استخراج اللجنين فائق السرعة من بقايا ليغنوسيلولوسيك البحر الأبيض المتوسط غير عادية

Summary

المعالجة المسبقة العميقة القائمة على المذيبات eutectic ، بمساعدة الميكروويف هي عملية خضراء وسريعة وفعالة للكسر الليجنسيلوزي واستعادة اللجنين عالية النقاء.

Abstract

المعالجة المسبقة لا تزال الخطوة الأكثر تكلفة في عمليات التحلل الحيوي lignocellulosic. ويجب أن تكون فعالة من حيث التكلفة عن طريق تقليل الاحتياجات الكيميائية وكذلك استهلاك الطاقة والحرارة واستخدام المذيبات الصديقة للبيئة. المذيبات eutectic العميق (DESs) هي المذيبات الرئيسية والخضراء ومنخفضة التكلفة في المقومات الحيوية المستدامة. وهي خليط شفاف يتميز بانخفاض نقاط التجمد الناتجة عن مانح واحد على الأقل لسندات الهيدروجين ومقبول واحد لسندات الهيدروجين. على الرغم من أن DESs تعد المذيبات، فمن الضروري الجمع بينها مع تكنولوجيا التدفئة الاقتصادية، مثل إشعاع الميكروويف، لتحقيق ربحية تنافسية. إشعاع الميكروويف هو استراتيجية واعدة لتقصير وقت التدفئة وزيادة الكسر لأنه يمكن أن يحقق بسرعة درجة الحرارة المناسبة. وكان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير خطوة واحدة، وطريقة سريعة لتفتيت الكتلة الحيوية واستخراج اللجنين باستخدام مذيب منخفض التكلفة وقابل للتحلل الحيوي.

في هذه الدراسة، تم إجراء المعالجة المسبقة DES بمساعدة الميكروويف لمدة 60 s في 800 W، وذلك باستخدام ثلاثة أنواع من DESs. تم إعداد مخاليط DES بسهولة من كلوريد الكولين (ChCl) وثلاثة متبرعين بسندات الهيدروجين (HBDs): حمض أحادي الكاربوكسيليك (حمض اللاكتيك) وحمض ديكاربوكسيليك (حمض الأوكسيليك) واليوريا. وقد استخدم هذا المعالجة المسبقة كتجزئة الكتلة الحيوية واستعادة اللجنين من المخلفات البحرية (أوراق بوسيدونيا وأيغاغروبيل)، ونواتج الأغذية الزراعية الثانوية (قذائف اللوز وبوماس الزيتون)، ومخلفات الغابات (الصنوبر)، والأعشاب الليجنوسيلولوسية المعمرة(ستيبا تيناسيما). وأجريت تحليلات أخرى لتحديد الغلة والنقاء وتوزيع الوزن الجزيئي لللجنين المسترد. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد تأثير DESs على المجموعات الوظيفية الكيميائية في اللجنين المستخرج من خلال التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء (FTIR) لتحويل فورييه. وتشير النتائج إلى أن خليط حمض ChCl-oxalic يوفر أعلى نقاء اللجنين وأقل عائد. وتبين هذه الدراسة أن عملية الميكروويف DES هي تكنولوجيا فائقة السرعة والكفاءة وتنافسية من حيث التكلفة لعملية تجزئة الكتلة الحيوية الليجنوسيلولوسية.

Introduction

عمليات التجقيم البيولوجي المستدامة تدمج معالجة الكتلة الحيوية، وتجزئةها في جزيئات ذات أهمية، وتحويلها إلى منتجات ذات قيمة مضافة¹. في الجيل الثاني من إعادة اكتشاف الحيوانات، يعتبر المعالجة المسبقة ضرورية يجزئ الكتلة الحيوية إلى مكوناتها الرئيسية^2. وقد طبقت على نطاق واسع طرق المعالجة المسبقة التقليدية التي تستخدم الاستراتيجيات الكيميائية أو الفيزيائية أو البيولوجية³. ومع ذلك ، يعتبر هذا المعالجة المسبقة الخطوة الأغلى في التجريب الحيوي ولها عيوب أخرى مثل وقت المعالجة الطويل ، وارتفاع الحرارة واستهلاك الطاقة ، والشوائب المذيبات⁴. في الآونة الأخيرة ، ظهرت DESS ، التي تشبه خصائصها تلك السوائل الأيونية³، كمذيبات خضراء بسبب مزايا مثل التحلل الحيوي ، والملاءمة للبيئة ، وسهولة التركيب ، والتعافي بعد العلاج⁵.

DESs هي خليط من واحد على الأقل HBD، مثل حمض اللبنيك، حمض ماليك، أو حمض الأوكسيليك، ومقبول السندات الهيدروجين (HBA) مثل البيتين أو كلوريد الكولين (ChCl)⁶. تمكن تفاعلات HBA-HBD من آلية تحفيزية تسمح بانشقاق الروابط الكيميائية ، مما يسبب تجزئة الكتلة الحيوية وفصل اللجنين. وقد أبلغ العديد من الباحثين عن المعالجة المسبقة المستندة إلى DES ل المواد الأولية الليجنوسيلولوسية مثل ChCl-glycerol على كوب الذرة وstover^7،8، ChCl-urea ، وحمض ChCl-oxalic على قش القمح⁹، حمض ChCl-lactic على نشارة الخشب الأوكالبتوس ¹⁰، وحمض ChCl-الخليك¹¹ و ChCl-الإيثيلين غليكول على الخشب¹¹. لتحسين كفاءة DES ، يجب الجمع بين المعالجة المسبقة ومعالجة الميكروويف لتسريع تجزئة الكتلة الحيوية^5. وقد أبلغ العديد من الباحثين مثل هذا المعالجة المسبقة مجتمعة (DES والميكروويف) من الخشب⁸ وstover الذرة, switchgrass, وMiscanthus⁵, الذي يوفر نظرة جديدة في قدرة DESs للكسر lignocellulosic واستخراج اللجنين في خطوة واحدة سهلة على مدى فترة قصيرة.

اللجنين هو جزيء فينولي يسمر كمادة خام لإنتاج البوليمرات الحيوية ويقدم بديلا لإنتاج المواد الكيميائية مثل مونومرات العطرية وoligomers¹². بالإضافة إلى ذلك ، اللجنين لديه أنشطة امتصاص مضادات الأكسدة والأشعة فوق البنفسجية¹³. وقد ذكرت العديد من الدراسات تطبيقات اللجنين في مستحضرات التجميل^14،15. وقد أدى دمجها في منتجات واقية من الشمس التجارية إلى تحسين عامل الحماية من الشمس (SPF) للمنتج من SPF 15 إلى SPF 30 مع إضافة 2 wt ٪ فقط من اللجنين وحتى SPF 50 مع إضافة 10 wt ٪ lignin¹⁶. تصف هذه الورقة نهجا فائق السرعة لانشقاق اللجنين والكربوهيدرات ، بمساعدة المعالجة المسبقة المشتركة ل DES-microwave للكتلة الحيوية المتوسطية. وتتألف هذه الكتلة الحيوية من منتجات ثانوية للأغذية الزراعية، ولا سيما بوماس الزيتون وقذائف اللوز. وكانت الكتلة الأحيائية الأخرى التي تم التحقيق فيها هي تلك التي من أصل بحري (أوراق بوسيدونيا وأيغاغروبيل) وتلك التي نشأت من غابة (الصنوبر والأعشاب البرية). كان تركيز هذه الدراسة على اختبار المذيبات الخضراء منخفضة التكلفة لتقييم آثار هذا المعالجة المسبقة المشتركة على تجزئة المواد الخام ، والتحقيق في تأثيرها على نقاء اللجنين والغلة ، ودراسة آثاره على الأوزان الجزيئية والمجموعات الوظيفية الكيميائية في اللجنين المستخرج.

Protocol

1. إعداد الكتلة الحيوية

1. تجفيف الكتلة الحيوية
   1. وضع أوراق بوسيدونيا وكرات aegagropile (Posidonia oceanica), حصادها من شواطئ البحر الأبيض المتوسط, في فرن في 40 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
   2. ضع قذائف اللوز(Prunus dulcis)،ولدت من الصناعات الغذائية، والزيتون pomace(Olea europaea L.)، التي تم الحصول عليها من مصانع زيت الزيتون، في فرن في 40 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
   3. وضع الصنوبر (بينوس halepensis), جمعت من غابة, وأوراق ألفا (ستيبا tenacissima), جمعت من حوض جنوب البحر الأبيض المتوسط, في فرن في 40 درجة مئوية ل 72 ح.
      ملاحظة: إذا كانت الكتلة الحيوية تحتوي على الرمل، يجب شطفه بالماء المقطر قبل وضعه في الفرن. تظهر الكتلة الحيوية في الشكل 1A-F.
2. طحن الكتلة الحيوية
   1. ضع 20 غرام من كل كتلة حيوية في قاطع مطرقة مجهز بغربال 1 ملم. جمع مسحوق الناتجة في كوب 0.25 لتر وإطعامه إلى قاطع مطرقة مجهزة منخل 0.5 ملم. جمع مسحوق في كوب 0.25 لتر.

2. الميكروويف بمساعدة، استخراج اللجنين فائق السرعة

1. إعداد المذيبات eutectic العميق (DES)
   1. إعداد DES1 (حمض ChCl-oxalic) في نسبة الضرس من 1:1 عن طريق خلط 174 غرام من ChCl مع 126 غرام من حمض الأوكسيليك ديهيدرات في قارورة 500 مل ذهابا وإيابا وذوبانها في حمام في 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعة حتى يتم تشكيل سائل متجانس وشفاف.
   2. إعداد DES2 (حمض ChCl-lactic) في نسبة الضرس من 1:1 عن طريق خلط 174 غرام من ChCl مع 90 غرام من حمض اللبنيك في قارورة 500 مل ذهابا وإيابا وذوبانها في حمام في 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعة حتى يتم تشكيل سائل متجانس وشفاف.
   3. إعداد DES3 (ChCl-urea) في نسبة الضرس من 1:12 عن طريق خلط 174 غرام من ChCl مع 120 غرام من اليوريا في قارورة 500 مل ذهابا وإيابا وذوبانها في حمام في 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعة حتى يتم تشكيل سائل متجانس وشفاف.
      ملاحظة: يحرك هذه الخلائط باستمرار مع شريط تحريك في 500 دورة في الدقيقة.
2. العلاج المدمج بالميكروويف-DES
   1. ضع 5 غرام من المواد الخام في ميكروويف في مفاعل البوليتيترافلوروإيثيلين المغلق. إضافة 50 مل من DES، ووضع شريط اثارة في العينة. أغلق حاوية الميكروويف بغطاء مناسب، واربط غطاء درجة الحرارة.
   2. ضع حاوية الميكروويف على حافة القرص الدوار، وتأكد من أنها مهتاجة باستمرار. ضبط طاقة الميكروويف في 800 واط لمدة دقيقة واحدة. باستخدام قفازات مناسبة، أخرج الحاوية من الميكروويف، ودع الخليط يبرد. كرر هذا العلاج باستخدام DESs الثلاثة لكل عينة من عينات الكتلة الحيوية.
      ملاحظة: تحقق وتأكد من أن درجة الحرارة المسبار هو وضع صحيح، وحاوية الميكروويف لديه درجة حرارة متجانسة.
3. عزلة اللجنين
   1. إعداد المحلول المتجانسة المذيبات عن طريق خلط الإيثانول: الماء في نسبة 50:50 (v:v). إضافة 50 مل من المحلول المضاد للمذيبات إلى المواد الخام المعالجة، ووضع الخليط في حاوية الطرد المركزي (250 مل)، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 × ز.
   2. بعد الطرد المركزي، فلتر الناموست (الكسر الغني باللجنين) باستخدام بوتقة فلتر زجاجي (المسامية 4، 10-16 ميكرومتر، قطر 10 ملم). غسل بقايا السليلوز المتبقية التي تم جمعها بعد الطرد المركزي مع 25 مل من المحلول المضاد للمذيبات.
   3. جهاز الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 5 دقائق بعد كل غسل. كرر يغسل 4x، وجمع وتصفية يغسل من خلال بوتقة فلتر الزجاج (المسامية N 4، 10-16 ميكرومتر، قطر 10 ملم).
   4. أضف الكسر الغني باللجنين المصفى من الخطوة 2.3.2 إلى الغسالات المصفاة من الخطوة 2.3.3 في قارورة قاع مستديرة سعة 500 مل. تبخر الإيثانول باستخدام المبخر الدوار عند 50 درجة مئوية و 110 مببار.
   5. أضف 150 مل من الماء المتأين إلى الخمور المركزة (جزء غني باللجنين) ، وعجل باللجنين عن طريق الطرد المركزي. جمع اللجنين كبيليه، وغسله مع 25 مل من الماء المقطر. كرر يغسل 4x. الليوفليزي اللجنين، أو يجفف في فرن في 40 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، وغسل اللجنين >4x لإزالة الأملاح من المذيبات.
   6. استخدم الصيغة التالية لتحديد العائد:
      
      ملاحظة: كما تم تنفيذ استخراج اللجنين مع اثنين من DESs أخرى: كلوريد الكولين + ريسورسينول وكلوريد الكولين + حمض بوتيريك في 1 دقيقة. ومع ذلك، كانت كميات اللجنين المستردة باستخدام هذه DESs صغيرة للغاية (وغير قابلة للاسترداد) مقارنة بالمبالغ التي تم الحصول عليها باستخدام DESs الثلاثة الأخرى.

3. تحديد نقاء اللجنين المستخرج من قبل كلاسون

1. إعداد عينة لتحلل كلاسون المائي
   1. ضع عامل التصفية البوتقة (المسامية 4، القطر 4.5 مم) في فرن كاتم في 550 درجة مئوية لمدة 4 ساعة (2 ساعة منحدر، من 25 درجة مئوية). أزيلي البوتقة عندما يبرد الفرن إلى 150 درجة مئوية، وضعيه في مجفف ليبرد، ويزن.
   2. إضافة ما يقرب من 30 ملغ من اللجنين في أنبوب زجاجي borosilicate (انظر جدول المواد)،ونلاحظ وزن العينة. أضف 1 مل من حمض الكبريتيك بنسبة 72٪ (H₂SO₄₎إلى العينة، وضع العينة في حمام 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، واخلط كل 10 دقائق عن طريق الدوامة.
   3. إزالة العينة، ونقلها إلى زجاجة 100 مل، وإضافة 28 مل من الماء المقطر لتخفيف حمض إلى تركيز 4٪. ضع الزجاجة في الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. إزالة زجاجة، والسماح لها لتبرد.
2. تحليل اللجنين غير القابل للذوبان في الحمض
   1. تصفية التحلل المائي باستخدام بوتقة تحت فراغ. جمع جميع المواد الصلبة في زجاجة تحتوي على المياه deionized. شطف بوتقة مع 50 مل من الماء deionized.
   2. جفف البوتقة التي تحتوي على المواد الصلبة عن طريق وضعها في الفرن عند 105 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. إزالة بوتقة من الفرن، ووضعها في مجفف، والسماح لها لتبرد. وزن العينة.
   3. ضع البوتقة في فرن كاتم عند 550 درجة مئوية لمدة 4 ساعة (2 ساعة منحدر). إزالته ووضعه في مجفف. وزن العينة.
   4. استخدم الصيغة التالية لحساب النسبة المئوية للبقايا غير القابلة للذوبان في الحمض (AIR):
      
      WCSA: وزن البوتقة + عينة بعد إزالتها من الفرن
      مرحاض: وزن بوتقة
      WCSMF: وزن بوتقة بعد إزالته من فرن كاتم الصوت
      ODW: الفرن الجاف وزن العينة
3. تحليل اللجنين القابل للذوبان في الحمض
   1. قياس امتصاص الخيوط التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.1 مع مطياف في 205 نانومتر باستخدام كوفيتس الكوارتز. استخدام الماء المقطر كما فارغة.
   2. استخدم الصيغة التالية لحساب النسبة المئوية للبقايا القابلة للذوبان في الحمض (ASL):
      
      ملاحظة: يجب أن يكون الامتصاص بين 0.2 و 0.7. تمييع العينة إذا لزم الأمر.
      UVabs: الامتصاص في 205 نانومتر
      Pathlength: مسار الضوء لخلية القياس (بالسم)
      ε: امتصاص الكتلة الحيوية على طول موجي محدد

4. محتوى النيتروجين في اللجنين المستخرج

1. إعداد محلول القلويات
   1. في قارورة حجمية 2.5 لتر، تزن 1 كجم من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) وإضافة الماء المؤين حتى العلامة. ضع شريط مغناطيسي في القارورة، وحرك حتى يذوب NaOH تماما.
2. إعداد محلول حمض الكبريتيك
   1. خذ 0.1 N H₂SO₄ (انظر جدول المواد)في قارورة حجمية 5 L، وأضف الماء المؤين حتى علامة 5 لتر، وضع شريط مغناطيسي، وحرك حتى تذوب المحتويات.
3. إعداد الحل المتلقي
   1. في قارورة حجمية 5 لتر، حل 100 غرام من H₃BO₃ (حمض البوريك) في الماء deionized، وإحضار حجم إلى العلامة.
   2. وزن 100 ملغ من بروموبريسول الأخضر في قارورة الحجم 100 مل، وإضافة الميثانول التقنية تصل إلى العلامة.
   3. وزن 100 ملغ من الميثيل الأحمر في قارورة الحجم 100 مل، وإضافة الميثانول التقنية تصل إلى العلامة.
   4. صب 5 لتر من H₃BO₃ الحل من الخطوة 4.3.1، 100 مل من الحل الأخضر بروموبريسول من الخطوة 4.3.2، 70 مل من محلول أحمر الميثيل من الخطوة 4.3.3، و 5 لتر من المياه deionized في حاوية. هز الحل المتلقي جيدا لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون اللون النهائي للحل أخضر. إذا كان اللون غير أخضر، أضف 50 مل من محلول N NaOH واحد.
4. إعداد العينة
   1. في أنبوب Kjeldahl، ضع 100 ملغ من اللجنين وزنها على ورقة خالية من النيتروجين، إضافة قرص من Kjeldhal (1.5 غرام كبريتات البوتاسيوم (K₂SO₄) + 0.045 غرام من النحاس كبريتات pentahydrate (CuSO_4.5H2O) + 0.045 غرام ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO_2))،وإضافة 7.2 مل من تركيز H₂SO₄.
      ملاحظة: استخدم أربعة أنابيب مع ورق خالي من النيتروجين فقط (بدون العينات) كفراغات.
5. عينة الهضم
   1. قم بتشغيل منظم الحرارة على هاضم 1 ساعة مقدما عند 360 درجة مئوية.
   2. ضع أنابيب العينة على رف، وضع أربعة أنابيب فارغة في الزوايا الأربع للرف، وملء الثقوب (إن وجدت) من الرف مع أنابيب فارغة.
   3. ضع الحامل في هاضم مسخن مسبقا، وتغطية نظام الشفط، وفتح مضخة المياه.
      ملاحظة: الحرص على تجنب الأبخرة; زيادة تدفق المياه إذا ظهرت الأبخرة.
   4. بعد 2 ساعة، إيقاف التدفئة، وإزالة العينات، ووضعها على دعم معدني. السماح للرف لتبرد لمدة 40 دقيقة تقريبا مع نظام الشفط على.
6. إجراء التقطير في كيلدال
   1. قم بتشغيل تقطير Kjeldahl. السماح بتشغيل الاختبارات الذاتية حتى يظهر التحديد على الشاشة. قم بالتبديل إلى الوضع اليدوي، وأدخل أنبوبا فارغا، واغلق الباب المنزلق.
   2. تطهير بوريت titrant (0.02 N H₂SO₄₎(رفع الغطاء) عن طريق الضغط عليه في الجزء السفلي والعازل عدة مرات، والقضاء على فقاعات الهواء من الأنابيب عن طريق الضغط على أنبوب من H₂SO₄ زجاجة. أغلق غطاء محرك السيارة.
   3. قم بتطهير H₃BO₃ تلقي الحل 3x.
   4. أضف الماء 3x، والتبديل إلى البخار النشط (10 دقيقة). انتقل إلى برنامج تحليل Kjeldahl 1. أدخل بلانكو باستخدام الأسهم على مستوى خط النتيجة.
   5. أدخل الأنبوب. ابدأ بالفراغات الأربعة، واحسب متوسطاتها. أدخل القيمة في سطر بلانكو.
      ملاحظة: بعد إدخال الأنبوب، يضيف الجهاز تلقائيا وتتابعا 30 مل من H₂O و30 مل من H₃BO₃و40 مل من 10 N NaOH.
   6. التبديل إلى مل من titrant عند خط النتيجة. أدخل الأنبوب، ولاحظ مقدار H₂SO₄ المستخدم.
      ملاحظة: لاختبار تقطير Kjeldahl, النظر في أن 50 ملغ من الجلسرين تتوافق مع 18.60٪ ± 5٪ N. في نهاية كل عملية تحديد، يقوم الجهاز تلقائيا بإفراغ الأنبوب وتنظيفه.
   7. حساب النسبة المئوية ل N.
      
      V s.a : حجم حمض الكبريتيك
      T S.A : 0.02 N H₂SO₄
      S: عينة كتلة

5. محتوى الرماد في اللجنين المستخرج

1. جفف البوتقة الخزفية لمدة ساعة واحدة عند 105 درجة مئوية. اتركها لتبرد في مجفف.
2. وزن بوتقة، ونلاحظ رقمه. إضافة ما يقرب من 1 غرام من مسحوق العينة. ضع البوتقة في فرن الكتومة مع البرنامج التالي: منحدر 2 ساعة حتى 575 درجة مئوية؛ هضبة من 4 ساعة في 575 درجة مئوية.
3. اتركي الفرن ليبرد إلى 100 درجة مئوية. إزالة البوتقة، ووضعها في المجفف، ووزنها.

6. محتوى الكربوهيدرات

1. إعداد بوروهيدريد الصوديوم (NaBH₄₎/ ثنائي ميثيل سلف أكسيد (DMSO) الحل
   1. ضع 2 غرام من NaBH₄ في قارورة حجمية سعة 100 مل، واملأ العلامة باستخدام DMSO. الحرارة إلى 100 درجة مئوية في حمام العمدة، ويحرك الحل حتى يذوب تماما.
2. إعداد حل MIX
   1. ضع 20 ملغ كل من الزيلوز، أرابينوس، رهامنوس، الجلوكوز، الجالاكتوز، المانوز، و 2-deoxyglucose في قارورة حجمية 100 مل، وملء ما يصل إلى علامة 100 مل مع الماء التأين.
3. التحلل المائي للعينة
   1. وزن عينة 50 ملغ من اللجنين في أنبوب زجاجي borosilicate, إضافة 3 مل من 1 م_{H 2}SO_4,وتسخين الخليط لمدة 3 ح في 100 درجة مئوية.
   2. قم بتهدئة العينة، وأضف 1 مل من هيدروكسيد الأمونيوم 15 M (NH₄OH)، وتحقق من درجة الحموضة للتأكد من أنها محايدة أو قلوية. أضف بالضبط 1 مل من المعيار الداخلي (2-deoxyglucose) إلى كل عينة.
      ملاحظة: 2-deoxyglucose المضافة كمعيار داخلي يجعل من الممكن تحديد كمية كل جرعة موجودة في العينة.
4. الحد من وخلات السكريات الأحادية في خلات الألديتول
   1. خذ 400 ميكرولتر من الحل من الخطوة 6.3.2، وضعه في أنابيب خاصة. خذ 400 ميكرولتر من محلول MIX للتحكم، وضعه في أنابيب خاصة.
      ملاحظة: استخدام الحل MIX يسهل حساب عوامل الاستجابة (RFs) ونسبة الشاريد الأحادي.
   2. إضافة 2 مل من الحل NaBH₄/DMSO المعدة في القسم 6.1. أغلق الأنبوب، واحتضن لمدة 90 دقيقة عند 40 درجة مئوية في حمام مائي. إزالة أنبوب من حمام الماء، وإضافة 0.6 مل من حمض الخليك الجليدي.
      ملاحظة: بما أن هذا هو رد فعل طارد للحرارة، ستظهر فقاعات ودخان.
   3. إضافة ما يقرب من 0.4 مل من 1-ميثيليميدازول وحوالي 4 مل من أنهيدريد الخليك. بعد 15 دقيقة، إضافة 10 مل من الماء المقطر، بارد، وإضافة ~ 3 مل من ثنائي كلورو الميثان (CH₂Cl₂).
   4. بعد 2 ساعة على الأقل، جمع ~ 1 مل من المرحلة السفلية (العضوية)، وحقنه في كروماتوجراف الغاز مجهزة عمود الشعيرات الدموية كاشف تأين اللهب، HP1-ميثيلسيلوكسيان (30 مترا (طول) × 320 ميكرومتر (القطر الداخلي)، 0.25 ميكرومتر (سمك الفيلم)). تحليل البيانات.
   5. استخدم الصيغة التالية لحساب عامل الاستجابة (RF).
      
      ص م: متوسط مساحة ذروة أحادية السكريد في حل MIX
      M. ح من 2 - الجلوكوز ديوكسي: كتلة من 2-deoxyglucose بعد التحلل المائي
      2dg. ع: متوسط مساحة ذروة 2-deoxyglucose في حل MIX
      م ح من مونوساكريد: كتلة من السكر الأحادي بعد التحلل المائي
      ملاحظة: تصحيح أنهيدرو هو 0.8 للرهامنوس، 0.88 للأرابينوز والزيلوز، و 0.9 للمانوز والجلوكوز والجالاكتوز. كتلة بعد التحلل المائي = تصحيح أنهيدرو x كتلة (ز) من مونوساكريد المستخدمة في حل MIX.
   6. استخدم الصيغة التالية لحساب كتلة الشاريد الأحادي.
      
      ا ف ب. م: منطقة ذروة أحادية الشاريد في العينة التي تم تحليلها
      م. هو: كتلة من المعايير الداخلية المضافة؛ هنا، سي سي = 1 ملغم/مل
      AP.2: منطقة الذروة من 2-deoxyglucose في العينة
      RF: عامل الاستجابة
   7. حساب النسبة المئوية لكل أحادية الشاريد باستخدام الصيغة التالية.
      

7. وظائف الكيميائية في استخراج اللجنين (فورييه تحول الأشعة تحت الحمراء)

1. لتحديد المجموعات الوظيفية الكيميائية في اللجنين المستخرج، استخدم مطياف FT-IR مجهزا بوحدة عاكسة إجمالية مخففة (ATR). فتح برنامج التحليل الطيفي، وضبط المعلمات: القرار 4 سم^-1،عينة المسح الضوئي الوقت 32، وقت مسح الخلفية 16، حفظ البيانات من 4000 إلى 400 سم^-1،نتيجة الإرسال الطيف.
2. لا تقم بإضافة أي نموذج; الصحافة الخلفية قناة واحدة. الآن ضع 1 ملغ من العينة على الكريستال، واضغط عينة قناة واحدة. معالجة الأطياف التي تم الحصول عليها.

8. الوزن الجزيئي لللجنين المستخرج (كروماتوغرافيا تتغلغل هلام)

1. إعداد حل ثنائي ميثيلفورماميد (DMF) مع كلوريد الليثيوم 0.5٪ (LiCl). خذ 5 غرام من LiCl في قارورة حجمية 1 L ، وأضف DMF إلى خط القياس ، واخلط المحتويات حتى يتم الحصول على سائل متجانس.
2. حل 3 ملغ من عينة اللجنين في 3 مل من DMF مع 0.5٪ LiCl. جهاز طرد مركزي في أنبوب طرد مركزي سعة 10 مل، وفصل الكسر القابل للذوبان إلى قارورة.
3. حل 3 ملغ من البوليسترين القياسية 1 كدا, 2 كدا, 3 كدا, 10 كدا, 20 كدا, و 30 كدا في حل DMF مع 0.5٪ LiCl. الطرد المركزي في 10 مل أنابيب زجاجية borosilicate، ونقل جزء قابل للذوبان إلى قارورة.
4. إعداد نظام لوني-فوق بنفسجي سائل عالي الأداء ..
   1. افتح نظام البيانات، وتحقق من كاشف الأشعة فوق البنفسجية.
   2. تطهير النظام بالماء المقطر. تثبيت المكبس في eluent (DMF مع 0.5٪ LiCl). افتح صمام التطهير، واطهر الخط بمعدل تدفق يبلغ 1 مل/دقيقة لمدة 15 دقيقة. وقف تدفق وإغلاق صمام التطهير.
   3. تعيين معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة لمدة 10 دقائق لتنظيف مسار eluent إلى الكاشف. إيقاف معدل التدفق.
   4. تثبيت العمود مسبوقة عمود حراسة (راجع جدول المواد). قم بتشغيل سخان العمود عند 45 درجة مئوية، ثم قم بتشغيل كاشف الأشعة فوق البنفسجية، وحدد معدل التدفق تدريجيا حتى يتم الوصول إلى معدل تدفق يبلغ 0.6 مل/دقيقة.
   5. حقن 30 ميكرولتر من كل عينة لمدة 40 دقيقة على طول موجي من 270 نانومتر. معالجة البيانات التي تم الحصول عليها، وحساب التوزيع الشامل باستخدام خط المعايرة.
   6. حساب متوسط الوزن الجزيئي (Mn) ومتوسط الوزن الوزن الجزيئي (Mw) ومؤشر تعدد التخصصات (PDI).
      
      
      
      مي: الوزن الجزيئي لسلسلة
      Ni: عدد السلاسل لهذا الوزن الجزيئي

9. معالجة البيانات والتحليلات الإحصائية

1. إجراء جميع التجارب التحليلية في ثلاثية الطبيعة والتعبير عن النتائج كنسبة مئوية من المادة الجافة.
2. إجراء تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA)، ومقارنة الوسائل باستخدام اختبار المقارنة المتعدد ل Tukey.
3. إجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA).

