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요약

여기에서는 이전에 합성 된 스피로 사이클릭 옥심을 테스트하기 위해 3- (4', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하는 생물학적 분석에 대해 설명합니다.

초록

스피로 사이 클릭 헤테로 사이클은 최근 암 치료를위한 잠재적 인 약물로 문헌에서보고되었습니다. 이러한 새로운 직교 고리 시스템의 합성은 어렵습니다. 이들 화합물을 합성하기 위한 효율적인 방법론이 최근에 발표되었는데, 이는 이전에 보고된 5단계가 아닌 4단계로 고체상 합성을 기술하였다. 이 짧은 합성의 장점은 독성 시약의 사용을 제거하는 것입니다. 저로딩 재생 마이클(REM) 링커 기반 수지는 고로딩 버전이 부피가 큰 페닐 및 방향족 측쇄를 포함하는 시약의 첨가를 방지하므로 합성에 중요한 것으로 밝혀졌습니다. 비색 3- (4 ', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석을 사용하여 시험관 내에서 이러한 새로운 스피로 사이 클릭 분자의 마이크로 몰 농도의 세포 독성을 조사했습니다. MTT는 상업적으로 쉽게 구할 수 있으며 비교적 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 생성하므로 이 분석은 이러한 스피로사이클릭 헤테로사이클에 이상적입니다. 직교 고리 구조 뿐만 아니라 푸르푸릴아민(유사한 5-원 고리 모티프를 함유하는 합성 방법의 전구체)을 시험하였다.

서문

소분자 E3 유비퀴틴-리가아제 마우스의 이중 분2 동족체(MDM2)와 p53의 상호작용의 억제는 종양 세포 사멸 1,2,3의 p53 매개 유도를 회복시키는 것으로 알려져 있다. MDM2는 p53 경로의 음성 조절자이며 종종 암세포 4,5,6,7,8,9에서 과발현됩니다. 최근의 결정학적 및 생화학적 연구에 따르면 스피로사이클릭 프레임워크를 포함하는 소분자가 MDM2-p53 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있음이 밝혀졌습니다10. 스피로사이클릭 프레임워크(그림 1, 파란색으로 음영 처리됨)는 이 단단한 직교 고리 시스템의 유도체화가 새로운 치료 약물의 발견으로 이어짐에 따라 특권적인 모티브로 간주됩니다. 이 흥미로운 아키텍처에 접근하는 것은 전통적인 유기 합성 기술을 사용할 때 어려움을 겪습니다. 생물학적 시스템에서 스피로 사이 클릭 분자의 치료 효과가 조사되었지만 이러한 분자의 합성은 여전히 번거로운 과정입니다. 가혹한 조건을 사용하는 원치 않는 부산물 및 위험한 전이 금속은 종종 문제가됩니다.

약물 개발에서 스피로 사이 클릭 모티프의 잠재적 인 사용은 다른 상호 교환 가능한 작용기11,12 이외에 모티프를 갖는 분자 라이브러리를 생성하기 위해 고체상 합성을 활용하는 프로토콜의 개발로 이어졌다. 단계 간 생성물과 반응물의 분리는 수지 비드와 고체상 필터 용기에 부착된 REM 링커를 간단히 활용하여 달성할 수 있습니다. 이것은 단계를 줄이고 잠재적으로 수율을 증가시킬 것입니다. 이 합성 접근법은 많은 잠재적 인 약물 후보를 생성 할 수 있습니다. 그러나 생물학적 시스템에서 이러한 분자의 효과는 추가 조사가 필요합니다.

이들 스피로사이클릭 화합물의 세포독성을 결정하기 위해, MTT 분석13,14를 사용하였다. 이 방법은 세포 생존율을 측정하고 세포 세포 독성을 간접적으로 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 96웰 플레이트에서 배양된 세포에 다양한 농도의 억제제를 첨가하고, 보라색 포르마잔 화합물에 대한 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 노란색 MTT의 감소 정도를 비색 분석으로 비색 분석하여 측정했습니다(그림 2). 활성은 가장 자주 IC 50 값, 즉 세포 성장이 처리되지 않은 대조군에 비해50% 억제되는 농도로 보고됩니다. 이 논문은 MTT 분석의 프로토콜과 이러한 새로운 스피로 사이클릭 분자의 예비 결과를 설명합니다.

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프로토콜

알림: 이 프로토콜에 사용되는 여러 화학 물질 및 생물학적 시약은 독성이 있고 발암성입니다. 사용하기 전에 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 실험을 시작하기 전에 적절한 개인 보호 장비(산업안전보건청에서 승인한 안전 고글, 적절한 장갑, 실험실 코트, 전신 바지 및 발가락이 막힌 신발)를 사용하십시오. 또한 합성을 수행하고 독성 화학 물질 및 시약(흄 후드)을 취급할 때 적절한 안전 관행을 채택하십시오.

1. 스피로 사이 클릭 헤테로 사이클 6 및 7의 고체상 합성

참고 : 합성은 이전에 출판 된 작업11,12를 기반으로했습니다. 업데이트 된 프로토콜은 삼환 헤테로 사이클의 테트라 부틸 암모늄 플루오 라이드 촉매 개환이 필요하지 않았 음을 보여 주므로 제거는 합성 절차를 단축시킵니다.

  1. 마이클은 REM 링커에 푸르푸릴아민을 첨가합니다(지속시간: 설정 25분 + 반응 시간 24시간).
    1. 1 g (1 당량])의 REM 수지, 20 mL (20 당량)의 디메틸포름아미드 (DMF), 및 2.4 mL의 푸르푸릴아민을 25 mL 고체상 반응 용기에 첨가한다. 반응 개시 후 24시간 동안 실온에서 반응 용기를 교반합니다.
      알림: 수지가 용기 바닥에 놓이지 않도록 철저히 혼합하십시오.
    2. 반응이 완료된 후 수지를 DMF 1x로 세척한다. 그런 다음 디클로로 메탄 (DCM)과 메탄올을 번갈아 가며 4 회 세척하십시오. 세척 후 반응 용기에서 수지를 완전히 건조시킵니다.
  2. 탠덤 마이클 추가/1,3-쌍극자 고리화첨가를 수행합니다(지속시간: 설정 25분 + 반응 시간 48시간).
    1. 건조 수지에, 1.48 mL (5 당량)의 트리에틸아민 (TEA), 0.637 g (2 당량)의 니트로-올레핀, 및 10 mL의 건조 톨루엔을 반응 용기에 첨가한다.
    2. 그런 다음 1.085mL(4당량)의 트리메틸실릴 클로라이드(TMSCl)를 환기가 잘 되는 흄 후드의 반응 용기에 추가합니다.
      알림: 이 반응은 HCl 가스를 생성하므로 가스가 흄 후드 아래에서 방출될 때까지 반응 용기를 덮지 마십시오.
    3. 반응 용기를 단단히 캡핑하고 실온에서 48시간 동안 교반합니다.
      알림: 수지와 시약의 완전한 혼합을 확인하십시오.
    4. 5mL의 메탄올을 사용하여 반응을 진정시킵니다.
    5. 용기를 배수하여 용액을 제거한 다음 DCM과 메탄올을 번갈아 가며 4 번 세척하십시오. 세척 후 반응 용기에서 수지를 완전히 건조시킵니다.
  3. 수지 결합 헤테로사이클의 N-알킬화를 수행하여 4차 아민을 형성합니다(기간: 설정 10분 + 반응 시간 24시간).
    1. 반응 용기 내의 건조 수지에, 5 mL의 DMF 및 10 당량의 알킬 할라이드를 첨가하고, 실온에서 24 h 동안 교반한다.
      알림: 시약과 수지의 철저한 혼합을 확인하십시오.
    2. 반응이 완료된 후 수지를 DMF 1x로 세척한다. 그런 다음 DCM과 메탄올을 번갈아 사용하여 4x 세척하십시오. 세척 후 반응 용기에서 수지를 건조시킵니다.
  4. 폴리머 지지체로부터의 절단을 위해 4차 아민의 β 제거를 수행합니다(기간: 설정 15분 + 반응 시간 24시간).
    1. 반응 용기 내의 건조 수지에, 3 mL의 DCM 및 1.49 mL (5 당량)의 TEA를 첨가하여 중합체 지지체로부터 헤테로사이클을 절단한다.
    2. 반응 혼합물을 24시간 동안 교반하여 수지와 용액이 완전히 혼합되도록 합니다. DCM과 메탄올을 번갈아 가며 4 번 세척하십시오. 모든 세척에서 용리를 수집하고 회전 증발을 통해 농축하십시오.
    3. 메탄올로 분쇄하여 스피로사이클릭 옥심을 정제한다. 세척 후 반응 용기에서 수지를 완전히 건조시켜 향후 실험에서 재사용합니다.

2. MTT 14를 이용한 세포독성 분석

  1. 희석제로 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, 물 중 0.9% NaCl)를 사용하여 5mg/mL MTT 용액 20mL를 준비합니다. 여과하고 -20 °C에서 보관하십시오. 그런 다음 무혈청 세포 배양 배지(DMEM)에서 2.1단계의 MTT 용액을 1:1 희석하여 준비합니다.
  2. 디메틸설폭사이드(DMSO) 중 100mM, 10mM, 1mM, 100μM, 10μM, 1μM, 1μM, 0.1μM 및 0.01μM의 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 각각 1mL의 저장 용액을 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오. 1.5mL 튜브의 무혈청 배지에서 스톡 농도 1:1000을 희석하여 시험 화합물의 작업 용액 용량당 200μL를 준비합니다.
  3. 조직 배양 후드에서 COS-7 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, Cercopithecus aethiops 신장)를 완전 배지[10% 소 태아 혈청(FBS)가 포함된 DMEM]에 다중 채널 피펫터를 사용하여 웰당 4 × 103 cells/200 μL의 농도로 평평한 바닥, 조직 배양 처리된 96웰 플레이트에 시드합니다. COS-7 세포는 (1) 세포 독성 분석에 일반적으로 사용되는 세포이고 (2) 기관에서 이미 사용 가능했기 때문에 선택되었습니다.
  4. COS-7 세포를 5%CO2를 함유하는 분위기에서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
  5. 진공 펌프에 부착 된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 웰에서 상청액을 흡입합니다. 세포를 단계 2.2에서 제조된 작업 용액을 사용하여 시험 화합물과 함께 삼중으로 투여한다(표 1 참조). 단계 2.4에 설명된 대로 세포를 배양합니다.
  6. 우물에서 상청액을 흡인하십시오. 각 웰에 200μL의 MTT 용액을 추가합니다. 5%CO2 를 함유하는 분위기에서 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
  7. 보라색 포르 마잔 결정을 방해하지 않고 우물에서 상청액을 부드럽게 흡인하십시오. 각 웰에 200μL의 DMSO를 첨가하여 보라색 포르마잔 결정을 용해시킵니다. 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
  8. 96웰 플레이트 리더를 사용하여 각 웰에 대해 590nm14 또는 600nm에서 흡광도를 측정합니다. 세포가 없는 웰을 배경으로 사용하고 흡광도 값을 평균화합니다. 각 처리된 웰의 흡광도 값에서 평균 흡광도 배경값을 뺀다. 데이터를 평균 제로 투여량 값의 백분율로 정규화합니다(3개의 0-투여량 값의 평균). y축에 데이터 플로팅: 선형(% 상대 세포 생존율); x 축 : 로그 (농도). 각 계열을 개별 곡선으로 플로팅합니다(예: 삼중 데이터에는 3개의 곡선이 있어야 함).

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결과

스피로사이클릭 옥심 6 및 7은 변형된 프로토콜을 사용하여 합성되었습니다(그림 1). 마이클-푸르푸릴아민을 REM 링커 1b에 첨가하여 중합체-결합된 수지 2를 수득하였다. 반응의 진행은 1722 cm-1에서 α,β- 불포화 에스테르의 소실을 검출함으로써 적외선 (IR) 분광법에 의해 모니터링되었다 (그림 3). 스피로사이클릭 결합 수지 4는 일시적인 중간체 3...

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토론

스피로 클릭 화합물의 합성은이 실험실에서 수행 한 이전 연구를 기반으로했지만 일부 수정되었습니다 (그림 1)11,12. 각 반응 단계의 진행을 IR 분광법으로 모니터링하였다. 마이클푸르푸릴아민과 함께 REM 링커 1의 첨가는 중합체 결합 2(IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1)를 제공하였다.<...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 교수 연구위원회에서 K.S.H. (연구 및 보조금 사무소, Azusa Pacific University-USA)에 대한 보조금으로 지원되었습니다. ANG와 JFM은 학술 학부 연구 경험 (SURE) 펠로우십의 수혜자입니다. SKM과 BMR은 STEM Research Fellowship Grants (미국 Azusa Pacific University-Science 연구 센터)의 수혜자입니다. 생물학적 분석에 대한 지침을 주신 Matthew Berezuk 박사와 Philip Cox 박사에게 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-BromooctaneSigma-Aldrich152951Alkyl-halide
AllylbromideSigma-Aldrich337528Alkyl-halide
BenzylbromideSigma-AldrichB17905Alkyl-halide
CisplatinCayman Chemical13119Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997Solvent
Dimethylformamide (DMF)Sigma-Aldrich227056Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich276855Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamineGenesee Scientific25-500Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)Sigma-AldrichF4135Cell culture media
FurfurylamineAcros Organics119800050reagent 
IodomethaneSigma-Aldrich289566Alkyl-halide
MethanolSigma-Aldrich34860Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)EMD MilliporeCalbiochem 475989-1GMReagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)Genesee Scientific25-507Cell culture media
REM ResinNova Biochem8551010005Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyreneSigma-AldrichN26806Nitro-olefin reagent
TolueneSigma-Aldrich244511Solvent
Triethylamine (TEA)Sigma-AldrichT0886Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)Sigma-Aldrich386529Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vesselChemglassCG-1861-02Glassware with filter
96 Well plate readerPromega (Turner Biosystems)9310-011Instrument
AVANCE III NMR SpectrometerBrukerN/AInstrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZAInstrument
Wrist-Action ShakerBurrell Scientific757950819Instrument

참고문헌

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  2. Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
  3. Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
  4. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
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  6. Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
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  11. Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).
  13. Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
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