Un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microARN en la función de los adipocitos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para administrar oligonucleótidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA), imitadores de microARN (miR) o anti-micro-ARN (anti-miR) en adipocitos maduros para modular la expresión de proteínas y microARN.

Resumen

La alteración de la función de los adipocitos contribuye a la patogénesis de enfermedades metabólicas como la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Modular la expresión de proteínas y micro-ARN en los adipocitos sigue siendo un gran desafío. Este artículo describe un protocolo para diferenciar los fibroblastos murinos en adipocitos maduros y para modular la expresión de proteínas y micro-ARN en adipocitos maduros a través de la transfección inversa utilizando oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeña (siRNA) y micro-ARN imitador (miR mimic). Este protocolo de transfección inversa implica la incubación del reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular al que se añaden los adipocitos maduros. Luego se permite que los adipocitos se vuelvan a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Se pueden realizar análisis funcionales como el estudio de la señalización de insulina, la captación de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis en los adipocitos maduros 3T3-L1 transfectados para estudiar el impacto de la manipulación de proteínas o microARN en la función de los adipocitos.

Introducción

La obesidad se considera un factor de riesgo importante para numerosas enfermedades metabólicas, incluida la resistencia a la insulina (RI), la diabetes tipo 2 (DT2) y las enfermedades cardiovasculares¹. Las terapias actuales no han logrado detener la prevalencia en constante aumento de estas enfermedades, y el manejo de la RI de pacientes obesos y diabéticos sigue siendo un problema clínico importante. El tejido adiposo juega un papel crucial en el control de la homeostasis energética, y su expansión patológica durante la obesidad contribuye al desarrollo de IR y DT2^2,3. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Muchos estudios de investigación han investigado el papel de los ARN codificantes de proteínas en la fisiología de los adipocitos y su asociación con la obesidad.

Más recientemente, el descubrimiento de los ARN no codificantes (NCRNAs), especialmente los micro-RNAs (miRs), ha forjado conceptos novedosos relacionados con el mecanismo de regulación de los programas de expresión génica. Los estudios han demostrado que los ncRNAs son importantes reguladores de la función de los adipocitos, y que su desregulación juega un papel importante en las enfermedades metabólicas⁴. Así, la manipulación de proteínas y ncRNAs en adipocitos es crucial para descifrar sus papeles en la función de los adipocitos y su impacto en patologías como la DT2. Sin embargo, la manipulación de la expresión de proteínas y ncRNAs in vivo, así como en adipocitos primarios sigue siendo un gran desafío, favoreciendo el uso de modelos de adipocitos in vitro.

Los fibroblastos murinos 3T3-L1 se diferencian fácilmente en adipocitos maduros, funcionales y sensibles a la insulina, que son una línea celular bien caracterizada utilizada para estudiar la función de los adipocitos (por ejemplo, señalización de insulina, captación de glucosa, lipólisis y secreción de adipoquinas)^5,6,7,8,9,10. Estas propiedades hacen de los adipocitos 3T3-L1 un modelo atractivo para modular la expresión de los arneses codificantes de proteínas y nc-ARN para descifrar su papel en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad. Desafortunadamente, mientras que los fibroblastos 3T3-L1 son fáciles de transfectar utilizando reactivos disponibles comercialmente, los adipocitos 3T3-L1 diferenciados son una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Esta es la razón por la que numerosos estudios que manipulan la expresión génica en células 3T3-L1 se han centrado en la diferenciación de adipocitos en lugar de en la función de los adipocitos.

Durante mucho tiempo, la única técnica eficiente para transfectar adipocitos fue la electroporación^5,que es tediosa, costosa y puede causar daño celular. Este artículo informa una técnica de transfección inversa que utiliza un reactivo de transfección común, que reduce el tiempo práctico para la transfección, no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular y es mucho menos costoso que la electroporación. Este protocolo es perfectamente adecuado para la transfección de siRNA y otros oligonucleótidos como imitadores de micro-ARN (imitadores de miR) y anti-miRs. El principio del protocolo de transfección inversa es incubar el reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular y luego sembrar los adipocitos maduros en los pozos. Luego, los adipocitos se vuelven a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Esta metodología simple, eficiente y económica permite estudiar el papel de los ARN y miR codificantes de proteínas en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad.

Protocolo

NOTA: Utilice técnicas estériles para realizar todos los pasos del protocolo en una campana de cultivo celular de flujo laminar. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos y equipos.

1. Diferenciación de fibroblastos murinos 3T3-L1 en adipocitos

1. Cultivar los fibroblastos 3T3-L1 en platos de 100 mm en cultivo medio-DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de suero de ternero recién nacido, y 1% de penicilina y estreptomicina (Figura 1A). Coloque los platos en una incubadora de cultivo de tejidos (7% CO₂ y 37 °C).
2. Dos días después de la confluencia, cambie el medio de cultivo, reemplazando con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de suero fetal de terneros (FCS) y 1% de penicilina y estreptomicina suplementados con 0.25 mM de 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.25 μM de dexametasona, 5 μg / ml de insulina y 10 μM de rosiglitazona.
   NOTA: Se necesitan 5 días para alcanzar la confluencia cuando las células se siembran a 300,000 células por plato de 100 mm.
3. Dos días después, reemplace el medio de cultivo con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina suplementada con 5 μg / ml de insulina y 10 μM de rosiglitazona e incube durante 2 días. Luego, alimente las células cada 2 días con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina(Figura 1B).
4. Transfectar los adipocitos 3T3-L1 7-8 días después del inicio del protocolo de diferenciación.
   NOTA: Es importante alcanzar un alto nivel de diferenciación (>80%) antes de la transfección para evitar la proliferación de los fibroblastos restantes después de la transfección, lo que llevaría a una población mixta de células que podría sesgar los resultados.

2. Preparación de placas preestutuadas

1. El día anterior o unas horas antes de la transfección, prepare una solución de colágeno tipo I a 100 μg/mL en etanol al 30% a partir de una solución stock a 1 mg/mL. Agregue 250 μL de colágeno por pozo de una placa de 12 pozos y 125 μL por pozo de una placa de 24 pozos, y extienda la solución sobre la superficie del pozo.
2. Deje la placa sin la tapa debajo de la campana de cultivo hasta que el colágeno se seque. Lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS).
   NOTA: Las placas preestuadas están disponibles para su compra.

3. Preparación de la mezcla de transfección

NOTA: La concentración final de siRNA está entre 1 y 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por pozo de una placa de 12 pozos). La concentración final del imitador miR es de 10 nM (10 pmol/pozo). Determine la mejor concentración de cada siRNA, imitación de miR u otro oligonucleótido antes de comenzar el experimento para evitar efectos fuera del objetivo. Realizar experimentos de transfección por triplicado para facilitar el análisis estadístico de los resultados. Prepare todos los reactivos en exceso para tener en cuenta la pérdida normal durante el pipeteo.

1. Mezclar mediante pipeteo (volumen/volumen) el siRNA (u otros oligonucleótidos) con el Medio Esencial Mínimo mejorado (Tabla 1). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Añadir el reactivo de transfección y el Medio Esencial Mínimo mejorado al siRNA, y pipet a la mezcla (Tabla 1). Incubar durante 20 min a temperatura ambiente (durante este tiempo, continúe con la sección 4). Agregue la mezcla de transfección a cada pozo de la placa recubierta de colágeno.

4. Preparación de los adipocitos 3T3-L1

1. Lave las celdas en la placa de Petri de 100 mm dos veces con D-PBS. Agregue 5x tripsina a las células (1 ml por plato de 100 mm), asegurándose de cubrir toda la superficie con la tripsina. Espere 30 s y retire cuidadosamente la tripsina.
2. Incubar la placa de Petri durante 5-10 min a 37 °C en la incubadora. Toque el plato de 100 mm para separar las celdas.
3. Añadir 10 ml de DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% FCS, y 1% de penicilina y estreptomicina para neutralizar la tripsina. Pipetee cuidadosamente el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular.
4. Cuente las células utilizando una cámara de conteo de Malassez o un contador de células automatizado, y ajuste la concentración de las células a 6.25 x 10⁵ celdas / ml de medio. Sembrar 800 μL de la suspensión celular/pozo de una placa de 12 pozos (5 x 10⁵ células) o 400 μl de la suspensión celular/pozo de una placa de 24 pozos (2,5 x 10⁵ células) que contiene la mezcla de transfección.
   NOTA: Una placa de Petri de 100 mm de adipocitos permitirá la preparación de una placa de 12 pozos o una placa de 24 pozos. Un plato de 100 mm generalmente contiene 6-7 x 10⁶ adipocitos, que corresponden a 5 x 10⁵ adipocitos por pozo de una placa de 12 pozos.
5. Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular (7% CO₂ y 37 °C), y no perturbar las células durante 24 h. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina.
   NOTA: También es posible sembrar las células en placas de 48 y 96 pozos precubiertas de colágeno, pero tome más precauciones al reemplazar los medios para evitar el desprendimiento de los adipocitos.

5. Análisis funcional de adipocitos 3T3-L1 transfectados

1. El objetivo del estudio es derribar 24-48 h y 48-96 h después de la administración de imitación de siRNA o miR para ARNm y proteína, respectivamente.
2. Realizar análisis funcionales de adipocitos transfectados para estudiar la señalización de insulina, la captación de glucosa, la secreción de adipoquinas, la lipólisis y la lipogénesis.

Resultados

Utilizando el procedimiento de transfección inversa descrito aquí para modular la expresión de proteínas o micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, se ha demostrado que los adipocitos preservan su morfología después de la transfección(Figura 1B,C). De hecho, 2 días después de la transfección, los adipocitos estaban bien diseminados y unidos a la placa y presentaban gotas lipídicas multiloculares que son una característica de los adipocitos...

Discusión

Este trabajo presenta un protocolo detallado para la diferenciación y transfección de adipocitos maduros. Este método de transfección inversa es un método simple, económico y altamente eficiente para transfectar oligonucleótidos como, entre otros, siRNAs, imitadores de micro-ARN y anti-micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, que es una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Este método tiene algunas limitaciones que deben considerarse. Este protocolo no es eficiente para la transfección con ADN plásmi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL