfeksiyondan bir gün önce veya birkaç saat önce, 1 mg / mL'deki bir stok çözeltisinden% 30 etanolde 100 μg / mL'de bir kolajen tipi I çözeltisi hazırlayın. 12 kuyu plakasının kuyusu başına 250 μL ve 24 kuyu plakasının kuyusu başına 125 μL ekleyin ve çözeltiyi kuyunun yüzeyine yayın.
2. Kollajen kuruyana kadar plakayı kültür kaputunun altında kapaksız bırakın. Dulbecco'nun fosfat tamponlu saliniyle (D-PBS) iki kez yıkayın.
   NOT: Önceden kaplanmış plakalar satın alınabilir.

3. Transfeksiyon karışımının hazırlanması

NOT: SiRNA'nın son konsantrasyonu 1 ila 100 nM arasındadır (12 kuyu plakasının kuyusu başına 1 ila 100 pmol siRNA). MiR mimikinin son konsantrasyonu 10 nM'dir (10 pmol/well). Hedef dışı etkileri önlemek için deneye başlamadan önce her bir siRNA, miR mimik veya diğer oligonükleotidlerin en iyi konsantrasyonunu belirleyin. Sonuçların istatistiksel analizini kolaylaştırmak için üç taraflı transfeksiyon deneyleri yapın. Pipetleme sırasında normal kaybı hesaba katmak için tüm reaktifleri fazla olarak hazırlayın.

1. SiRNA'yı (veya diğer oligonükleotidleri) geliştirilmiş Minimal Essential Medium(Tablo 1)ile pipetleme (hacim/hacim) ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
2. Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş Minimal Esansiyel Ortamı siRNA'ya ekleyin ve karıştırmak için pipet ekleyin (Tablo 1). Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır (bu süre zarfında bölüm 4'e geçin). Kollajen kaplı plakanın her kuyusuna transfeksiyon karışımını ekleyin.

4. 3T3-L1 adipositlerin hazırlanması

1. 100 mm Petri kabındaki hücreleri D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5x tripsin ekleyin (100 mm çanak başına 1 mL), tüm yüzeyi tripsinle kapladiğinizden emin olun. 30 s bekleyin ve trypsin'i dikkatlice çıkarın.
2. Petri kabını inkübatörde 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri ayırmak için 100 mm'lik çanağa dokunun.
3. Tripini nötralize etmek için piruvatsız 10 ml DMEM, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisin ekleyin. Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı borun.
4. Bir Malassez sayım odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonu 6,25 x 10⁵ hücre /mL orta olarak ayarlayın. Transfeksiyon karışımını içeren 12 kuyulu bir plakanın (5 x 10⁵ hücre) hücre süspansiyonunun/kuyusunun 800 μL'si veya 24 kuyulu bir plakanın (2,5 x 10⁵ hücre) 400 μl'si.
   NOT: Bir adet 100 mm'lik Petri adipozit kabı, bir adet 12 kuyu plakasının veya bir adet 24 kuyu plakasının hazırlanmasına izin verecektir. 100 mm'lik bir tabak genellikle 12 kuyu plakasının kuyusu başına 5 x 10 5 adipositlere karşılık gelen^6-7 x 10⁶ adiposit içerir.
5. Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe (%7 CO₂ ve 37 °C) kuluçkaya yatırın ve hücreleri 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatantı piruvatsız taze DMEM, 25 mM glikoz,% 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisinin ile dikkatlice değiştirin.
   NOT: Hücreleri kollajen ön kaplamalı 48 ve 96 kuyu plakalarına tohumlamak da mümkündür, ancak adipositlerin kopmasını önlemek için ortamı değiştirirken daha fazla önlem alın.

5. Transfected 3T3-L1 adipositlerin fonksiyonel analizi

1. MRNA ve protein için siRNA veya miR mimik doğumundan sonra sırasıyla 24-48 saat ve 48-96 saat çalışma hedefi nakavt.
2. İnsülin sinyali, glikoz alımı, adipokin salgılama, lipoliz ve lipogenez incelemek için transfected adipositlerin fonksiyonel analizlerini gerçekleştirin.

Sonuçlar

3T3-L1 adipositlerdeki proteinlerin veya mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için burada açıklanan ters transfeksiyon prosedürünü kullanarak, adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir (Şekil 1B,C). Gerçekten de, transfeksiyondan 2 gün sonra, adipositler iyi yayılmış ve plakaya tutturulmuş ve olgun 3T3-L1 adipositlerin bir özelliği olan çok damarlı lipit damlacıkları sunulmu?...

Tartışmalar

Bu makale olgun adipositlerin farklılaşması ve transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sunun. Bu ters transfeksiyon yöntemi, siRNA'lar, mikro RNA mimikleri ve anti-mikro-RNA'lar gibi oligonükleotidleri transfect etmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntemin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol plazmid DNA ile transfeksiyon için verimli değildir, bu da fonksiyon kazancı çalışmaları için bu tekniğin yararını sınırlar. 3T3-L1 hücre h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL