JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, daha önce sentezlenmiş spirosiklik oksimleri test etmek için 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5- difeniltetrazolyum bromür (MTT) kullanan bir biyotahlil tarif ediyoruz.

Özet

Spirosiklik heterosiklusların son zamanlarda literatürde kanser tedavisi için potansiyel ilaçlar olduğu bildirilmiştir. Bu yeni ortogonal halka sistemlerinin sentezi zordur. Bu bileşikleri sentezlemek için yakın zamanda, katı faz sentezini daha önce bildirilen beş adım yerine dört adımda tanımlayan etkili bir metodoloji yayınlandı. Bu kısa sentezin avantajı, toksik reaktiflerin kullanımının ortadan kaldırılmasıdır. Düşük yüklemeli Rejenere Michael (REM) bağlayıcı bazlı reçinenin sentezde çok önemli olduğu bulunmuştur, çünkü yüksek yüklemeli versiyonlar hacimli fenil ve aromatik yan zincirler içeren reaktiflerin eklenmesini önlemiştir. Kolorimetrik 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5- difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi, bu yeni spirosiklik moleküllerin mikromolar konsantrasyonlarının in vitro sitotoksisitesini incelemek için kullanıldı. MTT ticari olarak kolayca temin edilebilir ve nispeten hızlı, güvenilir sonuçlar üretir, bu da bu testi bu spirosiklik heterosikluslar için ideal kılar. Ortogonal halka yapılarının yanı sıra furfurilamin (benzer 5 üyeli halka motifi içeren sentez yönteminde bir öncül) test edildi.

Giriş

E3 ubikitin-ligaz faresinin çift dakika 2 homologunun (MDM2) p53 ile etkileşiminin küçük moleküllü inhibisyonu 1,2,3 tümör hücresi apoptozunun p53 aracılı indüksiyonunu geri kazandırdığı bilinmektedir. MDM2, p53 yolunun negatif bir düzenleyicisidir ve genellikle 4,5,6,7,8,9 kanser hücrelerinde aşırı eksprese edilir. Son kristalografik ve biyokimyasal çalışmalar, spirosiklik bir çerçeve içeren küçük moleküllerin MDM2-p53 etkileşimlerini etkili bir şekilde inhibe edebileceğini ortaya koymuştur10. Spirosiklik çerçeve (Şekil 1, mavi gölgeli), bu sert ortogonal halka sisteminin türevleştirilmesi yeni terapötik ilaçların keşfine yol açtığı için ayrıcalıklı bir motif olarak kabul edilir. Bu ilginç mimariye erişmek, geleneksel organik sentez tekniklerini kullanırken bir zorluk teşkil eder. Spirosiklik moleküllerin biyolojik sistemlerdeki terapötik etkileri araştırılmış olmasına rağmen, bu moleküllerin sentezi hala hantal bir süreçtir. İstenmeyen yan ürünler, zorlu koşullar ve tehlikeli geçiş metalleri genellikle sorunludur.

Spirosiklik motifin ilaç geliştirmede potansiyel kullanımı, diğer değiştirilebilir fonksiyonel gruplara ek olarak motifle birlikte bir molekül kütüphanesi oluşturmak için katı faz sentezini kullanan bir protokolün geliştirilmesine yol açmıştır11,12. Ürünlerin ve reaktanların adımlar arasında ayrılması, bir reçine boncuğuna bağlı bir REM bağlayıcı ve katı fazlı bir filtre kabı kullanılarak sağlanabilir. Bu, adımları azaltacak ve potansiyel olarak verimi artıracaktır. Bu sentetik yaklaşım, çok çeşitli potansiyel ilaç adayları üretebilir. Bununla birlikte, bu moleküllerin biyolojik bir sistemdeki etkinliği daha fazla araştırma gerektirecektir.

Bu spirosiklik bileşiklerin sitotoksisitesini belirlemek için, MTT testi13,14 kullanılmıştır. Bu yöntem hücre canlılığını ölçer ve dolaylı olarak hücre sitotoksisitesini belirlemek için kullanılabilir. 96 delikli bir plakadaki kültürlenmiş hücrelere inhibitörlerin farklı konsantrasyonları eklendi ve canlı hücrelerin oranı, sarı MTT'nin mitokondriyal dehidrogenazlar tarafından mor formazan bileşiğine indirgenme derecesinin kolorimetrik analizi ile ölçüldü (Şekil 2). Aktivite çoğunlukla bir IC 50 değeri olarak rapor edilir - hücre büyümesinin tedavi edilmemiş bir kontrole göre%50 oranında inhibe edildiği konsantrasyon. Bu yazıda MTT testinin protokolü ve bu yeni spirosiklik moleküllerin ön sonuçları açıklanmaktadır.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan çeşitli kimyasallar ve biyolojik reaktifler toksik ve kanserojendir. Kullanmadan önce ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Deneye başlamadan önce uygun kişisel koruyucu donanımları (İş Güvenliği ve Sağlığı İdaresi onaylı güvenlik gözlükleri, uygun eldivenler, laboratuvar önlükleri, tam boy pantolonlar ve kapalı ayak ayakkabıları) kullanın. Ek olarak, sentez yaparken ve toksik kimyasalları ve reaktifleri (duman davlumbazı) kullanırken uygun güvenlik uygulamalarını benimseyin.

1. Spirosiklik heterosiklusların katı faz sentezi 6 ve 7

NOT: Sentez daha önce yayınlanmış11,12 çalışmasına dayanıyordu. Güncellenmiş protokol, trisiklik heterosiklusun tetrabütilamimonyum florür katalizörlü halka açıklığına ihtiyaç duyulmadığını ve böylece eliminasyonunun sentetik prosedürü kısalttığını ortaya koymaktadır.

  1. REM bağlayıcıya furfurilamin ilavesini gerçekleştirin (süre: 25 dakika kurulum + 24 saat reaksiyon süresi).
    1. 25 mL'lik katı fazlı reaksiyon kabına 1 g (1 eşdeğeri [eşdeğeri]), 20 mL (20 eşdeğeri) dimetilformamid (DMF) ve 2.4 mL furfurilamin ekleyin. Reaksiyon kabını, reaksiyon başlatıldıktan sonra 24 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalayın.
      NOT: Reçinenin kabın dibine oturmaması için iyice karıştırdığınızdan emin olun.
    2. Reaksiyon tamamlandıktan sonra reçineyi DMF 1x ile yıkayın. Ardından, diklorometan (DCM) ve metanol arasında değişen 4x yıkayın. Yıkamaları takiben reçineyi reaksiyon kabında iyice kurulayın.
  2. Tandem Michael ekleme/1,3-dipolar sikloekleme gerçekleştirin (süre: 25 dk kurulum + 48 saat reaksiyon süresi).
    1. Kuru reçineye, reaksiyon kabına 1.48 mL (5 eşdeğer) trietilamin (TEA), 0.637 g (2 eşdeğer) nitro-olefin ve 10 mL kuru toluen ekleyin.
    2. Daha sonra, iyi havalandırılan bir duman davlumbazındaki reaksiyon kabına 1.085 mL (4 eşdeğer) trimetilsilil klorür (TMSCl) ekleyin.
      NOT: Bu reaksiyon HCl gazı ürettiğinden, gaz bir duman başlığı altında serbest bırakılana kadar reaksiyon kabını kapatmayın.
    3. Reaksiyon kabını güvenli bir şekilde kapatın ve oda sıcaklığında 48 saat boyunca çalkalayın.
      NOT: Reçinenin reaktiflerle iyice karıştırıldığından emin olun.
    4. Reaksiyonu söndürmek için 5 mL metanol kullanın.
    5. Çözeltiyi çıkarmak için kabı boşaltın ve ardından DCM ve metanol arasında geçiş yaparak 4x yıkayın. Yıkamaları takiben reçineyi reaksiyon kabında iyice kurulayın.
  3. Kuaterner amini oluşturmak için reçineye bağlı heterosiklusun N-alkilasyonunu gerçekleştirin (süre: 10 dakika kurulum + 24 saat reaksiyon süresi).
    1. Reaksiyon kabındaki kuru reçineye, 5 mL DMF ve 10 eşdeğer alkil halojenür ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalayın.
      NOT: Reaktiflerin reçine ile iyice karıştırıldığından emin olun.
    2. Reaksiyon tamamlandıktan sonra reçineyi DMF 1x ile yıkayın. Ardından, 4x'i yıkamak için DCM ve metanolü dönüşümlü olarak kullanın. Yıkamaları takiben reçineyi reaksiyon kabında kurutun.
  4. Polimer desteğinden ayrılmak için kuaterner aminin β eliminasyonunu gerçekleştirin (süre: 15 dakika kurulum + 24 saat reaksiyon süresi).
    1. Reaksiyon kabındaki kuru reçineye, heterosiklusu polimer desteğinden ayırmak için 3 mL DCM ve 1.49 mL (5 eşdeğer) TEA ekleyin.
    2. Reçinenin çözelti ile iyice karıştırılmasını sağlamak için reaksiyon karışımını 24 saat çalkalayın. DCM ve metanol arasında geçiş yaparak 4x yıkayın. Elüsyonu tüm yıkamalardan toplayın ve döner buharlaşma yoluyla konsantre olun.
    3. Spirosiklik oksimi saflaştırmak için metanol ile tritüre edin. Gelecekteki deneylerde tekrar kullanmak üzere yıkamaları takiben reçineyi reaksiyon kabında iyice kurulayın.

2. MTT 14 kullanarak sitotoksisite testi

  1. Seyreltici olarak steril fosfat tamponlu salin (PBS, suda% 0.9 NaCl) kullanarak 20 mL'lik bir 5 mg / mL MTT çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de filtreleyin ve saklayın. Ardından, MTT çözeltisinin serumsuz hücre kültürü ortamında (DMEM) adım 2.1'den 1: 1 seyreltilmesini hazırlayın.
  2. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 100 mM, 10 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM ve 0,01 μM'lik test bileşiklerinden oluşan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde her biri 1 mL stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de saklayın. 1.5 mL tüplerde serum içermeyen ortamda 1:1000 stok konsantrasyonlarını seyrelterek test bileşiklerinin çalışma çözeltilerinin dozu başına 200 μL hazırlayın.
  3. Doku kültürü başlığında, tohum COS-7 hücreleri (Afrika yeşil maymun böbrek hücreleri, Cercopithecus aethiops böbrek) tam ortamda [DMEM% 10 fetal sığır serumu (FBS)] çok kanallı bir pipetör kullanarak kuyu başına 4 × 103 hücre / 200 μL konsantrasyonda düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 kuyucuklu plakalara yerleştirin. COS-7 hücreleri seçildi, çünkü (1) bunlar sitotoksisite tahlilleri için yaygın olarak kullanılan hücrelerdir ve (2) bunlar kurumda zaten mevcuttu.
  4. COS-7 hücrelerini% 5 CO 2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de24 saat boyunca inkübe edin.
  5. Bir vakum pompasına bağlı bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı kuyucuklardan aspire edin. Adım 2.2'de hazırlanan çalışma çözeltilerini kullanarak test bileşikleri ile üçlü olarak hücreleri dozlayın (Bkz. Tablo 1). Hücreleri adım 2.4'te açıklandığı gibi inkübe edin.
  6. Süpernatantı kuyulardan aspire edin. Her bir kuyucuğa 200 μL MTT çözeltisi ekleyin. 4 saat boyunca% 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Mor formazan kristallerini rahatsız etmeden süpernatantı kuyucuklardan nazikçe aspire edin. Mor formazan kristallerini çözmek için her bir oyuğa 200 μL DMSO ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  8. 96 delikli bir plaka okuyucu kullanarak her kuyu için 590 nm14 veya 600 nm'de emiciliği ölçün. Arka plan olarak hücresiz kuyular kullanın ve absorbans değerinin ortalamasını alın. Ortalama absorbans arka plan değerini, iyi muamele edilen her bir absorbans değerinden çıkarın. Verileri ortalama sıfır doz değerinin bir yüzdesi olarak normalleştirin (ortalama üç sıfır doz değeri). Y ekseni üzerindeki verileri grafiklendirin: doğrusal (% göreceli hücre canlılığı); x ekseni: log (konsantrasyon). Her seriyi ayrı bir eğri olarak çizin (örneğin, üçlü verilerin 3 eğrisi olmalıdır)

Sonuçlar

Spirosiklik oksim 6 ve 7, modifiye edilmiş bir protokol kullanılarak sentezlendi (Şekil 1). Michael'ın bir REM bağlayıcı 1b'ye furfurilamin ilavesi, polimere bağlı reçine 2'yi sağladı. Reaksiyonun ilerlemesi, α.β doymamış esterin 1722 cm-1'de kaybolduğunu tespit ederek kızılötesi (IR) spektroskopi ile izlendi (Şekil 3). Spirosiklik bağlı reçine 4, 2'den geçici bir ara 3 ile oluşturulmuştur. 4'ün metanolik hidrolizi 3-[(3E

Tartışmalar

Spirosiklik bileşiklerin sentezi, bu laboratuvar tarafından yürütülen önceki araştırmalara dayanıyordu, ancak bazı modifikasyonlarla (Şekil 1)11,12. Her reaksiyon adımının ilerlemesi IR spektroskopisi ile izlendi. Rem bağlayıcı 1'in furfurilamin ile Michael ilavesi, polimere bağlı 2'yi (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1) sağladı. Ö...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Fakülte Araştırma Konseyi'nden K.S.H.'ye (Araştırma ve Hibeler Ofisi, Azusa Pacific University-ABD) verilen bir hibe ile finanse edilmiştir. A.N.G. ve J.F.M., Akademik Lisans Araştırma Deneyimi (SURE) Bursu'nun alıcılarıdır. S.K.M. ve B.M.R., STEM Araştırma Bursu Hibelerinin (Bilim Araştırma Merkezi, Azusa Pacific University-ABD) alıcılarıdır. Biyotahliller konusunda rehberlik için Dr. Matthew Berezuk ve Dr. Philip Cox'a minnettarız.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-BromooctaneSigma-Aldrich152951Alkyl-halide
AllylbromideSigma-Aldrich337528Alkyl-halide
BenzylbromideSigma-AldrichB17905Alkyl-halide
CisplatinCayman Chemical13119Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997Solvent
Dimethylformamide (DMF)Sigma-Aldrich227056Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich276855Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamineGenesee Scientific25-500Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)Sigma-AldrichF4135Cell culture media
FurfurylamineAcros Organics119800050reagent 
IodomethaneSigma-Aldrich289566Alkyl-halide
MethanolSigma-Aldrich34860Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)EMD MilliporeCalbiochem 475989-1GMReagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)Genesee Scientific25-507Cell culture media
REM ResinNova Biochem8551010005Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyreneSigma-AldrichN26806Nitro-olefin reagent
TolueneSigma-Aldrich244511Solvent
Triethylamine (TEA)Sigma-AldrichT0886Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)Sigma-Aldrich386529Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vesselChemglassCG-1861-02Glassware with filter
96 Well plate readerPromega (Turner Biosystems)9310-011Instrument
AVANCE III NMR SpectrometerBrukerN/AInstrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZAInstrument
Wrist-Action ShakerBurrell Scientific757950819Instrument

Referanslar

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
  2. Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).
  3. Paolo, T., et al. An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).
  4. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell. 91 (3), 325-334 (1997).
  5. Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).
  6. Oliner, J. D. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53. Nature. 362, 857-860 (1993).
  7. Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. The MDM2-p53 pathway revisited. Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).
  8. Bond, G. L. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  9. Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13. Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).
  10. Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy. Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).
  11. Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes. Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).
  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508 (2019).
  13. Lawrence, N. J. Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones. Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).
  14. . MTT assay protocol Available from: https://www.abcam.com/kits/mtt-assay-protocol (2020)

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 168MTT testispirosiklik oksimlerheterosikluslarsitotoksisitekat faz sentezih cre canl lkolorimetrik tahlil

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır