Synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité

Résumé

Ici, nous décrivons un essai biologique utilisant le bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour tester les oximes spirocycliques précédemment synthétisés.

Résumé

Les hétérocycles spirocycliques ont récemment été rapportés dans la littérature comme étant des médicaments potentiels pour le traitement du cancer. La synthèse de ces nouveaux systèmes d’anneaux orthogonaux est difficile. Une méthodologie efficace pour synthétiser ces composés a récemment été publiée qui décrit la synthèse en phase solide en quatre étapes au lieu des cinq étapes précédemment rapportées. L’avantage de cette synthèse plus courte est l’élimination de l’utilisation de réactifs toxiques. La résine à base de linker Regenerating Michael (REM) à faible charge s’est avérée cruciale dans la synthèse, car les versions à charge élevée empêchaient l’ajout de réactifs contenant du phényle volumineux et des chaînes latérales aromatiques. Le test colorimétrique de bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été utilisé pour examiner la cytotoxicité des concentrations micromolaires de ces nouvelles molécules spirocycliques in vitro. Le MTT est facilement disponible dans le commerce et produit des résultats relativement rapides et fiables, ce qui rend ce test idéal pour ces hétérocycles spirocycliques. Les structures des anneaux orthogonaux ainsi que la furfurylamine (un précurseur de la méthode de synthèse contenant un motif cyclique similaire à 5 membres) ont été testées.

Introduction

L’inhibition à petite molécule de l’interaction de l’homologue E3 ubiquitine-ligase souris double minute 2 (MDM2) avec p53 est connue pour restaurer l’induction médiée par p53 de l’apoptose^des cellules tumorales ^1,2,3. MDM2 est un régulateur négatif de la voie p53 et est souvent surexprimé dans les cellules cancéreuses 4,5,6,7,8,9. Des études cristallographiques et biochimiques récentes ont révélé que de petites molécules contenant un cadre spirocyclique peuvent inhiber efficacement les interactions MDM2-p53¹⁰. Le cadre spirocyclique (Figure 1, ombré en bleu) est considéré comme un motif privilégié car la dérivatisation de ce système d’anneaux orthogonaux rigides a conduit à la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques. L’accès à cette architecture intéressante pose un défi lors de l’utilisation des techniques traditionnelles de synthèse organique. Bien que les effets thérapeutiques des molécules spirocycliques dans les systèmes biologiques aient été étudiés, la synthèse de ces molécules est encore un processus lourd. Les produits secondaires indésirables, l’utilisation de conditions difficiles et les métaux de transition dangereux sont souvent problématiques.

L’utilisation potentielle du motif spirocyclique dans le développement de médicaments a conduit au développement d’un protocole utilisant la synthèse en phase solide pour générer une bibliothèque de molécules avec le motif en plus d’autres groupes fonctionnels interchangeables^11,12. La séparation des produits et des réactifs entre les étapes pourrait être réalisée en utilisant simplement un agent de liaison REM fixé à une bille de résine et à un récipient filtrant en phase solide. Cela réduirait les étapes et augmenterait potentiellement les rendements. Cette approche synthétique pourrait produire un large éventail de candidats médicaments potentiels. Cependant, l’efficacité de ces molécules dans un système biologique nécessiterait des recherches plus approfondies.

Pour déterminer la cytotoxicité de ces composés spirocycliques, le test MTT^13,14 a été utilisé. Cette méthode mesure la viabilité cellulaire et peut être utilisée pour déterminer indirectement la cytotoxicité cellulaire. Différentes concentrations d’inhibiteurs ont été ajoutées à des cellules cultivées dans une plaque de 96 puits, et la proportion de cellules vivantes a été mesurée par analyse colorimétrique de l’étendue de la réduction du MTT jaune par les déshydrogénases mitochondriales en composé formazan pourpre (Figure 2). L’activité est le plus souvent rapportée comme une valeur IC 50 - la concentration à laquelle la croissance cellulaire est inhibée de₅₀% par rapport à un témoin non traité. Cet article décrit le protocole du test MTT et les résultats préliminaires de ces nouvelles molécules spirocycliques.

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Protocole

NOTE: Plusieurs produits chimiques et réactifs biologiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et cancérogènes. Consultez les fiches signalétiques (FS) pertinentes avant de les utiliser. Utilisez des équipements de protection individuelle appropriés (lunettes de sécurité approuvées par l’Occupational Safety and Health Administration, gants appropriés, blouses de laboratoire, pantalons longs et chaussures fermées) avant de commencer l’expérience. En outre, adopter des pratiques de sécurité appropriées lors de la synthèse et de la manipulation de produits chimiques toxiques et de réactifs (hotte).

1. Synthèse en phase solide des hétérocycles spirocycliques 6 et 7

NOTE: La synthèse était basée sur des travaux publiés précédemment^11,12. Le protocole mis à jour révèle que l’ouverture cyclique catalysée par le fluorure de tétrabutylammonium de l’hétérocycle tricyclique n’était pas nécessaire, et donc son élimination raccourcit la procédure synthétique.

1. Effectuer l’ajout de furfurylamine à Michael au linker REM (durée: 25 min de configuration + 24 h de temps de réaction).
   1. Ajouter 1 g (1 équivalent [équiv.]) de résine REM, 20 mL (20 équivalents) de diméthylformamide (DMF) et 2,4 mL de furfurylamine dans une cuve de réaction en phase solide de 25 mL. Agiter la cuve de réaction à température ambiante pendant 24 heures après le début de la réaction.
      REMARQUE: Assurez-vous d’un mélange complet afin que la résine ne reste pas au fond du récipient.
   2. Lavez la résine avec DMF 1x une fois la réaction terminée. Ensuite, laver 4x, en alternant entre le dichlorométhane (DCM) et le méthanol. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages.
2. Effectuer l’addition Michael en tandem/cycloaddition 1,3-dipolaire (durée : 25 min de configuration + 48 h de temps de réaction).
   1. À la résine sèche, ajouter 1,48 mL (5 équivalents) de triéthylamine (TEA), 0,637 g (2 équivalents) de nitro-oléfine et 10 mL de toluène sec dans la cuve de réaction.
   2. Ensuite, ajouter 1,085 mL (4 équivalents) de chlorure de triméthylsilyle (TMSCl) dans la cuve de réaction dans une hotte bien ventilée.
      NOTE: Comme cette réaction produit du gaz HCl, ne pas boucher le récipient de réaction tant que le gaz n’a pas été libéré sous une hotte.
   3. Boucher solidement la cuve de réaction et agiter à température ambiante pendant 48 h.
      REMARQUE: Assurez-vous de bien mélanger la résine avec les réactifs.
   4. Utilisez 5 mL de méthanol pour éteindre la réaction.
   5. Vidangez le récipient pour éliminer la solution, puis lavez 4x, en alternant entre DCM et méthanol. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages.
3. Effectuer la N-alkylation de l’hétérocycle lié à la résine pour former l’amine quaternaire (durée : 10 min de configuration + 24 h de temps de réaction).
   1. Ajouter à la résine sèche dans la cuve de réaction 5 mL de DMF et 10 équivalents d’halogénure d’alkyle, et agiter à température ambiante pendant 24 h.
      REMARQUE: Assurez-vous de bien mélanger les réactifs avec la résine.
   2. Lavez la résine avec DMF 1x une fois la réaction terminée. Ensuite, utilisez du DCM et du méthanol en alternance pour laver 4x. Sécher la résine dans le récipient de réaction après les lavages.
4. Effectuer β-élimination de l’amine quaternaire pour le clivage du support polymère (durée: 15 min de configuration + 24 h de temps de réaction).
   1. À la résine sèche dans la cuve de réaction, ajouter 3 mL de DCM et 1,49 mL (5 équivalents) de TEA pour cliver l’hétérocycle du support polymère.
   2. Agiter le mélange réactionnel pendant 24 h pour assurer un mélange complet de la résine avec la solution. Lavez 4x, en alternant entre DCM et méthanol. Recueillir l’élution de tous les lavages et concentrer par évaporation rotative.
   3. Triturer avec du méthanol pour purifier l’oxime spirocyclique. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages pour la réutiliser dans de futures expériences.

2. Essai de cytotoxicité à l’aide de MTT ¹⁴

1. Préparer 20 mL d’une solution de MTT à 5 mg/mL en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS, NaCl à 0,9 % dans l’eau) comme diluant. Filtrer et conserver à -20 °C. Ensuite, préparer une dilution 1:1 de la solution de MTT à partir de l’étape 2.1 dans un milieu de culture cellulaire sans sérum (DMEM).
2. Préparer 1 mL de solutions mères dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM et 0,01 μM de composés à essai dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver à -20 °C. Préparer 200 μL par dose des solutions de travail des composés d’essai en diluant les concentrations mères 1:1000 dans un milieu sans sérum dans des tubes de 1,5 mL.
3. Dans le capot de culture tissulaire, ensemencer des cellules COS-7 (cellules rénales de singe vert africain, rein de Cercopithecus aethiops ) dans un milieu complet [DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS)] sur des plaques à fond plat traitées par culture tissulaire à 96 puits à une concentration de 4 × 10³ cellules/200 μL par puits à l’aide d’un pipeteur multicanaux. Les cellules COS-7 ont été choisies parce que (1) ce sont des cellules couramment utilisées pour les tests de cytotoxicité et (2) elles étaient déjà disponibles dans l’établissement.
4. Incuber les cellules COS-7 pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO₂.
5. Aspirer le surnageant des puits à l’aide d’une pipette Pasteur en verre fixée à une pompe à vide. Doser les cellules en trois exemplaires avec les composés d’essai à l’aide des solutions de travail préparées à l’étape 2.2 (voir tableau 1). Incuber les cellules comme décrit à l’étape 2.4.
6. Aspirer le surnageant des puits. Ajouter 200 μL de solution de MTT à chaque puits. Incuber à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de_CO2 pendant 4 h.
7. Aspirez doucement le surnageant des puits sans déranger les cristaux de formazan pourpre. Ajouter 200 μL de DMSO à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan violet. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
8. Mesurer l’absorbance à 590 nm¹⁴ ou 600 nm pour chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques de 96 puits. Utilisez des puits sans cellules comme fond et faites la moyenne de la valeur d’absorbance. Soustrayez la valeur de fond moyenne de l’absorbance de la valeur d’absorbance de chaque puits traité. Normaliser les données en pourcentage de la valeur posologique nulle moyenne (moyenne des trois valeurs de dose nulle). Tracer les données sur l’axe des y: linéaire (% de viabilité cellulaire relative); axe des abscisses : log (concentration). Tracer chaque série comme une courbe individuelle (p. ex., les données triplées devraient avoir 3 courbes)

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Résultats

Les oximes spirocycliques 6 et 7 ont été synthétisées à l’aide d’un protocole modifié (Figure 1). L’ajout Michael de furfurylamine à un agent de liaison REM 1b a permis d’obtenir une résine liée au polymère 2. La progression de la réaction a été surveillée par spectroscopie infrarouge (IR) en détectant la disparition de l’ester α,β-insaturé à 1722 ^cm-1 (Figure 3). La résine spirocyclique 4 a été formée à partir de 2 v...

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Discussion

La synthèse des composés spirocycliques était basée sur des recherches antérieures menées par ce laboratoire, mais avec quelques modifications (Figure 1)^11,12. La progression de chaque étape de réaction a été surveillée par spectroscopie IR. L’ajout Michael du linker REM 1 avec furfurylamine a permis d’obtenir une liaison polymère 2 (IR 1722 cm-1 → 1...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane	Sigma-Aldrich	152951	Alkyl-halide
Allylbromide	Sigma-Aldrich	337528	Alkyl-halide
Benzylbromide	Sigma-Aldrich	B17905	Alkyl-halide
Cisplatin	Cayman Chemical	13119	Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Solvent
Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine	Genesee Scientific	25-500	Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)	Sigma-Aldrich	F4135	Cell culture media
Furfurylamine	Acros Organics	119800050	reagent
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566	Alkyl-halide
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Genesee Scientific	25-507	Cell culture media
REM Resin	Nova Biochem	8551010005	Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene	Sigma-Aldrich	N26806	Nitro-olefin reagent
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvent
Triethylamine (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)	Sigma-Aldrich	386529	Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel	Chemglass	CG-1861-02	Glassware with filter
96 Well plate reader	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer	Bruker	N/A	Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	Instrument
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific	757950819	Instrument