النتائج

الشكل 2A-C تصور غلة اللجنين لاستخراج من المواد الخام الستة، هو مبين في الشكل 1A-F، بعد المعالجة المسبقة للميكروويف DES مجتمعة. تظهر النتائج أن غلة اللجنين التي تم الحصول عليها مع DES1 (حمض ChCl-oxalic) (الشكل 2A

Discussion

وكان لهذه الدراسة أهداف عديدة؛ وكان أولها إعداد واستخدام المذيبات الخضراء منخفضة التكلفة مع خصائص كل من السوائل الأيونية والمذيبات العضوية. وكان الهدف الثاني هو تجزئة الكتلة الحيوية واستخراج اللجنين في خطوة واحدة، دون الحاجة إلى خطوات أولية مثل استخراج المواد القابلة للاستخراج باستخدا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC Gel Permeation Chromatography	Agilent 1200 series
1 methylimadazole	Acros organics
2-deoxy-D-glucose (internal standard)	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Acetic acid	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Acetic anhydride	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Adjustables pipettors
Alkali			alkali-extracted lignin
Arabinose (99%)	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Autoclave	CERTO CLAV (Model CV-22-VAC-Pro)
Water Bath at 70 °C
Boric acid	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Bromocresol	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Catalyst	CTQ (coded A22) (1.5 g K2SO4 + 0.045 g CuSO4.5 H2O + 0.045 g TiO2)	Merck
Centrifugation container
Centrifuge	BECKMAN COULTER	Avanti J-E centrifuge
Ceramic crucibles
Choline chloride 99%	Acros organics
Column	Agilent PLGel Mixed C (alpha 3,000 (4.6 × 250 mm, 5 µm) preceded by a guard column (TSK gel alpha guard column 4.6 mm × 50 mm, 5 µm)
Column	HP1-methylsisoxane (30 m, 0.32 mm, 0.25 mm)
Crucible porosity N°4 ( Filtering crucible)	Shott Duran Germany	boro 3.3
Deonized water
Dessicator
Dimethylformamide	VWR BDH Chemicals
Dimethylsulfoxide	Acros organics
Erlenmeyer flask
Ethanol	Merck (Darmstadtt, Germany)
Filtering crucibles, procelain
Filtration flasks
Fourrier Transformed Inra- Red	Vertex 70 Bruker apparatus equipped with an attenuated total reflectance (ATR) module. Spectra were recorded in the 4,000–400 cm−1 range with 32 scans at a resolution of 4.0 cm−1
Galactose (98%	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Gaz Chromatography	Agilent (7890 series)
Glass bottle 100 mL
Glass tubes ( borosilicate) with teflon caps 10 mL
Glucose (98%	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Golves
Graduated cylinder 50 mL /100 mL
H2SO4 Titrisol (0.1 N)	Merck (Darmstadtt, Germany)
H2SO4 (95-98%)	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)	BUCHI R-114)
Hummer cutter equiped with 1 mm and 0.5 mm sieve	Mill Ttecator (Sweden)	Cyclotec 1093
Indulin			Raw lignin control
Kjeldahl distiller	Kjeltec 2300 (Foss)
Kjeldahl tube	FOSS
Kjeldhal rack
Kjeldhal digester	Kjeltec 2300 (Foss)
Kjeldhal suction system
Lab Chem station Software			GC data analysis
Lactic acid	Merck (Darmstadtt, Germany)
Lithium chloride LiCl	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Mannose (98%)	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Methyl red
Microwave	START SYNTH MILESTONE Microwave laboratory system
Microwave temperature probe
Microwave container
Muffle Furnace
NaOH	Merck (Darmstadtt, Germany)
Nitrogen free- paper
Opus			spectroscopy software
Oven	GmbH Memmert SNB100	Memmert SNB100
Oxalic acid	VWR BDH Chemicals
P 1000			Soda-processed lignin
pH paper
precision balance
Infrared spectroscopy
Quatz cuvette
Rhamnose (98%)	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Rotary vacuum evaporator	Bucher
Round-bottom flask 500 mL
sodium borohydride NaBH4
Schott bottle			glass bottle
Sovirel tubes	sovirel		Borosilicate glass tubes
Spatule
Special tube
Spectophotometer	UV-1800 Shimadzu
Sterilization indicator tape
Stir bar in teflon
Stirring plate
Syringes
Sodium borohydride	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)
Titrisol	Merck	Merck 109984	0.1 N H2SO4
Urea	VWR BDH Chemicals
Vials
VolumetriC flask 2.5 L /5 L	Bucher
Vortex
Xylose (98%)	Sigma Aldrich (St. Louis, USA)