研究蛋白质和微RNA调制对脂肪细胞功能的影响的脂肪细胞培养模型

摘要

这里介绍的是一个协议，将小干扰RNA（siRNA）、微RNA模拟（miR）或抗微RNA（抗miR）等寡核苷酸输送到成熟的脂肪细胞中，以调节蛋白质和微RNA表达。

摘要

脂肪细胞功能的改变有助于代谢疾病的发病机制，包括2型糖尿病和胰岛素抵抗。这突出表明需要更好地了解脂肪细胞功能障碍所涉及的分子机制，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。调节脂肪细胞 中 蛋白质和微RNA的表达仍然极具挑战性。本文描述了一种将肉质成成熟脂肪细胞的方案，并利用小干扰RNA（siRNA）和微型RNA模拟（miR模仿）寡核苷酸，通过反向转化调节成熟脂肪细胞中蛋白质和微RNA的表达。此反向转化协议涉及转染试剂和寡核苷酸的孵化，以形成细胞培养板中的复合物，并添加成熟腺细胞。然后，在存在寡核苷酸/转染试剂复合物的情况下，允许脂肪细胞重新连接到粘附板表面。可对转染的3T3-L1成熟脂肪细胞进行胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂生成和脂质分析等功能分析，以研究蛋白质或微RNA操作对脂肪细胞功能的影响。

引言

肥胖被认为是许多代谢性疾病的主要危险因素，包括胰岛素抵抗（IR）、2型糖尿病（T2D）和心血管疾病^1。目前的治疗方法未能阻止这些疾病的发病率持续上升，肥胖和糖尿病患者的IR管理仍然是一个重要的临床问题。脂肪组织在控制能量平衡方面起着至关重要的作用，其在肥胖期间的病理扩张有助于红外和^T2D2、3的发展。这突出表明需要更好地了解脂肪细胞功能障碍所涉及的分子机制，以开发针对肥胖相关疾病的新疗法。许多研究已经调查了蛋白质编码RNA在脂肪细胞生理学中的作用及其与肥胖的关系。

最近，非编码RNA（ncRNA）的发现，特别是微RNA（miRs），已经锻造了与基因表达程序调控机制相关的新概念。研究表明，ncRNA是脂肪细胞功能的重要调节器，其调节不良在代谢疾病^中起着重要作用。因此，蛋白和ncRNA在脂肪细胞中的操纵对于破译它们在脂肪细胞功能中的作用及其对T2D等病理学的影响至关重要。然而，操纵蛋白质和ncRNA在体内和原发性脂肪细胞中的表达仍然极具挑战性，有利于使用体外脂肪细胞模型。

Murine 3T3-L1 成纤维细胞很容易分化成成熟、功能和胰岛素响应的脂肪细胞，这是用于研究脂肪细胞功能（如胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂解和脂肪素分泌^{）5、6、7、8、9、10}的具有良好特征的细胞系。这些特性使3T3-L1脂肪细胞成为调节蛋白质编码和nc-RNA表达的有吸引力的模型，以破译它们在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。不幸的是，虽然3T3-L1成纤维细胞很容易使用商用试剂进行转染，但差异化的3T3-L1脂肪细胞是最难转染的细胞系之一。这就是为什么许多操纵3T3-L1细胞基因表达的研究都集中在脂肪细胞分化上，而不是脂肪细胞功能上。

长期以来，唯一有效的转染脂肪细胞的技术是电聚变^5，这是乏味的，昂贵的，并可能导致细胞损伤。本文使用一种常见的转染试剂报告了反向转染技术，它减少了实际转染时间，对细胞生存能力没有影响，而且比电透电便宜得多。此协议非常适合硅酸和其他寡核苷酸（如微RNA模拟（miR模仿）和反微核素的转化。反向转化协议的原则是孵化转染试剂和寡核苷酸，在细胞培养板中形成复合物，然后将成熟的脂肪细胞播种到井中。然后，在寡核苷酸/转染试剂复合物的存在下，脂肪细胞重新连接到粘附板表面。这种简单、高效和廉价的方法允许研究蛋白质编码RNA和miR在脂肪细胞功能中的作用及其在肥胖相关疾病中的潜在作用。

研究方案

注:使用无菌技术在层压流动细胞培养罩中执行协议的所有步骤。有关所有试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 将穆林 3T3-L1 成纤维细胞分化为脂肪细胞

1. 在培养中DMEM的100毫米菜肴中种植3T3-L1成纤维细胞，不含丙酸酯、25mM葡萄糖、10%新生儿小腿血清和1%青霉素和链霉素（图1A）。将盘子放在组织培养孵化器（7% CO₂ 和 37 °C）。
2. 汇合两天后，改变培养基，代之以不含环状、25mM葡萄糖的DMEM， 10% 胎儿小腿血清 （FCS）， 和 1% 青霉素和链霉素补充 0.25 m 3 - 异丁基- 1 - 甲基三甲基苯丙胺 （IBMX）， 0.25 μM 德克萨梅松， 5 μg/mL 胰岛素， 和 10 μM 松糖酮.
   注:当细胞以每100毫米盘300，000个细胞播种时，需要5天时间才能达到汇流。
3. 两天后，用不含皮鲁瓦酸、25 mM 葡萄糖、10% FCS 和 1% 青霉素和链霉素的 DMEM 代替培养基，辅以 5 μg/mL 胰岛素和 10 μM 玫瑰糖酮，孵育 2 天。然后，每2天用DMEM喂养细胞，不含皮鲁瓦酸、25mM葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素（图1B）。
4. 在差异化协议开始后 7-8 天转染 3T3-L1 脂肪细胞。
   注:在转染前达到高水平的分化（>80%）很重要，以避免转染后剩余成纤维细胞的增殖，这将导致细胞群的混合，从而可能偏向结果。

