Síntese Espirocíclica Funcionalizada de Heterociclos e Ensaio de Citotoxicidade

Resumo

Aqui, descrevemos um bioensaio usando brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para testar oximas espirocíclicos previamente sintetizados.

Resumo

Heterociclos espirocíclicos têm sido recentemente relatados na literatura como potenciais drogas para a terapia do câncer. A síntese desses novos sistemas de anéis ortogonais é um desafio. Uma metodologia eficiente para sintetizar esses compostos foi publicada recentemente que descreveu a síntese em fase sólida em quatro etapas, em vez das cinco etapas relatadas anteriormente. A vantagem desta síntese mais curta é a eliminação do uso de reagentes tóxicos. A resina à base de ligador Regenerating Michael (REM) de baixa carga foi considerada crucial na síntese, pois as versões de alta carga impediram a adição de reagentes contendo fenil volumoso e cadeias laterais aromáticas. O ensaio colorimétrico de brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi utilizado para examinar a citotoxicidade das concentrações micromolares destas novas moléculas espirocíclicas in vitro. O MTT está prontamente disponível comercialmente e produz resultados relativamente rápidos e confiáveis, tornando este ensaio ideal para esses heterociclos espirocíclicos. Estruturas de anéis ortogonais, bem como furfurilamina (um precursor no método de síntese contendo um motivo de anel semelhante de 5 membros) foram testados.

Introdução

Sabe-se que a inibição de moléculas pequenas da interação do camundongo E3 ubiquitina-ligase duplo minuto 2 (MDM2) com p53 restaura a indução mediada pela p53 da apoptose de células tumorais ^1,2,3. O MDM2 é um regulador negativo da via p53 e é frequentemente superexpresso em células cancerígenas 4,5,6,7,8,9. Estudos cristalográficos e bioquímicos recentes revelaram que pequenas moléculas contendo uma estrutura espirocíclica podem efetivamente inibir as interações MDM2-p53¹⁰. A estrutura espirocíclica (Figura 1, sombreada em azul) é considerada um motivo privilegiado, pois a derivatização desse sistema rígido de anéis ortogonais levou à descoberta de novas drogas terapêuticas. Acessar essa arquitetura interessante representa um desafio ao usar técnicas tradicionais de síntese orgânica. Embora os efeitos terapêuticos de moléculas espirocíclicas em sistemas biológicos tenham sido investigados, a síntese dessas moléculas ainda é um processo complicado. Produtos secundários indesejados, usando condições adversas e metais de transição perigosos são muitas vezes problemáticos.

O potencial uso do motivo espirocíclico no desenvolvimento de fármacos levou ao desenvolvimento de um protocolo utilizando síntese em fase sólida para gerar uma biblioteca de moléculas com o motivo, além de outros grupos funcionais intercambiáveis^11,12. A separação de produtos e reagentes entre as etapas pode ser alcançada simplesmente utilizando um ligador REM ligado a um grânulo de resina e um recipiente de filtro de fase sólida. Isso reduziria as etapas e potencialmente aumentaria os rendimentos. Essa abordagem sintética poderia produzir uma grande variedade de potenciais candidatos a medicamentos. No entanto, a eficácia dessas moléculas em um sistema biológico exigiria uma investigação mais aprofundada.

Para determinar a citotoxicidade desses compostos espirocíclicos, foi empregado o ensaio MTT^13,14. Este método mede a viabilidade celular e pode ser usado para determinar indiretamente a citotoxicidade celular. Diferentes concentrações dos inibidores foram adicionadas às células cultivadas em uma placa de 96 poços, e a proporção de células vivas foi medida pela análise colorimétrica da extensão da redução do MTT amarelo pelas desidrogenases mitocondriais ao composto formazano roxo (Figura 2). A atividade é mais frequentemente relatada como um valor de CI 50 - a concentração na qual o crescimento celular é inibido em₅₀% em relação a um controle não tratado. Este trabalho descreve o protocolo para o ensaio de MTT e os resultados preliminares dessas novas moléculas espirocíclicas.

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Protocolo

NOTA: Vários produtos químicos e reagentes biológicos utilizados neste protocolo são tóxicos e cancerígenos. Consulte as fichas de dados de segurança do material (FISPQ) relevantes antes de utilizar. Use equipamentos de proteção individual apropriados (óculos de segurança aprovados pela Administração de Segurança e Saúde Ocupacional, luvas adequadas, jalecos, calças de corpo inteiro e sapatos fechados) antes de iniciar o experimento. Além disso, adote práticas de segurança apropriadas ao realizar a síntese e manusear produtos químicos e reagentes tóxicos (exaustor).

1. Síntese em fase sólida dos heterociclos espirocíclicos 6 e 7

NOTA: A síntese foi baseada em trabalhos publicados anteriormente^11,12. O protocolo atualizado revela que a abertura do anel catalisado por fluoreto de tetrabutilamônio do heterociclo tricíclico não foi necessária e, portanto, sua eliminação encurta o procedimento sintético.

1. Realizar a adição de furfurilamina Michael ao ligador REM (duração: 25 min de configuração + 24 h de tempo de reação).
   1. Adicionar 1 g (1 equivalente [equiv.]) de resina REM, 20 mL (20 equiv.) de dimetilformamida (DMF) e 2,4 mL de furfurilamina a um vaso de reação de fase sólida de 25 mL. Agitar o recipiente de reacção à temperatura ambiente durante 24 h após o início da reacção.
      NOTA: Certifique-se de uma mistura completa para que a resina não fique no fundo do recipiente.
   2. Lave a resina com DMF 1x após a reação estar completa. Em seguida, lave 4x, alternando entre diclorometano (DCM) e metanol. Seque bem a resina no recipiente de reação após lavagens.
2. Realizar adição de Michael em tandem/cicloadição de 1,3 dipolar (duração: 25 min de configuração + 48 h de tempo de reação).
   1. À resina seca, adicione 1,48 mL (5 equiv.) de trietilamina (TEA), 0,637 g (2 equiv.) de nitro-olefina e 10 mL de tolueno seco ao vaso de reação.
   2. Em seguida, adicione 1,085 mL (4 equiv.) de cloreto de trimetilsilila (TMSCl) ao vaso de reação em um exaustor bem ventilado.
      NOTA: Como esta reação produz gás HCl, não tampar o recipiente de reação até que o gás tenha sido liberado sob um exaustor.
   3. Tampar com segurança o recipiente de reação e agitar à temperatura ambiente por 48 h.
      NOTA: Assegure a mistura completa da resina com os reagentes.
   4. Use 5 mL de metanol para apagar a reação.
   5. Escorra o recipiente para remover a solução e, em seguida, lave 4x, alternando entre DCM e metanol. Seque bem a resina no recipiente de reação após lavagens.
3. Realizar N-alquilação do heterociclo ligado à resina para formar a amina quaternária (duração: 10 min de setup + 24 h de tempo de reação).
   1. À resina seca no vaso de reação, adicione 5 mL de DMF e 10 equivalentes de haleto de alquila e agite à temperatura ambiente por 24 h.
      NOTA: Assegure a mistura completa dos reagentes com a resina.
   2. Lave a resina com DMF 1x após a reação estar completa. Em seguida, use DCM e metanol alternadamente para lavar 4x. Secar a resina no recipiente de reação após lavagens.
4. Realizar β-eliminação da amina quaternária para clivagem a partir do suporte polimérico (duração: 15 min de setup + 24 h de tempo de reação).
   1. À resina seca no vaso de reação, adicione 3 mL de DCM e 1,49 mL (5 equiv.) de TEA para clivar o heterociclo do suporte polimérico.
   2. Agite a mistura de reação por 24 h para garantir a mistura completa da resina com a solução. Lavar 4x, alternando entre DCM e metanol. Recolha a eluição de todas as lavagens e concentre-se através de evaporação rotatória.
   3. Triturato com metanol para purificar o oxima espirocíclico. Secar bem a resina no recipiente de reação após lavagens para reutilização em experimentos futuros.

2. Ensaio de citotoxicidade utilizando MTT ¹⁴

1. Preparar 20 ml de uma solução de MTT a 5 mg/ml utilizando solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS, NaCl a 0,9% em água) como diluente. Filtrar e conservar a -20 °C. Em seguida, prepare uma diluição 1:1 da solução de MTT a partir da etapa 2.1 em meio de cultura celular livre de soro (DMEM).
2. Preparar 1 mL de cada uma das soluções-estoque em tubos microcentrífugos de 1,5 mL de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM e 0,01 μM de compostos de teste em dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a -20 °C. Preparar 200 μL por dose das soluções de trabalho dos compostos de ensaio, diluindo as concentrações de reservas-mãe 1:1000 em meio isento de soro em tubos de 1,5 ml.
3. No capuz de cultura de tecidos, sementes de células COS-7 (células renais de macaco verde africano, rim Cercopithecus aethiops ) em meio completo [DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS)] em placas de fundo plano, tratadas com cultura de tecidos, a uma concentração de 4 × 10³ células/200 μL por poço usando um pipetador multicanal. As células COS-7 foram escolhidas porque (1) estas são células comumente utilizadas para ensaios de citotoxicidade e (2) estas já estavam disponíveis na instituição.
4. Incubar células COS-7 durante 24 h a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO₂.
5. Aspirar o sobrenadante dos poços usando uma pipeta Pasteur de vidro presa a uma bomba de vácuo. Dosar as células em triplicado com os compostos de ensaio, utilizando as soluções de trabalho preparadas na fase 2.2 (ver quadro 1). Incubar as células conforme descrito na etapa 2.4.
6. Aspirar o sobrenadante dos poços. Adicionar 200 μL de solução de MTT a cada alvéolo. Incubar a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO₂ durante 4 h.
7. Aspirar suavemente o sobrenadante dos poços sem perturbar os cristais formazanos roxos. Adicione 200 μL de DMSO a cada poço para dissolver os cristais formazan roxos. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
8. Meça a absorvância a 590 nm¹⁴ ou 600 nm para cada poço usando um leitor de placas de 96 poços. Use poços sem células como pano de fundo e faça a média do valor de absorvência. Subtraia o valor médio de fundo de absorvância do valor de absorvência de cada poço tratado. Normalize os dados como uma porcentagem do valor médio de dosagem zero (média dos três valores de dose zero). Plotar dados no eixo y: linear (% de viabilidade celular relativa); eixo x: log (concentração). Plote cada série como uma curva individual (por exemplo, os dados triplicados devem ter 3 curvas)

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Resultados

Os oximas espirocíclicos 6 e 7 foram sintetizados por meio de um protocolo modificado (Figura 1). A adição de furfurilamina a um ligador REM 1b proporcionou resina 2 ligada ao polímero. O progresso da reação foi monitorado por espectroscopia de infravermelho (IR), detectando-se o desaparecimento do éster α,β-insaturado a 1722 ^cm-1 (Figura 3). A resina espirocíclica 4 foi formada a partir de 2 através de um intermediário transitório 3. A h...

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Discussão

A síntese dos compostos espirocíclicos foi baseada em pesquisas anteriores realizadas por este laboratório, porém com algumas modificações (Figura 1)^11,12. O progresso de cada etapa de reação foi monitorado por espectroscopia de RI. Michael adição do ligador REM 1 com furfurilamina proporcionada polímero ligado 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 ^cm-1).

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane	Sigma-Aldrich	152951	Alkyl-halide
Allylbromide	Sigma-Aldrich	337528	Alkyl-halide
Benzylbromide	Sigma-Aldrich	B17905	Alkyl-halide
Cisplatin	Cayman Chemical	13119	Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Solvent
Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine	Genesee Scientific	25-500	Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)	Sigma-Aldrich	F4135	Cell culture media
Furfurylamine	Acros Organics	119800050	reagent
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566	Alkyl-halide
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Genesee Scientific	25-507	Cell culture media
REM Resin	Nova Biochem	8551010005	Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene	Sigma-Aldrich	N26806	Nitro-olefin reagent
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvent
Triethylamine (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)	Sigma-Aldrich	386529	Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel	Chemglass	CG-1861-02	Glassware with filter
96 Well plate reader	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer	Bruker	N/A	Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	Instrument
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific	757950819	Instrument