Функционализированный спироциклический гетероциклический синтез и анализ цитотоксичности

Резюме

Здесь мы описываем биоанализ с использованием 3-(4',5'-диметилтиазол-2'-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT) для тестирования ранее синтезированных спироциклических оксимов.

Аннотация

Спироциклические гетероциклы недавно были зарегистрированы в литературе как потенциальные лекарства для терапии рака. Синтез этих новых ортогональных кольцевых систем является сложной задачей. Недавно была опубликована эффективная методология синтеза этих соединений, которая описывала синтез твердой фазы в четыре этапа, а не ранее сообщенные пять этапов. Преимуществом такого более короткого синтеза является исключение использования токсичных реагентов. Было обнаружено, что смола на основе линкера с низкой нагрузкой Regenerating Michael (REM) имеет решающее значение в синтезе, поскольку версии с высокой нагрузкой предотвращают добавление реагентов, содержащих громоздкие фениловые и ароматические боковые цепи. Колориметрический анализ 3-(4',5'-диметилтиазол-2'-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) был использован для изучения цитотоксичности микромолярных концентраций этих новых спироциклических молекул in vitro. MTT легко доступен в продаже и дает относительно быстрые и надежные результаты, что делает этот анализ идеальным для этих спироциклических гетероциклов. Были протестированы ортогональные кольцевые структуры, а также фурфуриламин (предшественник в методе синтеза, содержащий аналогичный 5-членный кольцевой мотив).

Введение

Известно, что низкомолекулярное ингибирование взаимодействия Е3 убиквитин-лигазы мышиным двухминутным гомологом 2 (MDM2) с р53 восстанавливает р53-опосредованную индукцию апоптоза опухолевых клеток ^1,2,3. MDM2 является отрицательным регулятором пути p53 и часто чрезмерно экспрессируется в раковых клетках 4,5,6,7,8,9. Недавние кристаллографические и биохимические исследования показали, что малые молекулы, содержащие спироциклическую структуру, могут эффективно ингибировать взаимодействия MDM2-p53¹⁰. Спироциклическая структура (рисунок 1, закрашенный синим цветом) считается привилегированным мотивом, поскольку дериватизация этой жесткой ортогональной кольцевой системы привела к открытию новых терапевтических препаратов. Доступ к этой интересной архитектуре представляет собой проблему при использовании традиционных методов органического синтеза. Хотя терапевтические эффекты спироциклических молекул в биологических системах были исследованы, синтез этих молекул все еще является громоздким процессом. Нежелательные побочные продукты, использующие суровые условия, и опасные переходные металлы часто являются проблематичными.

Потенциальное использование спироциклического мотива в разработке лекарств привело к разработке протокола, использующего твердофазный синтез для создания библиотеки молекул с мотивом в дополнение к другим взаимозаменяемым функциональным группам^11,12. Разделение продуктов и реагентов между стадиями может быть достигнуто простым использованием линкера REM, прикрепленного к смоляному шарику, и твердофазного фильтрующего сосуда. Это сократило бы шаги и потенциально увеличило бы урожайность. Этот синтетический подход может привести к появлению большого количества потенциальных кандидатов на лекарства. Однако эффективность этих молекул в биологической системе потребует дальнейшего изучения.

Для определения цитотоксичности этих спироциклических соединений был использован анализ МТТ^13,14. Этот метод измеряет жизнеспособность клеток и может быть использован для косвенного определения цитотоксичности клеток. Различные концентрации ингибиторов добавляли к культивируемым клеткам в 96-луночной пластине, а долю живых клеток измеряли колориметрическим анализом степени восстановления желтого МТТ митохондриальными дегидрогеназами до соединения фиолетового формазана (рисунок 2). Активность чаще всего сообщается как значение IC₅₀ - концентрация, при которой рост клеток ингибируется на 50% по сравнению с необработанным контролем. В этой статье описывается протокол анализа MTT и предварительные результаты этих новых спироциклических молекул.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые химические вещества и биологические реагенты, используемые в этом протоколе, являются токсичными и канцерогенными. Перед использованием ознакомьтесь с соответствующими паспортами безопасности материалов (MSDS). Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (одобренные Управлением по безопасности и гигиене труда защитные очки, соответствующие перчатки, лабораторные халаты, брюки в полный рост и обувь с закрытым носком) до начала эксперимента. Кроме того, примите соответствующие методы безопасности при выполнении синтеза и обращении с токсичными химическими веществами и реагентами (вытяжной капюшон).

1. Твердофазный синтез спироциклических гетероциклов 6 и 7

ПРИМЕЧАНИЕ: Обобщение было основано на ранее опубликованной работе^11,12. Обновленный протокол показывает, что тетрабутиламмоний фторид-катализируемое кольцевое открытие трициклического гетероцикла не было необходимым, и, таким образом, его выведение сокращает синтетическую процедуру.

1. Выполните майкловское добавление фурфуриламина в ЛИНКЕР REM (продолжительность: 25 мин установки + 24 ч времени реакции).
   1. Добавьте 1 г (1 эквивалент [экв.]) смолы REM, 20 мл (20 экв.) диметилформамида (DMF) и 2,4 мл фурфуриламина в твердофазный реакционный сосуд объемом 25 мл. Перемешивают реакционный сосуд при комнатной температуре в течение 24 ч после начала реакции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное перемешивание, чтобы смола не сидела на дне сосуда.
   2. Промыть смолу DMF 1x после завершения реакции. Затем промыть 4 раза, чередуя дихлорметан (DCM) и метанол. Тщательно высушите смолу в реакционном сосуде после промывки.
2. Выполняют тандемную добавку Михаила/1,3-диполярное циклоприсоединение (продолжительность: 25 мин установки + время реакции 48 ч).
   1. К сухой смоле добавляют 1,48 мл (5 экв.) триэтиламина (TEA), 0,637 г (2 экв.) нитроолефина и 10 мл сухого толуола в реакционный сосуд.
   2. Затем добавляют 1,085 мл (4 экв.) триметилсилилхлорида (TMSCl) в реакционный сосуд в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эта реакция производит газ HCl, не закрывайте реакционный сосуд до тех пор, пока газ не будет выпущен под дымовым капотом.
   3. Надежно закройте реакционный сосуд и перемешайте при комнатной температуре в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное смешивание смолы с реагентами.
   4. Используйте 5 мл метанола для гашения реакции.
   5. Слейте сосуд, чтобы удалить раствор, а затем промыть 4 раза, чередуя DCM и метанол. Тщательно высушите смолу в реакционном сосуде после промывки.
3. Выполняют N-алкилирование связанного со смолой гетероцикла с образованием четвертичного амина (продолжительность: 10 мин установки + время реакции 24 ч).
   1. К сухой смоле в реакционном сосуде добавляют 5 мл ДМФ и 10 экв. алкилгалогенида и перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное смешивание реагентов со смолой.
   2. Промыть смолу DMF 1x после завершения реакции. Затем используйте DCM и метанол поочередно для промывки 4x. Высушите смолу в реакционном сосуде после промывки.
4. Выполняют β-элиминацию четвертичного амина для расщепления от полимерной опоры (продолжительность: 15 мин установки + время реакции 24 ч).
   1. К сухой смоле в реакционном сосуде добавляют 3 мл DCM и 1,49 мл (5 экв.) TEA для расщепления гетероцикла от полимерной основы.
   2. Перемешивают реакционную смесь в течение 24 ч, чтобы обеспечить тщательное перемешивание смолы с раствором. Промыть 4x, чередуя DCM и метанол. Соберите элюирование из всех промывок и сконцентрируйте с помощью ротационного испарения.
   3. Тритурат с метанолом для очистки спироциклического оксима. Тщательно высушите смолу в реакционном сосуде после промывки для повторного использования в будущих экспериментах.