2. 预涂板的制备

1. 在转染前一天或转染前几个小时，从 1 毫克/mL 的库存溶液中，以 100 μg/mL 的 30% 乙醇准备胶原蛋白 I 型溶液。每井加入 250 μL 胶原蛋白，每井加入 120 μL 的 24 井板，并将溶液铺在井面上。
2. 将盘子放在培养罩下没有盖子，直到胶原蛋白干燥。用杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐（D-PBS）洗两次。
   注:可购买预涂板。

3. 准备转染混合物

注:siRNA 的最终浓度在 1 到 100 nM 之间（每 12 井板井 1 到 100 pmol 的 siRNA）。miR 模仿的最终浓度为 10 nM（10 pmol/井）。在开始实验之前，确定每个硅核素、miR 模拟或其他寡核苷酸的最佳浓度，以避免偏离目标的影响。在三叶酸中执行转染实验，以方便对结果进行统计分析。准备所有过量的试剂，以说明管道过程中的正常损失。

1. 通过管道（体积/体积）混合siRNA（或其他寡核苷酸）与改进的最小基本介质（表1）。在室温下孵育5分钟。
2. 将转染试剂和改进的极小基本介质添加到 siRNA 中，然后用管道混合（表 1）。在室温下孵育20分钟（在此期间，继续到第4节）。将转染混合物添加到胶原蛋白涂层板的每个井中。

4. 3T3-L1 脂肪细胞的制备

1. 用 D-PBS 清洗 100 毫米培养皿中的细胞两次。将 5 倍试用素添加到细胞中（每 100 mm 盘 1 mL），确保用试丁香覆盖所有表面。等待 30s， 并小心地删除试金素。
2. 在孵化器中以 37 °C 孵育 5-10 分钟的培养皿。点击 100 mm 盘以分离细胞。
3. 加入10毫升不含皮鲁瓦酸的DMEM、25m葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素，以中和胰蛋白酶。小心地上下管道介质，以分离细胞和均质的细胞悬架。
4. 使用 Malassez 计数室或自动细胞计数器对细胞进行计数，并将细胞浓度调整为 6.25 x 10⁵ 细胞/mL 的介质。种子 800 μL 的细胞悬浮/井的 12 井板 （5 x 10⁵ 细胞） 或 400 μl 的细胞悬浮/井的 24 井板 （2.5 x 10⁵ 细胞） 包含转染组合.
   注:一个100毫米的培养皿的脂肪细胞将允许准备一个12井板或一个24井板。100 mm 盘通常包含 6-7 x 10⁶ 脂肪细胞，相当于每口 12 井板的 5 x^{10 5} 脂肪细胞。
5. 在细胞培养孵化器（7% CO₂ 和 37 °C）中孵育板，24 小时不干扰细胞。第二天，小心地用新鲜的DMEM代替超高分子，不含丙酸酯、25m葡萄糖、10%FCS和1%青霉素和链霉素。
   注意:也可以将细胞播种到胶原蛋白预涂的48井和96井板中，但在更换介质时采取更多的预防措施，以避免脂肪细胞分离。

5. 转染3T3-L1脂肪细胞的功能分析

1. 研究目标分别在siRNA或miR模仿mRNA和蛋白质的输送后，分别降低24-48小时和48-96小时。
2. 对经感染的脂肪细胞进行功能分析，研究胰岛素信号、葡萄糖吸收、脂肪素分泌、脂解和脂肪生成。

结果

使用此处描述的反向转化程序来调节 3T3-L1 脂肪细胞中蛋白质或微RNA 的表达，已证明这些脂肪细胞在转染后保留了其形态（图 1B，C）。事实上，在转染后2天，脂肪细胞传播良好，并附着在板上，并呈现了成熟3T3-L1脂肪细胞的特性多叶脂液滴。血脂含量在转染和未转染的脂肪细胞之间没有区别（图1D，E）。

讨论

本文对成熟脂肪细胞的分化和转染提出了详细的协议。这种反向转染方法是一种简单、经济、高效的方法，可将寡核苷酸（如但不限于siRNA、微RNA模仿和抗微RNA）转化为3T3-L1脂肪细胞，这是最难转染的细胞系之一。此方法有一些需要考虑的限制。此协议对于质粒DNA的转染效率不高，这限制了该技术对功能收益研究的效用。虽然包括3T3-L1细胞系在内的紫外细胞系通常用于研究体外脂肪细胞功能，但?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL