JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف مقايسة حيوية باستخدام 3- (4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl) -2,5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) لاختبار الأوكسيم الحلقية المركبة مسبقا.

Abstract

تم الإبلاغ مؤخرا عن الدورات الحلقية الحلقية في الأدبيات لتكون أدوية محتملة لعلاج السرطان. إن توليف أنظمة الحلقات المتعامدة الجديدة هذه يمثل تحديا. تم مؤخرا نشر منهجية فعالة لتجميع هذه المركبات وصفت تخليق المرحلة الصلبة في أربع خطوات بدلا من الخطوات الخمس المبلغ عنها سابقا. ميزة هذا التوليف الأقصر هي القضاء على استخدام الكواشف السامة. تم العثور على راتنج مايكل المتجدد منخفض التحميل (REM) القائم على الرابط ليكون حاسما في التوليف حيث منعت الإصدارات عالية التحميل إضافة الكواشف التي تحتوي على فينيل ضخم وسلاسل جانبية عطرية. تم استخدام مقايسة القياس اللوني 3- (4′,5′-ثنائي ميثيل ثيازول-2′-يل)-2,5- بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) لفحص السمية الخلوية لتركيزات الميكرومولار لهذه الجزيئات الحلقية الحلقية الجديدة في المختبر. MTT متاح بسهولة تجاريا وينتج نتائج سريعة وموثوقة نسبيا ، مما يجعل هذا الاختبار مثاليا لهذه الدورات الحلقية هذه. تم اختبار هياكل الحلقة المتعامدة وكذلك furfurylamine (مقدمة في طريقة التوليف تحتوي على شكل حلقة مماثل مكون من 5 أعضاء).

Introduction

من المعروف أن تثبيط الجزيئات الصغيرة لتفاعل E3 ubiquitin-ligase الماوس مزدوج الدقيقة 2 متماثل (MDM2) مع p53 لاستعادة الحث بوساطة p53 لموت الخلايا المبرمجللخلايا السرطانية 1،2،3. MDM2 هو منظم سلبي لمسار p53 وغالبا ما يتم التعبير عنه بشكل مفرط في الخلايا السرطانية4،5،6،7،8،9. كشفت الدراسات البلورية والكيميائية الحيوية الحديثة أن الجزيئات الصغيرة التي تحتوي على إطار حلزوني يمكن أن تمنع بشكل فعال تفاعلات MDM2-p5310. يعتبر الإطار الحلقية الحلقية (الشكل 1 ، مظلل باللون الأزرق) فكرة مميزة حيث أدى اشتقاق نظام الحلقة المتعامدة الصلب هذا إلى اكتشاف عقاقير علاجية جديدة. يشكل الوصول إلى هذه البنية المثيرة للاهتمام تحديا عند استخدام تقنيات التخليق العضوي التقليدية. على الرغم من أن التأثيرات العلاجية للجزيئات الحلقية الحلقية في الأنظمة البيولوجية قد تم التحقيق فيها ، إلا أن تخليق هذه الجزيئات لا يزال عملية مرهقة. غالبا ما تكون المنتجات الجانبية غير المرغوب فيها ، التي تستخدم ظروفا قاسية ، والمعادن الانتقالية الخطرة مشكلة.

أدى الاستخدام المحتمل للشكل الحلقية الحلقية في تطوير الأدوية إلى تطوير بروتوكول يستخدم تخليق الطور الصلب لإنشاء مكتبة من الجزيئات مع الشكل بالإضافة إلى مجموعات وظيفية أخرى قابلة للتبديل11,12. يمكن تحقيق فصل المنتجات والمواد المتفاعلة بين الخطوات ببساطة عن طريق استخدام رابط REM متصل بحبة راتنجية ووعاء ترشيح صلب الطور. هذا من شأنه أن يقلل من الخطوات وربما يزيد الغلة. يمكن أن ينتج هذا النهج الاصطناعي مجموعة كبيرة من الأدوية المرشحة المحتملة. ومع ذلك ، فإن فعالية هذه الجزيئات في النظام البيولوجي تتطلب مزيدا من التحقيق.

