סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

Summary

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית באמצעות 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) כדי לבחון אוקסימים ספירוציקליים שסונתזו בעבר.

Abstract

הטרוציקלים ספירוציקליים דווחו לאחרונה בספרות כתרופות פוטנציאליות לטיפול בסרטן. הסינתזה של מערכות טבעות אורתוגונליות חדשניות אלה מאתגרת. לאחרונה פורסמה מתודולוגיה יעילה לסינתזה של תרכובות אלה, שתיארה את סינתזת הפאזה המוצקה בארבעה שלבים במקום חמשת השלבים שדווחו קודם לכן. היתרון של סינתזה קצרה זו הוא חיסול השימוש של ריאגנטים רעילים. שרף מבוסס קישור של מיכאל (REM) בטעינה נמוכה נמצא כחיוני בסינתזה, שכן גרסאות בעלות עומס גבוה מנעו הוספת ריאגנטים המכילים פניל מגושם ושרשראות צד ארומטיות. בדיקת הקולורימטריה 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) שימשה לבחינת הציטוטוקסיות של ריכוזי מיקרומולאר של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה במבחנה. MTT זמין בקלות מסחרית ומפיק תוצאות מהירות ואמינות יחסית, מה שהופך את הבדיקה הזו לאידיאלית עבור הטרוציקלים ספירוציקליים אלה. נבדקו מבני טבעת אורתוגונליים וכן פורפורילאמין (מבשר בשיטת הסינתזה המכיל מוטיב טבעת דומה בן 5 איברים).

Introduction

עיכוב מולקולות קטנות של האינטראקציה של עכבר יוביקוויטין-ליגאז E3 דקה כפולה 2 הומולוג (MDM2) עם p53 ידוע לשחזר אינדוקציה בתיווך p53 של אפופטוזיס תאי גידול ^1,2,3. MDM2 הוא מווסת שלילי של מסלול p53 ולעתים קרובות הוא מבוטא יתר על המידה בתאים סרטניים 4,5,6,7,8,9. מחקרים קריסטלוגרפיים וביוכימיים אחרונים גילו כי מולקולות קטנות המכילות מסגרת ספירוציקלית יכולות לעכב ביעילות אינטראקציות MDM2-p53¹⁰. המסגרת הספירוציקלית (איור 1, המוצללת בכחול) נחשבת למוטיב מיוחס מכיוון שנגזרת של מערכת הטבעות האורתוגונלית הנוקשה הזו הובילה לגילוי תרופות טיפוליות חדשניות. הגישה לארכיטקטורה מעניינת זו מציבה אתגר בעת שימוש בטכניקות סינתזה אורגניות מסורתיות. למרות שההשפעות הטיפוליות של מולקולות ספירוציקליות במערכות ביולוגיות נחקרו, סינתזה של מולקולות אלה היא עדיין תהליך מסורבל. מוצרי לוואי לא רצויים, שימוש בתנאים קשים ומתכות מעבר מסוכנות הם לעתים קרובות בעייתיים.

השימוש הפוטנציאלי במוטיב הספירוציקלי בפיתוח תרופות הוביל לפיתוח פרוטוקול המשתמש בסינתזה בפאזה מוצקה כדי ליצור ספרייה של מולקולות עם המוטיב בנוסף לקבוצות תפקודיות אחרות הניתנות להחלפה^11,12. הפרדת המוצרים והמגיבים בין השלבים יכולה להיות מושגת פשוט על ידי שימוש במקשר REM המחובר לחרוז שרף וכלי מסנן פאזה מוצקה. זה יצמצם את הצעדים ואולי יעלה את התשואות. גישה סינתטית זו יכולה לייצר מגוון גדול של מועמדים פוטנציאליים לתרופות. עם זאת, היעילות של מולקולות אלה במערכת ביולוגית תדרוש חקירה נוספת.

כדי לקבוע את הציטוטוקסיות של תרכובות ספירוציקליות אלה, נעשה שימוש במבחן MTT^13,14. שיטה זו מודדת את כדאיות התא וניתן להשתמש בה כדי לקבוע בעקיפין ציטוטוקסיות של תאים. ריכוזים שונים של המעכבים נוספו לתאים בתרבית בצלחת של 96 בארות, ושיעור התאים החיים נמדד על-ידי ניתוח קולורימטרי של מידת ההפחתה של MTT צהוב על-ידי דהידרוגנזות מיטוכונדריאליות לתרכובת הפורמזן הסגולה (איור 2). הפעילות מדווחת לרוב כערך IC 50 - הריכוז שבו צמיחת התאים מעוכבת_ב-50% ביחס לבקרה שאינה מטופלת. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול של בדיקת MTT ואת התוצאות הראשוניות של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה.

Protocol

הערה: מספר כימיקלים וריאגנטים ביולוגיים המשמשים בפרוטוקול זה הם רעילים ומסרטנים. יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (משקפי בטיחות שאושרו על ידי מינהל הבטיחות והבריאות התעסוקתית, כפפות מתאימות, מעילי מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות) לפני תחילת הניסוי. בנוסף, לאמץ נוהלי בטיחות מתאימים בעת ביצוע סינתזה וטיפול בכימיקלים רעילים וריאגנטים (אדים מכסה אדים).

1. סינתזת פאזה מוצקה של הטרוציקלים ספירוציקליים 6 ו-7

הערה: הסינתזה התבססה על עבודה שפורסמה בעבר^11,12. הפרוטוקול המעודכן מגלה כי לא היה צורך בפתיחת הטבעת המזורזת של הטטרבוטילמוניום פלואוריד של ההטרוציקלית הטריציקלית, ולכן חיסולה מקצר את ההליך הסינתטי.

1. בצע מיכאל תוספת של פורפורילאמין למקשר REM (משך: 25 דקות התקנה + 24 שעות זמן תגובה).
   1. הוסף 1 גרם (1 שווה ערך [שווה ערך]) של שרף REM, 20 מ"ל (20 שווה ערך) של דימתילפורמיד (DMF), ו-2.4 מ"ל של פורפורילאמין לכלי תגובה בפאזה מוצקה של 25 מ"ל. התסיסו את כלי התגובה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לאחר תחילת התגובה.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי כדי שהשרף לא יישב בתחתית הכלי.
   2. יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש לשטוף 4x, לסירוגין בין דיכלורומתאן (DCM) למתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
2. בצע טנדם מיכאל תוספת/ציקלואדיטור 1,3-דיפולרי (משך: 25 דקות התקנה + 48 שעות זמן תגובה).
   1. לשרף היבש, יש להוסיף 1.48 מ"ל (שווה ערך ל-5) של טריאתילאמין (TEA), 0.637 גרם (שווה ערך ל-2) של ניטרו-אולפין ו-10 מ"ל של טולואן יבש לכלי התגובה.
   2. לאחר מכן, הוסיפו 1.085 מ"ל (שווה ערך ל-4) של טרימתילסיליל כלוריד (TMSCl) לכלי התגובה במכסה אדים מאוורר היטב.
      הערה: מכיוון שתגובה זו מייצרת גז HCl, אין לכסות את כלי התגובה עד שהגז משתחרר מתחת למכסה אדים.
   3. יש לכסות היטב את כלי התגובה, ולהתסיס בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של השרף עם הריאגנטים.
   4. השתמש 5 מ"ל של מתנול כדי להרוות את התגובה.
   5. מסננים את הכלי כדי להסיר את הפתרון, ולאחר מכן לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM ו מתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
3. בצע N-alkylation של הטרוציקל הקשור לשרף כדי ליצור את האמין הרבעוני (משך: 10 דקות הגדרה + 24 שעות זמן תגובה).
   1. לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 5 מ"ל של DMF ו-10 שווה ערך של אלקיל הליד, והתסיסו בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
      הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של הריאגנטים עם השרף.
   2. יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש להשתמש ב-DCM ובמתנול לסירוגין כדי לשטוף פי 4. יבשו את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.
4. בצע חיסול β של האמין הרבעוני לביקוע מתמיכת הפולימר (משך: 15 דקות התקנה + זמן תגובה של 24 שעות).
   1. לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 3 מ"ל של DCM ו-1.49 מ"ל (שווה ערך ל-5) של TEA כדי לבקע את ההטרוציקל מתמיכת הפולימר.
   2. התסיסו את תערובת התגובה במשך 24 שעות כדי להבטיח ערבוב יסודי של השרף עם התמיסה. יש לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM למתנול. אוספים את השטיפה מכל השטיפות, ומתרכזים באמצעות אידוי סיבובי.
   3. טריטורט עם מתנול כדי לטהר את האוקסימה הספירוציקלית. יבשו את השרף ביסודיות בכלי התגובה לאחר שטיפות לשימוש חוזר בניסויים עתידיים.

2. בדיקת ציטוטוקסיות באמצעות MTT ¹⁴

1. יש להכין 20 מ"ל של תמיסת MTT של 5 מ"ג/מ"ל באמצעות תמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS, 0.9% NaCl במים) כמדלל. מסננים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C. לאחר מכן, הכן דילול 1:1 של תמיסת MTT משלב 2.1 במדיום תרבית תאים ללא סרום (DMEM).
2. הכן 1 מ"ל כל אחד מפתרונות מלאי בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל של 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0.1 μM ו- 0.01 μM של תרכובות בדיקה בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. הכן 200 μL למנה של תמיסות העבודה של תרכובות בדיקה על ידי דילול ריכוזי מלאי 1:1000 במדיום ללא סרום בצינורות 1.5 מ"ל.
3. במכסה המנוע של תרבית הרקמה, זרעו תאי COS-7 (תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, כליית Cercopithecus aethiops ) במדיום שלם [DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS)] על צלחות 96-well שטופלו בתרבית רקמה בריכוז של 4 × 10^{3 תאים} /200 μL לבאר באמצעות פיפטור רב-ערוצי. תאי COS-7 נבחרו מכיוון ש-(1) אלה תאים נפוצים לבדיקות ציטוטוקסיות ו-(2) אלה כבר היו זמינים במוסד.
4. לדגום תאי COS-7 במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO₂.
5. שאפו את הסופר-נטנט מהבארות באמצעות פיפטה מזכוכית פסטר המחוברת למשאבת ואקום. מינון התאים במשולש עם תרכובות הבדיקה באמצעות פתרונות העבודה שהוכנו בשלב 2.2 (ראה טבלה 1). דגירה של תאים כמתואר בשלב 2.4.
6. שאפו את הסופרנטנט מהבארות. הוסף 200 μL של תמיסת MTT לכל באר. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO₂ למשך 4 שעות.
7. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מהבארות מבלי להפריע לגבישי הפורמזן הסגולים. הוסף 200 μL של DMSO לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן הסגולים. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
8. מדוד את הספיגה ב-590 ננומטר¹⁴ או 600 ננומטר עבור כל באר באמצעות קורא צלחות של 96 בארות. השתמש בארות ללא תאים כרקע וממוצע ערך הספיגה. הפחת את ערך הרקע הממוצע של הספיגה מערך הספיגה של כל מטופל היטב. נרמל את הנתונים כאחוז מערך המינון האפס הממוצע (ממוצע שלושת ערכי מינון אפס). נתוני התווייה על ציר y: ליניארי (% כדאיות תא יחסית); ציר x: לוג (ריכוז). התווה כל סדרה כעקומה נפרדת (לדוגמה, נתונים משולשים צריכים לכלול 3 עקומות)

תוצאות

אוקסימים ספירוציקליים 6 ו-7 סונתזו באמצעות פרוטוקול שונה (איור 1). תוספת מיכאל של פורפורילאמין למקשר REM 1b העניקה שרף הקשור לפולימר 2. התקדמות התגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום (IR) על ידי גילוי היעלמות האסטר הבלתי רווי α,β בעומק 1722 ס"^מ-1 (איור 3...

Discussion

הסינתזה של התרכובות הספירוציקליות התבססה על מחקר קודם שנערך במעבדה זו, אך עם כמה שינויים (איור 1)^11,12. ההתקדמות של כל שלב תגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית IR. תוספת מיכאל של מקשר REM 1 עם פורפורילאמין ניתנת לפולימר 2

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane	Sigma-Aldrich	152951	Alkyl-halide
Allylbromide	Sigma-Aldrich	337528	Alkyl-halide
Benzylbromide	Sigma-Aldrich	B17905	Alkyl-halide
Cisplatin	Cayman Chemical	13119	Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Solvent
Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine	Genesee Scientific	25-500	Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)	Sigma-Aldrich	F4135	Cell culture media
Furfurylamine	Acros Organics	119800050	reagent
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566	Alkyl-halide
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Genesee Scientific	25-507	Cell culture media
REM Resin	Nova Biochem	8551010005	Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene	Sigma-Aldrich	N26806	Nitro-olefin reagent
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvent
Triethylamine (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)	Sigma-Aldrich	386529	Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel	Chemglass	CG-1861-02	Glassware with filter
96 Well plate reader	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer	Bruker	N/A	Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	Instrument
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific	757950819	Instrument