2. Анализ цитотоксичности с использованием MTT ¹⁴

1. Приготовьте 20 мл раствора МТТ 5 мг/мл, используя в качестве разбавителя стерильный фосфат-буферный физиологический раствор (PBS, 0,9% NaCl в воде). Фильтровать и хранить при -20 °C. Затем приготовьте 1:1 разведение раствора МТТ из стадии 2.1 в безсыворочной среде для культивирования клеток (DMEM).
2. Готовят по 1 мл исходного раствора в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл 100 мМ, 10 мМ, 1 мМ, 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 0,1 мкМ и 0,01 мкМ исследуемых соединений в диметилсульфоксиде (ДМСО). Хранить при -20 °C. Готовят 200 мкл на дозу рабочих растворов исследуемых соединений путем разбавления исходных концентраций 1:1000 в безсыворочной среде в пробирках по 1,5 мл.
3. В тканевом культуральном капюшоне семена клеток COS-7 (клетки почек африканской зеленой обезьяны, cercopithecus aethiops kidney) в полной среде [DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS)] на плоскодонные, обработанные культурой ткани 96-луночными пластинами в концентрации 4 × 10³ клеток / 200 мкл на скважину с использованием многоканального пипеттора. Клетки COS-7 были выбраны, потому что (1) это обычно используемые клетки для анализа цитотоксичности и (2) они уже были доступны в учреждении.
4. Инкубировать клетки COS-7 в течение 24 ч при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO₂.
5. Аспирируйте супернатант из скважин с помощью стеклянной пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумному насосу. Дозируйте клетки в трех экземплярах с исследуемыми соединениями с помощью рабочих растворов, приготовленных на стадии 2.2 (см. таблицу 1). Инкубировать клетки, как описано на этапе 2.4.
6. Аспирировать супернатант из скважин. Добавьте 200 мкл раствора МТТ в каждую лунку. Инкубировать при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO₂ в течение 4 ч.
7. Осторожно аспирируйте супернатант из лунок, не нарушая фиолетовых кристаллов формазана. Добавьте 200 мкл ДМСО в каждую лунку, чтобы растворить фиолетовые кристаллы формазана. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
8. Измерьте поглощение при 590 нм¹⁴ или 600 нм для каждой скважины с помощью 96-луночного пластинчатого считывателя. Используйте скважины без ячеек в качестве фона и усредняйте значение поглощения. Вычтите усредненное фоновое значение абсорбции из значения поглощения каждой обработанной скважины. Нормализуйте данные в процентах от среднего значения нулевой дозировки (усредняйте три значения нулевой дозы). График данных по оси Y: линейный (% относительной жизнеспособности ячейки); ось x: log (концентрация). Построение каждого ряда в виде отдельной кривой (например, тройные данные должны иметь 3 кривые)

Результаты

Спироциклические оксимы 6 и 7 синтезировали с использованием модифицированного протокола (рисунок 1). Добавление Майклом фурфуриламина к линкеру REM 1b обеспечило полимерно-связанную смолу 2. Ход реакции контролировали с помощью инфракрасной (ИК) спектроскопии путем обнар...

Обсуждение

Синтез спироциклических соединений был основан на предыдущих исследованиях, проведенных этой лабораторией, но с некоторыми модификациями (Рисунок 1)^11,12. Ход каждой стадии реакции контролировался с помощью ИК-спектроско...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane	Sigma-Aldrich	152951	Alkyl-halide
Allylbromide	Sigma-Aldrich	337528	Alkyl-halide
Benzylbromide	Sigma-Aldrich	B17905	Alkyl-halide
Cisplatin	Cayman Chemical	13119	Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Solvent
Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine	Genesee Scientific	25-500	Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)	Sigma-Aldrich	F4135	Cell culture media
Furfurylamine	Acros Organics	119800050	reagent
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566	Alkyl-halide
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Genesee Scientific	25-507	Cell culture media
REM Resin	Nova Biochem	8551010005	Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene	Sigma-Aldrich	N26806	Nitro-olefin reagent
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvent
Triethylamine (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)	Sigma-Aldrich	386529	Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel	Chemglass	CG-1861-02	Glassware with filter
96 Well plate reader	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer	Bruker	N/A	Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	Instrument
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific	757950819	Instrument