لتحديد السمية الخلوية لهذه المركبات الحلقية الحلقية ، تم استخدام اختبار MTT13,14. تقيس هذه الطريقة صلاحية الخلية ويمكن استخدامها لتحديد السمية الخلوية بشكل غير مباشر. تمت إضافة تركيزات مختلفة من المثبطات إلى الخلايا المستزرعة في صفيحة 96 بئرا ، وتم قياس نسبة الخلايا الحية عن طريق التحليل اللوني لمدى اختزال MTT الأصفر بواسطة نازعة هيدروجين الميتوكوندريا إلى مركب الفورمازان الأرجواني (الشكل 2). غالبا ما يتم الإبلاغ عن النشاط كقيمة IC 50 - التركيز الذي يتم عنده تثبيط نمو الخلايا بنسبة50٪ بالنسبة إلى عنصر تحكم غير معالج. تصف هذه الورقة بروتوكول مقايسة MTT والنتائج الأولية لهذه الجزيئات الحلقية الحلقية الجديدة.

Protocol

ملاحظة: العديد من المواد الكيميائية والكواشف البيولوجية المستخدمة في هذا البروتوكول سامة ومسرطنة. راجع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. استخدم التروس الواقية الشخصية المناسبة (نظارات السلامة المعتمدة من إدارة السلامة والصحة المهنية ، والقفازات المناسبة ، ومعاطف المختبر ، والسراويل كاملة الطول ، والأحذية المغلقة) قبل بدء التجربة. بالإضافة إلى ذلك ، اعتماد ممارسات السلامة المناسبة عند إجراء التوليف والتعامل مع المواد الكيميائية السامة والكواشف (غطاء الدخان).

1. تخليق الطور الصلب للدورات الحلقية غير المتجانسة 6 و 7

ملاحظة: استند التوليف إلى العملالمنشور سابقا 11,12. يكشف البروتوكول المحدث أنه لم تكن هناك حاجة إلى فتحة الحلقة المحفزة بفلوريد رباعي بوتيلامونيوم للدورة غير المتجانسة ثلاثية الحلقات ، وبالتالي فإن التخلص منها يقصر الإجراء الاصطناعي.

