Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.

Zusammenfassung

Spirozyklische Heterocyclen wurden kürzlich in der Literatur als potenzielle Medikamente für die Krebstherapie beschrieben. Die Synthese dieser neuartigen orthogonalen Ringsysteme ist eine Herausforderung. Eine effiziente Methodik zur Synthese dieser Verbindungen wurde kürzlich veröffentlicht, die die Festphasensynthese in vier Schritten anstelle der zuvor berichteten fünf Schritte beschreibt. Der Vorteil dieser kürzeren Synthese ist der Wegfall der Verwendung toxischer Reagenzien. Es erwies sich heraus, dass REM-Linkerharz (Low Loading) Regenerating Michael (REM) entscheidend für die Synthese war, da hochladende Versionen die Zugabe von Reagenzien mit sperrigem Phenyl und aromatischen Seitenketten verhinderten. Der kolorimetrische 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde verwendet, um die Zytotoxizität der mikromolaren Konzentrationen dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle in vitro zu untersuchen. MTT ist kommerziell leicht erhältlich und liefert relativ schnelle, zuverlässige Ergebnisse, was diesen Assay ideal für diese spirocyclischen Heterocyclen macht. Orthogonale Ringstrukturen sowie Furfurylamin (eine Vorstufe der Synthesemethode, die ein ähnliches 5-gliedriges Ringmotiv enthält) wurden getestet.

Einleitung

Es ist bekannt, dass die kleinmolekulare Hemmung der Interaktion von E3-Ubiquitin-Ligase-Maus-Doppelminuten-2-Homolog (MDM2) mit p53 die p53-vermittelte Induktion der Tumorzellapoptose ^1,2,3 wiederherstellt. MDM2 ist ein negativer Regulator des p53-Signalwegs und wird in Krebszellen^oft überexprimiert 4,5,6,7,8,9. Neuere kristallographische und biochemische Studien haben gezeigt, dass kleine Moleküle, die ein spirozyklisches Gerüst enthalten, MDM2-p53-Wechselwirkungen wirksam hemmen können¹⁰. Das spirozyklische Gerüst (Abbildung 1, blau schattiert) gilt als privilegiertes Motiv, da die Derivatisierung dieses starren orthogonalen Ringsystems zur Entdeckung neuartiger therapeutischer Medikamente geführt hat. Der Zugang zu dieser interessanten Architektur stellt eine Herausforderung dar, wenn traditionelle organische Synthesetechniken verwendet werden. Obwohl die therapeutischen Wirkungen spirozyklischer Moleküle in biologischen Systemen untersucht wurden, ist die Synthese dieser Moleküle immer noch ein umständlicher Prozess. Unerwünschte Nebenprodukte, raue Bedingungen und gefährliche Übergangsmetalle sind oft problematisch.

Die mögliche Verwendung des spirozyklischen Motivs in der Arzneimittelentwicklung führte zur Entwicklung eines Protokolls, das die Festphasensynthese verwendet, um eine Bibliothek von Molekülen mit dem Motiv zusätzlich zu anderen austauschbaren funktionellen Gruppen^11,12 zu erzeugen. Die Trennung von Produkten und Reaktanten zwischen den Schritten könnte durch die einfache Verwendung eines REM-Linkers erreicht werden, der an einer Harzperle und einem Festphasenfilterbehälter befestigt ist. Dies würde die Stufen reduzieren und möglicherweise die Erträge erhöhen. Dieser synthetische Ansatz könnte eine Vielzahl potenzieller Arzneimittelkandidaten hervorbringen. Die Wirksamkeit dieser Moleküle in einem biologischen System würde jedoch weitere Untersuchungen erfordern.

Um die Zytotoxizität dieser spirocyclischen Verbindungen zu bestimmen, wurde der MTT-Assay^13,14 verwendet. Diese Methode misst die Zelllebensfähigkeit und kann zur indirekten Bestimmung der Zellzytotoxizität verwendet werden. Verschiedene Konzentrationen der Inhibitoren wurden kultivierten Zellen in einer 96-Well-Platte zugesetzt, und der Anteil lebender Zellen wurde durch kolorimetrische Analyse des Ausmaßes der Reduktion von gelbem MTT durch mitochondriale Dehydrogenasen zur violetten Formazanverbindung gemessen (Abbildung 2). Die Aktivität wird am häufigsten als IC 50-Wert angegeben - die Konzentration, bei der das Zellwachstum im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle um₅₀% gehemmt wird. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für den MTT-Test und die vorläufigen Ergebnisse dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle.

Protokoll

HINWEIS: Mehrere Chemikalien und biologische Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Konsultieren Sie vor der Verwendung die relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Verwenden Sie vor Beginn des Experiments geeignete persönliche Schutzausrüstung (von der Occupational Safety and Health Administration zugelassene Schutzbrille, geeignete Handschuhe, Laborkittel, durchgehende Hosen und geschlossene Schuhe). Darüber hinaus sollten Sie bei der Synthese und dem Umgang mit toxischen Chemikalien und Reagenzien (Abzug) geeignete Sicherheitspraktiken anwenden.

1. Festphasensynthese spirocyclischer Heterozyklen 6 und 7

ANMERKUNG: Die Synthese basiert auf der zuvor veröffentlichten Arbeit^11,12. Das aktualisierte Protokoll zeigt, dass die Tetrabutylammoniumfluorid-katalysierte Ringöffnung des trizyklischen Heterozyklus nicht benötigt wurde, und somit verkürzt ihre Eliminierung das synthetische Verfahren.

1. Michael fügt Furfurylamin zum REM-Linker hinzu (Dauer: 25 min Setup + 24 h Reaktionszeit).
   1. 1 g (1 Äquivalent [Äquiv.]) REM-Harz, 20 ml (20 Äquiv.) Dimethylformamid (DMF) und 2,4 ml Furfurylamin in ein 25 ml Festphasenreaktionsgefäß geben. Rühren Sie das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur für 24 h nach der Reaktionsinitiierung.
      HINWEIS: Stellen Sie eine gründliche Mischung sicher, damit das Harz nicht am Boden des Behälters sitzt.
   2. Waschen Sie das Harz mit DMF 1x, nachdem die Reaktion abgeschlossen ist. Dann 4x waschen, abwechselnd zwischen Dichlormethan (DCM) und Methanol. Trocknen Sie das Harz nach dem Waschen gründlich im Reaktionsgefäß.
2. Tandem-Michael-Addition/1,3-dipolare Cycloaddition durchführen (Dauer: 25 min Setup + 48 h Reaktionszeit).
   1. Dem Trockenharz werden 1,48 ml (5 Äquiv.) Triethylamin (TEA), 0,637 g (2 Äquiv.) Nitroolefin und 10 ml trockenes Toluol in das Reaktionsgefäß gegeben.
   2. Dann werden 1,085 ml (4 Äquiv.) Trimethylsilylchlorid (TMSCl) in das Reaktionsgefäß in einem gut belüfteten Abzug gegeben.
      HINWEIS: Da bei dieser Reaktion HCl-Gas entsteht, verschließen Sie das Reaktionsgefäß erst, wenn das Gas unter einem Abzug freigesetzt wurde.
   3. Verschließen Sie das Reaktionsgefäß sicher und rühren Sie es bei Raumtemperatur für 48 h.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Harz gründlich mit den Reagenzien gemischt wird.
   4. Verwenden Sie 5 ml Methanol, um die Reaktion zu löschen.
   5. Entleeren Sie das Gefäß, um die Lösung zu entfernen, und waschen Sie dann 4x, abwechselnd zwischen DCM und Methanol. Trocknen Sie das Harz nach dem Waschen gründlich im Reaktionsgefäß.
3. Durchführung einer N-Alkylierung des harzgebundenen Heterocyclus zur Bildung des quartären Amins (Dauer: 10 min Aufbau + 24 h Reaktionszeit).
   1. Zu dem trockenen Harz im Reaktionsgefäß werden 5 mL DMF und 10 Äquivalente Alkylhalogenid hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 24 h gerührt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Reagenzien gründlich mit dem Harz gemischt werden.
   2. Waschen Sie das Harz mit DMF 1x, nachdem die Reaktion abgeschlossen ist. Verwenden Sie dann DCM und Methanol abwechselnd, um 4x zu waschen. Trocknen Sie das Harz nach dem Waschen im Reaktionsgefäß.
4. Führen Sie β-Eliminierung des quartären Amins zur Spaltung aus dem Polymerträger durch (Dauer: 15 min Setup + 24 h Reaktionszeit).
   1. Zu dem trockenen Harz im Reaktionsgefäß werden 3 mL DCM und 1,49 mL (5 Äquiv.) TEA hinzugefügt, um den Heterozyklus vom Polymerträger zu trennen.
   2. Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 24 Stunden, um eine gründliche Mischung des Harzes mit der Lösung zu gewährleisten. 4x waschen, abwechselnd zwischen DCM und Methanol. Sammeln Sie die Elution aus allen Waschgängen und konzentrieren Sie sich durch rotatorische Verdampfung.
   3. Triturate mit Methanol, um das spirocyclische Oxim zu reinigen. Trocknen Sie das Harz gründlich im Reaktionsgefäß nach dem Waschen zur Wiederverwendung in zukünftigen Experimenten.

2. Zytotoxizitätstest mit MTT ¹⁴

1. Bereiten Sie 20 ml einer 5 mg/ml MTT-Lösung unter Verwendung steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,9% NaCl in Wasser) als Verdünnungsmittel her. Filter und lagerung bei -20 °C. Anschließend wird eine 1:1-Verdünnung der MTT-Lösung aus Schritt 2.1 in serumfreiem Zellkulturmedium (DMEM) hergestellt.
2. Bereiten Sie jeweils 1 ml Stammlösungen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM und 0,01 μM Testverbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Bei -20 °C lagern. 200 μl pro Dosis der Arbeitslösungen von Testverbindungen werden durch Verdünnen von Stammkonzentrationen 1:1000 in serumfreiem Medium in 1,5-ml-Röhrchen hergestellt.
3. In der Gewebekulturhaube Samen von COS-7-Zellen (Afrikanische grüne Affennierenzellen, Cercopithecus aethiops Niere) in vollständigem Medium [DMEM mit 10% fetalem Rinderserum (FBS)] auf flache, gewebekulturbehandelte 96-Well-Platten in einer Konzentration von 4 × 10³ Zellen/200 μL pro Vertiefung unter Verwendung eines Mehrkanalpipettors. COS-7-Zellen wurden ausgewählt, weil (1) dies häufig verwendete Zellen für Zytotoxizitätstests sind und (2) diese bereits in der Einrichtung verfügbar waren.
4. COS-7-Zellen für 24 h bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%_CO2 inkubieren.
5. Saugen Sie den Überstand aus den Vertiefungen mit einer Pasteur-Glaspipette ab, die an einer Vakuumpumpe befestigt ist. Die Zellen werden mit den Prüfsubstanzen unter Verwendung der in Schritt 2.2 hergestellten Arbeitslösungen dreifach dosiert (siehe Tabelle 1). Inkubieren Sie Zellen wie in Schritt 2.4 beschrieben.
6. Asspirieren Sie den Überstand aus den Brunnen. Fügen Sie 200 μL MTT-Lösung in jede Vertiefung hinzu. Bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%_CO2 für 4 h inkubieren.
7. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen ab, ohne die violetten Formazan-Kristalle zu stören. Fügen Sie 200 μL DMSO in jede Vertiefung hinzu, um die violetten Formazankristalle aufzulösen. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
8. Messen Sie die Absorption bei 590 nm¹⁴ oder 600 nm für jede Vertiefung mit einem 96-Well-Plattenleser. Verwenden Sie Vertiefungen ohne Zellen als Hintergrund und mitteln Sie den Absorptionswert. Subtrahieren Sie den gemittelten Extinktionshintergrundwert vom Absorptionswert jeder behandelten Bohrung. Normalisieren Sie die Daten als Prozentsatz des durchschnittlichen Nulldosiswerts (Mittelwert der drei Nulldosiswerte). Diagrammdaten auf der y-Achse: linear (% relative Zelllebensfähigkeit); X-Achse: log (Konzentration). Zeichnen Sie jede Reihe als einzelne Kurve (z. B. sollten dreifache Daten 3 Kurven haben)

Ergebnisse

Die spirozyklischen Oxime 6 und 7 wurden unter Verwendung eines modifizierten Protokolls synthetisiert (Abbildung 1). Michaels Zusatz von Furfurylamin zu einem REM-Linker 1b ergab polymergebundenes Harz 2. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels Infrarotspektroskopie (IR) überwacht, indem das Verschwinden des α,β-ungesättigten Esters bei 1722 ^cm-1 nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Spirozyklisch gebundenes Harz 4 wurde aus 2 über ein transientes Zw...

Diskussion

Die Synthese der spirocyclischen Verbindungen basierte auf früheren Forschungen dieses Labors, jedoch mit einigen Modifikationen (Abbildung 1)^11,12. Der Fortschritt jedes Reaktionsschrittes wurde mittels IR-Spektroskopie überwacht. Michael Zusatz des REM-Linkers 1 mit Furfurylamin ergab polymergebundenes 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 ^cm-1). Aus dem ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELLS
COS-7 cells (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cells
CHEMICALS
1-Bromooctane	Sigma-Aldrich	152951	Alkyl-halide
Allylbromide	Sigma-Aldrich	337528	Alkyl-halide
Benzylbromide	Sigma-Aldrich	B17905	Alkyl-halide
Cisplatin	Cayman Chemical	13119	Cytotoxicity control
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Solvent
Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	Solvent
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	Solvent
DMEM, high glucose, with L-glutamine	Genesee Scientific	25-500	Cell culture media
FBS (Fetal bovine serum)	Sigma-Aldrich	F4135	Cell culture media
Furfurylamine	Acros Organics	119800050	reagent
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566	Alkyl-halide
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Solvent
MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Genesee Scientific	25-507	Cell culture media
REM Resin	Nova Biochem	8551010005	Polymer support; 0.500 mmol/g loading
trans-β-nitrostyrene	Sigma-Aldrich	N26806	Nitro-olefin reagent
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Solvent
Triethylamine (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	Reagent for beta-elimination
Trimethylsilyl chloride (TMSCl)	Sigma-Aldrich	386529	Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas
GLASSWARE/INSTRUMENTATION
25 mL solid-phase reaction vessel	Chemglass	CG-1861-02	Glassware with filter
96 Well plate reader	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	Instrument
AVANCE III NMR Spectrometer	Bruker	N/A	Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	Instrument
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific	757950819	Instrument