功能化螺环杂环合成和细胞毒性测定

摘要

在这里，我们描述了使用3-（4′，5′-二甲基噻唑-2′-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）的生物测定，以测试先前合成的螺环肟。

摘要

最近文献报道了螺环杂环是癌症治疗的潜在药物。这些新型正交环系统的合成具有挑战性。最近发表了一种合成这些化合物的有效方法，该方法描述了四步的固相合成，而不是先前报道的五个步骤。这种较短合成的优点是消除了有毒试剂的使用。发现低负载再生迈克尔（REM）接头基树脂在合成中至关重要，因为高负载版本阻止了添加含有大块苯基和芳香族侧链的试剂。比色3-（4′，5′-二甲基噻唑-2′-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定用于体外检查这些新型螺旋环分子微摩尔浓度的细胞毒性。MTT很容易在商业上获得，并产生相对快速，可靠的结果，使该测定成为这些螺环杂环的理想选择。测试了正交环结构以及糠胺（合成方法中的前体，包含类似的5元环基序）。

引言

已知小分子抑制E3泛素连接酶小鼠双分钟2同系物（MDM2）与p53的相互作用可恢复p53介导的诱导肿瘤细胞凋亡1，^2，3。MDM2是p53通路的负调节因子，通常在癌细胞⁴，⁵，⁶，^7，8^，9中过表达。最近的晶体学和生化研究表明，含有螺旋环骨架的小分子可以有效抑制MDM2-p53相互作用¹⁰。螺旋环框架（图1，蓝色阴影）被认为是一个特权基序，因为这种刚性正交环系统的衍生化导致了新型治疗药物的发现。使用传统的有机合成技术时，访问这种有趣的架构提出了挑战。尽管已经研究了螺旋环分子在生物系统中的治疗效果，但这些分子的合成仍然是一个繁琐的过程。不需要的副产品、使用恶劣的条件和危险的过渡金属通常是有问题的。

螺旋环基序在药物开发中的潜在用途导致开发一种方案，利用固相合成来生成具有该基序的分子库以及其他可互换的官能团^11，12。步骤之间产物和反应物的分离可以通过简单地使用连接到树脂珠和固相过滤容器的REM接头来实现。这将减少步骤并可能提高产量。这种合成方法可以产生大量潜在的候选药物。然而，这些分子在生物系统中的有效性需要进一步研究。

为了确定这些螺环化合物的细胞毒性，采用了MTT测定^13，14 。该方法测量细胞活力，可用于间接确定细胞毒性。将不同浓度的抑制剂添加到96孔板中的培养细胞中，并通过比色分析测量线粒体脱氢酶将黄色MTT还原为紫色甲臜化合物的程度的活细胞比例（图2）。该活性通常报告为IC₅₀ 值 - 相对于未处理的对照，细胞生长抑制50%的浓度。本文描述了MTT测定的方案以及这些新型螺环分子的初步结果。

研究方案

注意:本协议中使用的几种化学品和生物试剂具有毒性和致癌性。使用前，请查阅相关材料安全数据表 （MSDS）。在开始实验之前，使用适当的个人防护装备（职业安全与健康管理局批准的护目镜，适当的手套，实验室外套，全长裤和露趾鞋）。此外，在进行合成和处理有毒化学品和试剂（通风橱）时，应采取适当的安全措施。

1. 螺环杂环6和7的固相合成

注:综合基于先前发表的工作^11，12。更新后的协议表明，不需要四丁基氟化铵催化的三环杂环开环，因此其消除缩短了合成过程。

1. 向REM接头中加入糠胺（持续时间:25分钟设置+ 24小时反应时间）。
   1. 向 25 mL 固相反应容器中加入 1 g（1 当量 [当量]）REM 树脂、20 mL（20 当量）二甲基甲酰胺 （DMF） 和 2.4 mL 糠胺。反应引发后在室温下搅拌反应容器24小时。
      注意:确保充分混合，使树脂不会位于容器底部。
   2. 反应完成后用DMF 1x洗涤树脂。然后，洗涤4倍，在二氯甲烷（DCM）和甲醇之间交替。洗涤后在反应容器中彻底干燥树脂。
2. 进行串联迈克尔加成/1，3-偶极环加成（持续时间:25分钟设置+ 48小时反应时间）。
   1. 向干燥树脂中加入 1.48 mL（5 当量）三乙胺 （TEA）、0.637 g（2 当量）硝基烯烃和 10 mL 干甲苯。
   2. 然后，将 1.085 mL（4 当量）三甲基氯硅烷 （TMSCl） 加入通风良好的通风橱中的反应容器中。
      注意: 由于该反应会产生HCl气体，因此在气体释放到通风橱下之前，请勿盖上反应容器的盖子。
   3. 盖紧反应容器，并在室温下搅拌48小时。
      注意:确保树脂与试剂彻底混合。
   4. 使用 5 mL 甲醇淬灭反应。
   5. 排干容器以除去溶液，然后在DCM和甲醇之间交替洗涤4次。洗涤后在反应容器中彻底干燥树脂。
3. 对树脂结合的杂环进行 N-烷基化以形成季胺（持续时间:10分钟设置+ 24小时反应时间）。
   1. 向反应容器中的干燥树脂中，加入5mL DMF和10等量的烷基卤化物，并在室温下搅拌24小时。
      注意:确保试剂与树脂彻底混合。
   2. 反应完成后用DMF 1x洗涤树脂。然后，交替使用DCM和甲醇洗涤4倍。洗涤后在反应容器中干燥树脂。
4. 对季胺进行β消除，以从聚合物载体上裂解（持续时间:15分钟设置+ 24小时反应时间）。
   1. 向反应容器中的干树脂中，加入 3 mL DCM 和 1.49 mL（5 当量）TEA 以将杂环从聚合物载体上裂解。
   2. 将反应混合物搅拌24小时，以确保树脂与溶液充分混合。洗涤4倍，在DCM和甲醇之间交替。收集所有洗涤液的洗脱液，并通过旋转蒸发浓缩。
   3. 用甲醇氚化以纯化螺环肟。洗涤后在反应容器中彻底干燥树脂，以便在将来的实验中重复使用。

2. 使用 MTT ¹⁴ 进行细胞毒性测定

1. 使用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.9% NaCl 水溶液）作为稀释剂制备 20 mL 的 5 mg/mL MTT 溶液。过滤并储存在-20°C。 然后，在无血清细胞培养基（DMEM）中制备步骤2.1中的MTT溶液的1:1稀释度。
2. 在 1.5 mL 微量离心管中制备 1 mL 的储备溶液，分别在 100 mM、10 mM、10 μM、10 μM、1 μM 和 0.01 μM 的二甲基亚砜 （DMSO） 测试化合物中制备 1 mL 储备溶液。储存在-20°C。 通过在 1.5 mL 管中的无血清培养基中以 1:1000 稀释原液浓度，每剂量制备 200 μL 测试化合物的工作溶液。
3. 在组织培养罩中，使用多通道移液器将COS-7细胞（非洲绿猴肾细胞，尾 尾 蝇肾）在完全培养基[含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM]中接种到平底，组织培养处理的96孔板上，浓度为4×10³ 细胞/ 200μL/200μL。选择COS-7细胞是因为（1）这些是细胞毒性测定的常用细胞，（2）这些细胞已经在机构中可用。
4. 将COS-7细胞在含有5%CO₂的气氛中于37°C孵育24小时。
5. 使用连接到真空泵的玻璃巴斯德移液管从孔中吸出上清液。使用步骤2.2中制备的工作溶液将细胞与测试化合物一式三份加样（见表1）。按照步骤2.4中所述孵育细胞。
6. 从孔中吸出上清液。向每个孔中加入 200 μL MTT 溶液。在含有5%CO₂ 的气氛中于37°C孵育4小时。
7. 轻轻地从孔中吸出上清液，而不会干扰紫色甲臜晶体。向每个孔中加入 200 μL DMSO 以溶解紫色甲臜晶体。在室温下孵育15分钟。
8. 使用96孔板读数器测量每个孔的590nm¹⁴ 或600nm处的吸光度。使用没有细胞的孔作为背景并平均吸光度值。从每个处理孔的吸光度值中减去平均吸光度背景值。将数据标准化为平均零剂量值的百分比（平均三个零剂量值）。在y轴上绘制数据:线性（%相对细胞活力）;x 轴:对数（浓度）。将每个序列绘制为单独的曲线（例如，一式三份数据应有 3 条曲线）

结果

使用改良方案合成螺环肟6和7（图1）。迈克尔将糠胺添加到REM接头1b中得到聚合物结合树脂2。通过红外（IR）光谱通过检测1722cm-1处α，β-不饱和酯的消失来监测反应的进展（图3）。螺环结合树脂4由2通过瞬态中间体3形成。甲醇水解4得到3-[（3E）-（2S，4R）-2-苯基-3-羟基亚氨基4-羟甲基吡咯烷-1-基]-丙酸甲酯7，同时烷基化后β?...

讨论

螺环化合物的合成基于该实验室先前进行的研究，但进行了一些修改（图1）^11，12。通过红外光谱监测每个反应步骤的进度。迈克尔将REM接头1与糠胺一起加入得到聚合物结合的2（IR 1722 cm-1 → 1731 ^cm-1）。从上一份报告中，ISOC of 2产生了三环杂环化合物<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane	Sigma-Aldrich	152951	Alkyl-halide
Allylbromide	Sigma-Aldrich	337528	Alkyl-halide
Benzylbromide	Sigma-Aldrich	B17905	Alkyl-halide
Cisplatin	Cayman Chemical	13119	Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Solvent
Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine	Genesee Scientific	25-500	Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)	Sigma-Aldrich	F4135	Cell culture media
Furfurylamine	Acros Organics	119800050	reagent
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566	Alkyl-halide
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Genesee Scientific	25-507	Cell culture media
REM Resin	Nova Biochem	8551010005	Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene	Sigma-Aldrich	N26806	Nitro-olefin reagent
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvent
Triethylamine (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)	Sigma-Aldrich	386529	Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel	Chemglass	CG-1861-02	Glassware with filter
96 Well plate reader	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer	Bruker	N/A	Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	Instrument
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific	757950819	Instrument