  1. قم بإجراء إضافة مايكل من فورفوريلامين إلى رابط حركة العين السريعة (المدة: 25 دقيقة إعداد + 24 ساعة وقت رد الفعل).
    1. أضف 1 جم (1 مكافئ [مكافئ]) من راتنج حركة العين السريعة ، و 20 مل (20 مكافئا) من ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) ، و 2.4 مل من فورفوريلامين إلى وعاء تفاعل الطور الصلب سعة 25 مل. حرك وعاء التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة بعد بدء التفاعل.
      ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل حتى لا يجلس الراتنج في قاع الوعاء.
    2. اغسل الراتنج باستخدام DMF 1x بعد اكتمال التفاعل. ثم اغسل 4x بالتناوب بين ثنائي كلورو الميثان (DCM) والميثانول. جفف الراتنج جيدا في وعاء التفاعل بعد الغسيل.
  2. قم بإجراء إضافة مايكل جنبا إلى جنب / إضافة حلقية ثنائية القطب 1،3 (المدة: 25 دقيقة إعداد + وقت رد فعل 48 ساعة).
    1. أضف إلى الراتنج الجاف 1.48 مل (5 مكافئ) من ثلاثي إيثيل أمين (TEA) ، و 0.637 جم (2 مكافئ) من نيترو أوليفين ، و 10 مل من التولوين الجاف إلى وعاء التفاعل.
    2. ثم أضف 1.085 مل (4 مكافئ) من كلوريد ثلاثي ميثيل سيليل (TMSCl) إلى وعاء التفاعل في غطاء دخان جيد التهوية.
      ملاحظة: نظرا لأن هذا التفاعل ينتج غاز حمض الهيدروكلوريك ، فلا تقم بتغطية وعاء التفاعل حتى يتم إطلاق الغاز تحت غطاء الدخان.
    3. قم بتغطية وعاء التفاعل بإحكام ، وقم بتحريكه في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل للراتنج مع الكواشف.
    4. استخدم 5 مل من الميثانول لإخماد التفاعل.
    5. قم بتصريف الوعاء لإزالة المحلول ، ثم اغسل 4x ، بالتناوب بين DCM والميثانول. جفف الراتنج جيدا في وعاء التفاعل بعد الغسيل.
  3. قم بإجراء N-alkylation للدورة غير المتجانسة المرتبطة بالراتنج لتشكيل الأمين الرباعي (المدة: 10 دقائق إعداد + وقت رد فعل 24 ساعة).
    1. إلى الراتنج الجاف في وعاء التفاعل ، أضف 5 مل من DMF و 10 مكافئ من هاليد الألكيل ، وحركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: تأكد من الخلط الشامل للكواشف مع الراتنج.
    2. اغسل الراتنج باستخدام DMF 1x بعد اكتمال التفاعل. ثم استخدم DCM والميثانول بالتناوب لغسل 4x. جفف الراتنج في وعاء التفاعل بعد الغسيل.
  4. قم بإجراء التخلص β من الأمين الرباعي للانشقاق من دعامة البوليمر (المدة: 15 دقيقة إعداد + وقت رد فعل 24 ساعة).
    1. إلى الراتنج الجاف في وعاء التفاعل ، أضف 3 مل من DCM و 1.49 مل (5 مكافئ) من TEA لشق الدورة غير المتجانسة من دعامة البوليمر.
    2. حرك خليط التفاعل لمدة 24 ساعة لضمان الخلط الشامل للراتنج مع المحلول. اغسل 4x ، بالتناوب بين DCM والميثانول. اجمع الشطف من جميع الغسلات ، وركز عن طريق التبخر الدوار.
    3. سحن مع الميثانول لتنقية أوكسيم الحلقة. جفف الراتنج جيدا في وعاء التفاعل بعد غسله لإعادة استخدامه في التجارب المستقبلية.

2. مقايسة السمية الخلوية باستخدام MTT 14

  1. تحضير 20 مل من محلول MTT 5 ملغ / مل باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ، 0.9٪ كلوريد الصوديوم في الماء) كمادة مخففة. قم بالترشيح والتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف 1: 1 لمحلول MTT من الخطوة 2.1 في وسط زراعة الخلايا الخالية من المصل (DMEM).
  2. قم بإعداد 1 مل لكل من محاليل المخزون في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل من 100 مللي متر و 10 مللي متر و 1 مللي متر و 100 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 1 ميكرومتر و 0.1 ميكرومتر و 0.01 ميكرومتر من مركبات الاختبار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تحضير 200 ميكرولتر لكل جرعة من محاليل العمل لمركبات الاختبار عن طريق تخفيف تركيزات المخزون 1: 1000 في وسط خال من المصل في أنابيب 1.5 مل.
  3. في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بزرع خلايا COS-7 (خلايا الكلى للقرد الأخضر الأفريقي ، Cercopithecus aethiops الكلى) في وسط كامل [DMEM مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS)] على ألواح مسطحة القاع والمعالجة بزراعة الأنسجة 96 بئرا بتركيز 4 × 103 خلايا / 200 ميكرولتر لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. تم اختيار خلايا COS-7 لأن (1) هذه الخلايا شائعة الاستخدام لفحوصات السمية الخلوية و (2) كانت متوفرة بالفعل في المؤسسة.
  4. احتضان خلايا COS-7 لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  5. قم بشفط المادة الطافية من الآبار باستخدام ماصة باستور زجاجية متصلة بمضخة تفريغ. جرعة الخلايا في ثلاث نسخ مع مركبات الاختبار باستخدام حلول العمل المعدة في الخطوة 2.2 (انظر الجدول 1). احتضان الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.4.
  6. نضح الطافية من الآبار. أضف 200 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات.
  7. استنشاق الطاف بلطف من الآبار دون إزعاج بلورات الفورمازان الأرجواني. أضف 200 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة بلورات الفورمازان الأرجواني. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  8. قم بقياس الامتصاص عند 590 نانومتر14 أو 600 نانومتر لكل بئر باستخدام قارئ لوحة 96 بئر. استخدم الآبار التي لا تحتوي على خلايا كخلفية وقم بحساب متوسط قيمة الامتصاص. اطرح متوسط قيمة خلفية الامتصاص من قيمة الامتصاص لكل بئر معالج. تطبيع البيانات كنسبة مئوية من متوسط قيمة الجرعة الصفرية (متوسط قيم الجرعة الصفرية الثلاثة). بيانات المؤامرة على المحور ص: خطي (٪ صلاحية الخلية النسبية) ؛ المحور السيني: سجل (تركيز). ارسم كل سلسلة كمنحنى فردي (على سبيل المثال ، يجب أن تحتوي البيانات الثلاثية على 3 منحنيات)

النتائج

تم تصنيع الأوكسيم الحلقية 6 و 7 باستخدام بروتوكول معدل (الشكل 1). إضافة مايكل فورفوريلامين إلى رابط REM 1b يمنح راتنج مرتبط بالبوليمر 2. تمت مراقبة تقدم التفاعل بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (IR) عن طريق الكشف عن اختفاء استر α،β غير المشبع عند 1722 سم -1 (...

Discussion

استند تخليق المركبات الحلقية الحلقية إلى الأبحاث السابقة التي أجراها هذا المختبر ، ولكن مع بعض التعديلات (الشكل 1)11,12. تمت مراقبة تقدم كل خطوة تفاعل بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء. إضافة مايكل لرابط REM 1 مع فورفور?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من مجلس أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى KSH (مكتب البحوث والمنح ، جامعة أزوسا باسيفيك - الولايات المتحدة الأمريكية). A.N.G. و J.F.M. حاصلان على زمالة الخبرة البحثية العلمية الجامعية (SURE). S.K.M. و B.M.R. حاصلان على منح زمالة أبحاث العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات (مركز البحوث في العلوم ، جامعة أزوسا باسيفيك - الولايات المتحدة الأمريكية). نحن ممتنون للدكتور ماثيو بيريزوك والدكتور فيليب كوكس للحصول على إرشادات حول المقايسات الحيوية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-BromooctaneSigma-Aldrich152951Alkyl-halide
AllylbromideSigma-Aldrich337528Alkyl-halide
BenzylbromideSigma-AldrichB17905Alkyl-halide
CisplatinCayman Chemical13119Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997Solvent
Dimethylformamide (DMF)Sigma-Aldrich227056Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich276855Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamineGenesee Scientific25-500Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)Sigma-AldrichF4135Cell culture media
FurfurylamineAcros Organics119800050reagent 
IodomethaneSigma-Aldrich289566Alkyl-halide
MethanolSigma-Aldrich34860Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)EMD MilliporeCalbiochem 475989-1GMReagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)Genesee Scientific25-507Cell culture media
REM ResinNova Biochem8551010005Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyreneSigma-AldrichN26806Nitro-olefin reagent
TolueneSigma-Aldrich244511Solvent
Triethylamine (TEA)Sigma-AldrichT0886Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)Sigma-Aldrich386529Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vesselChemglassCG-1861-02Glassware with filter
96 Well plate readerPromega (Turner Biosystems)9310-011Instrument
AVANCE III NMR SpectrometerBrukerN/AInstrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZAInstrument
Wrist-Action ShakerBurrell Scientific757950819Instrument

References

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
  2. Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
  3. Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
  4. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
  5. Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
  6. Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
  7. Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
  8. Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  9. Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
  10. Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
  11. Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).
  13. Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
  14. . MTT assay protocol Available from: https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol (2020)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 MTT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved