JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول بناء نظام في المختبر للفيزياء الدقيقة لدراسة سرطان الثدي باستخدام أنسجة الثدي البشرية الأولية مع مواد خارج الجرف.

Abstract

لا يزال سرطان الثدي (BC) سببا رئيسيا لوفاة النساء. على الرغم من استثمار أكثر من 700 مليون دولار في أبحاث BC سنويا ، فإن 97٪ من أدوية BC المرشحة تفشل في التجارب السريرية. لذلك ، هناك حاجة إلى نماذج جديدة لتحسين فهمنا للمرض. تم تطوير برنامج النظم الفيزيائية الدقيقة (MPS) التابع للمعهد القومي للصحة لتحسين الترجمة السريرية لاكتشافات العلوم الأساسية والاستراتيجيات العلاجية الجديدة الواعدة. هنا نقدم طريقة لتوليد MPS لسرطان الثدي (BC-MPS). هذا النموذج يتكيف مع نهج وصفها سابقا من زراعة الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية الأولية (WAT) عن طريق شطيرة وات بين أوراق الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC)ق. وتشمل الجوانب الجديدة من قبل الميلاد لدينا MPS بذر خلايا BC في أنسجة الثدي البشرية غير المريضة (HBT) التي تحتوي على مصفوفة خارج الخلية الأصلية، الخلايا الدهنية ناضجة، الخلايا الليفية المقيمة، والخلايا المناعية؛ وسند المزيج BC-HBT بين أوراق ASC المشتقة من HBT. الناتجة قبل الميلاد MPS مستقرة في الثقافة ex vivo لمدة 14 يوما على الأقل. يحتوي هذا النظام النموذجي على عناصر متعددة من البيئة الدقيقة التي تؤثر على BC بما في ذلك الخلايا الدهنية والخلايا النجمية والخلايا المناعية والمصفوفة خارج الخلية. وبالتالي يمكن استخدام BC-MPS لدراسة التفاعلات بين قبل الميلاد وضواحيها الدقيقة.

نحن نظهر مزايا BC-MPS لدينا من خلال دراسة اثنين من السلوكيات قبل الميلاد المعروفة للتأثير على تطور السرطان والانبثاث: 1) قبل الميلاد الحركة و 2) قبل الميلاد-HBT الأيضية الحديث. في حين سبق أن ثبت حركة BC باستخدام التصوير داخل الحتمية ، BC-MPS يسمح للتصوير الفاصل الزمني عالية الدقة باستخدام المجهر الفلوري على مدى عدة أيام. وعلاوة على ذلك، في حين تم عرض الحديث الأيضي سابقا باستخدام خلايا BC وخلايا مورين قبل الدهون المتمايزة إلى خلايا شحمية غير ناضجة، فإن نموذج BC-MPS لدينا هو أول نظام لإثبات هذا الكلام المتقاطع بين الخلايا الدهنية الثديية البشرية الأولية وخلايا BC في المختبر.

Introduction

كل عام، أكثر من 40،000 امرأة أمريكية تموت من سرطان الثدي (قبل الميلاد)1. على الرغم من أكثر من 700 مليون دولار استثمرت في البحوث قبل الميلاد سنويا، 97٪ من الأدوية قبل الميلاد مرشح تفشل التجارب السريرية2،3. هناك حاجة إلى نماذج جديدة لتحسين خط أنابيب تطوير الأدوية وفهمنا لإدراك BC. حدد برنامج المعاهد القومية للصحة الفيزيائية الدقيقة (MPS) الميزات المطلوبة لنماذج اختراق لتحسين ترجمة العلوم الأساسية إلى نجاح سريري4. وشملت هذه استخدام الخلايا البشرية الأولية أو الأنسجة، ومستقرة في الثقافة لمدة 4 أسابيع، وإدراج بنية الأنسجة الأصلية والاستجابة الفسيولوجية.

نماذج المختبر BC الحالية، مثل الثقافة ثنائية الأبعاد لخطوط خلايا BC، وإدراج الغشاء الثقافة المشتركة، والشفرات ثلاثية الأبعاد والأعضاء، لا تفي بمعايير MPS في المعاهد القومية للصحة لأن أيا من هذه إعادة رسملة العمارة أنسجة الثدي الأصلية. عندما تضاف مصفوفة خارج الخلية (ECM) إلى هذه الأنظمة، لا يتم استخدام ECM الثدي. بدلا من ذلك، يتم استخدام المواد الهلامية الكولاجين ومصفوفات غشاء الطابق السفلي.

الحالية في النظم الحية، مثل xenografts المريض المستمدة (PDX)، وبالمثل لا تفي بمعايير MPS المعاهد القومية للصحة لأن الأنسجة الثديية مورين تختلف اختلافا كبيرا عن الثديين البشري. وعلاوة على ذلك، يتم الاعتراف بشكل متزايد التفاعلات بين الجهاز المناعي قبل الميلاد كمفتاح في تطور الورم، ولكن نماذج المورين المناقصة المناعية المستخدمة لتوليد أورام PDX تفتقر إلى الخلايا التائية الناضجة، والخلايا B، والخلايا القاتلة الطبيعية. وعلاوة على ذلك، في حين يسمح PDX لأورام الثدي الأولية للحفاظ على وتوسيعها، يتم اختراق الأورام PDX الناتجة مع الخلايا سترومال مورين الأولية وECM5.

للتغلب على هذه التحديات، قمنا بتطوير رواية، فيفو، MPS الثدي البشري ثلاثي الأبعاد التي تلبي معايير MPS المعاهد القومية للصحة. يتم إنشاء أساس MPS الثدي لدينا عن طريق شطيرة أنسجة الثدي البشرية الأولية (HBT) بين ورقتين من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASCs)، معزولة أيضا عن HBT (الشكل 1). المكبس لنقل أوراق الخلية إلى شطيرة HBT يمكن أن تكون مطبوعة 3D أو مصنوعة من البلاستيك الاكريليك بسيطة (الشكل 1H، I). هذه التقنية تتكيف مع نهجنا الموصوف سابقا لزراعة الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية الأولية6،7. ويمكن بعد ذلك أن تكون المصنف MPS الثدي من قبل نموذج قبل الميلاد من الاختيار، بدءا من خطوط الخلية قبل الميلاد القياسية لأورام الثدي البشرية الأولية. هنا، نظهر أن هذه BC-MPS مستقرة في الثقافة لعدة أسابيع(الشكل 2)؛ وتشمل العناصر الأصلية من HBT مثل الخلايا الدهنية الثديية, ECM, بطانة الرحم, الخلايا المناعية (الشكل 3); وتلخيص التفاعلات الفسيولوجية بين قبل الميلاد وHBT مثل التحدث الأيضي(الشكل 4). وأخيرا، فإننا نظهر أن BC-MPS يسمح لدراسة حركة الأميبويد من خلايا BC في جميع أنحاء HBT (الشكل 5).

Protocol

تم جمع جميع الأنسجة البشرية وفقا للبروتوكول #9189 كما وافق عليه مكتب مجلس المراجعة المؤسسية في LSUHSC.

1. بذر الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASCs) لأوراق الخلية

  1. شراء ASCs من مصادر تجارية أو عزل من أنسجة الثدي البشرية الأولية باتباع البروتوكولات المعمول بها8،9. بذور الثدي البشري ASCs في كثافة 70٪ (~ 80،000 الخلايا / سم2 مساحة السطح) على لوحات زراعة الأنسجة القياسية 6-جيدا في دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين، و 1٪ البنسلين / ستريبتومايسين (BC-MPS وسائل الإعلام). تأكد من أن ASCs التي ستستخدم لتشكيل أوراق الخلية يجب أن تكون أقل من الممر 10.
    1. لكل بئر من سرطان الثدي نظام الفيزيولوجيا الدقيقة (BC-MPS) التي سيتم إنشاؤها، خلايا البذور في 1 مستوى زراعة الأنسجة بشكل جيد و 1 بئر من حجم مماثل على بولي (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm) المغلفة الأنسجة ثقافة لوحة بلاستيكية. لوحة واحدة من 6-جيدا من BC-MPS سوف تتطلب واحدة ثقافة الأنسجة القياسية 6 لوحة بئر (أسفل) ولوحة واحدة pNIPAAm المغلفة (أعلى). يمكن شراء لوحات pNIPAAm من مصادر تجارية أو يمكن أن تكون مغلفة في المختبر10،11،12.
  2. زراعة ASCs في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام في خزانة السلامة البيولوجية.
  3. ثقافة ASCs حتى تصبح التقاء 100٪ وتشكيل نمط المخطط. اعتمادا على التقاء التي كانت المصنفين، وهذا سيستغرق 7-10 أيام. مطلوب أوراق الخلايا التقاء لترسيخ أنسجة الثدي الدهنية المزدهرة.

2. إعداد الإمدادات اللازمة ل MPS BC

  1. لإعداد الجيلاتين ل6-جيدا لوحات جعل محلول الجيلاتين 12٪ في المقطر H2O. ميكس 19 غرام من الجيلاتين نوع B (قوة هلام من ~ 225 بلوم) و 125 مل من H2O في زجاجة وسائل الإعلام الزجاج 250 مل. أضف 1.6 مل من 1 M NaOH إلى الحل لتحييد الحموضة.
  2. أوتوكلاف الحل تحت دورة السائل لمدة 25 دقيقة لتعقيم الحل.
  3. السماح للحل لتبرد إلى 37 درجة مئوية. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة إضافة 16 مل من المحلول المعقم الملح 10x هانكس متوازنة (HBSS) إلى الحل للحصول على حجم نهائي من 160 مل.
    ملاحظة: يمكن استخدام محلول الجيلاتين على الفور أو تخزينه في درجة حرارة الغرفة لاستخدامه لاحقا. الجيلاتين المعد مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة شهر واحد. إذا كان هناك حاجة فقط عدد قليل من المكبس ثم يمكن إجراء حل 10 مل وتصفية عقيمة في نفس اليوم الذي جعل BC-MPS كما هو موضح سابقا7.
    1. لإعداد محلول الجيلاتين عن طريق تعقيم الفلتر، قم بتخفيف 1 مل من 10x HBSS مع 9 مل من H2O لصنع محلول HBSS 1x في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف 100 ميكرولتر من 1 M NaOH إلى كل أنبوب 10 مل ثم أضف 0.7 غرام من الجيلاتين إلى الحل. خلط الحل بقوة لإذابة الجيلاتين.
    2. احتضان الأنبوب في حمام مائي 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تهتز كل 5 دقائق. استخدم حقنة 10 مل ومرشح حقنة 0.22 ميكرومتر لتصفية محلول الجيلاتين. تصفية محلول الجيلاتين مباشرة على المكبس في خزانة السلامة البيولوجية.
  4. طباعة ثلاثية الأبعاد أو استخدام الاكريليك بسيطة لجعل المكبس المستخدمة لنقل أوراق الخلية. تأكد من أن المكبس تناسب فضفاضة في الحجم المطلوب من جيدا. يظهر المكبس المطبوع ثلاثي الأبعاد القياسي في الشكل 1. يمكن تصميم المكبس باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر القياسية مثل TinkerCad وطباعتها باستخدام الطابعات ثلاثية الأبعاد الخيطية المتوافقة مع حمض البوليلاكتيك (PLA)13،14.
  5. لإعداد رف لعقد المكبس وضع رف أنبوب 15 مل في خزانة السلامة البيولوجية. ضع المكبس رأسا على عقب في الرف ، بحيث يواجه الجزء السفلي من المكبس. ضع صندوق بلاستيكي مع غطاء لنقل BC-MPS في خزانة السلامة الحيوية. من المستحسن أن يكون طول الصندوق 35.5 سم على الأقل × 28 سم × 8.25 سم لاحتواء 4 لوحات من BC-MPS. إزالة الغطاء من مربع ورذاذ أسفل الرف، المكبس، ومربع مع 70٪ EtOH.
  6. إعداد شفرات الحلاقة العقيمة والملقط عن طريق الالاستعباد التلقائي أو عن طريق وضعها في خزانة السلامة البيولوجية والغسيل مع 70٪ EtOH.
  7. رش المكبس ومربع مع 70٪ EtOH وبدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعقيم الإمدادات.

3. إعداد المكبس الجيلاتين وتطبيقها على أوراق الخلية العليا

  1. إذا كان الحل الجيلاتين أعدت سابقا، تسخينه في حمام الماء 37 درجة مئوية لإذابته.
  2. ماصة الحل الجيلاتين على المكبس في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية باستخدام ماصة المصلية 5-أو 10 مل. المكبس ل 1 بئر من لوحة 6-جيدا سوف تتطلب ~ 2.5 مل من الجيلاتين.
  3. مرة واحدة وقد وطدت الجيلاتين على المكبس (~ 30-45 دقيقة) نقل لوحات ASC المغلفة pNIPAAm إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. ضع المكبس برفق في آبار لوحات ASC المغلفة pNIPAAm بحيث يتصل الجيلاتين بأجهزة ASCs. ضع غسالة معدنية (~ 7.5 غرام) على المكبس لوزن المكبس بحيث الجيلاتين على اتصال مباشر مع ورقة الخلية ASC. اترك المكبس على صفائح خلية ASC في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. تحريك بلطف لوحة مع المكبس في مربع العقيمة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ووضع الغطاء على ذلك. نقل مربع إلى ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا لم تتوفر ثلاجة 4 درجات مئوية ضع الطبق على الثلج في دلو ثلج في خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة.

4. إعداد خطوط الخلايا السرطانية

  1. البذور خطوط الخلايا السرطانية في طبق T75 زراعة الأنسجة القياسية والاحتفاظ بها في الثقافة بحيث تكون ~ 80٪ التقاء في اليوم قبل الميلاد-MPS سيتم معالجتها. (~ 200،000 الخلايا السرطانية ستكون هناك حاجة لكل قبل الميلاد MPS). تنمو الخلايا السرطانية في وسائل الإعلام العادية.
    ملاحظة: لتحديد وعزل الخلايا السرطانية فمن المستحسن أن يتم تحويل الخلايا مع بروتين الفلورسنت لتمييزها عن ASCs وأنسجة الثدي. تم تحسين عدد الخلايا السرطانية اللازمة لكل BC-MPS لخلايا MCF7 و MDA-MB-231. خطوط الخلايا الأخرى قد تتطلب المزيد من التحسين.
  2. في اليوم الذي يتم فيه إعداد BC-MPS نقل القارورة التي تحتوي على الخلايا السرطانية إلى خزانة السلامة البيولوجية. يستنشق وسائل الإعلام من القارورة. غسل القارورة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية إلى القارورة التي تحتوي على الخلايا السرطانية ومن ثم احتضان القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تكون الخلايا قد انفصلت (~ 2-5 دقيقة).
  4. في خزانة السلامة الحيوية إضافة 9 مل من برنامج تلفزيوني إلى القارورة، ونقل الخلايا في برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 مل والعد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
  5. الطرد المركزي الخلايا السرطانية في 500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعادة إنفاق الخلايا في وسائط BC-MPS بحيث يكون هناك 2 × 106 خلايا /مل.
  7. ضع الخلايا السرطانية في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لإضافتها إلى الأنسجة البشرية.

5. معالجة أنسجة الثدي البشري

  1. في خزانة السلامة الحيوية غسل أنسجة الثدي البشري (HBT) 3x مع 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم.
  2. استخدام ملقط معقمة وشفرة حلاقة لفرم بخشونة قبل الميلاد-MPS ومحاولة لإزالة أكبر قدر ممكن من اللفافة والأنسجة الضامة. قد يؤدي الفشل في إزالة النسيج الضام إلى عدم تثبيت الطبقة العليا من ASC بشكل صحيح على HBT.
    ملاحظة: يمكن التعرف على اللفافة والنسيج الضام من خلال مظهره الأبيض أو الواضح مقارنة بالألوان الصفراء للأنسجة الدهنية.
  3. بمجرد إزالة النسيج الضام استخدم شفرة حلاقة معقمة لفرم الأنسجة ناعما حتى يكون لها اتساق سائل متجانس. يتم فرم الأنسجة ناعما عندما يمكن بسهولة أن تكون pipetted باستخدام طرف المصلية 25 مل.
  4. استخدام شفرة حلاقة معقمة لقطع طرف قبالة تلميح ماصة p1000 للمساعدة في pipetting HBT المفروم.
  5. في أنبوب 1.5 مل مزيج HBT المفروم، وخطوط الخلايا السرطانية، والوسائط BC-MPS (ل1 بئر من لوحة بئر 6 وهذا يتطلب 200 ميكروغرام من HBT المفروم، 100 ميكروغرام من وسائل الإعلام قبل الميلاد-MPS، و 100 ميكروغرام من الخلايا السرطانية).
  6. نقل لوحة ASC التي سيتم استخدامها للوحة الخلية السفلية من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية. يستنشق الوسائط من لوحة ASC السفلية. ماصة الخليط على وسط بئر لوحة ASC السفلي باستخدام طرف ماصة p1000 التي كانت نهاية البعيدة قطع من الخطوة 5.4
  7. نقل مربع يحتوي على لوحة ASC العلوي مع المكبس على ذلك إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إزالة بلطف المكبس الجيلاتين من لوحة المغلفة pNIPAAm ومكان على رأس خليط HBT. إضافة وسائل الإعلام قبل الميلاد MPS إلى البئر (ل 1 بئر من لوحة 6-جيدا إضافة 2 مل من وسائل الإعلام). تحرك بعناية لوحات ASC السفلي مع خليط BC-MPS والغطاسات إلى مربع البلاستيك العقيم ووضع غطاء الصندوق على للنقل.
    ملاحظة: غطاء لوحة 6-جيدا لن يصلح مرة أخرى على لوحة ASC بينما المكبس على. يجب توخي الحذر لتجنب تلويث الثقافة.
  8. احتضان لوحة أسفل في المربع في حاضنة في 37 درجة مئوية حتى الجيلاتين قد ذابت، وطبقة ASC الأعلى قد بدأت في الالتزام الطبقة السفلية (~ 30 دقيقة).
  9. نقل مربع مع لوحات لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إزالة بلطف المكبس من لوحات أسفل. الأنسجة مع الخلايا السرطانية سوف تكون راسية في الجزء السفلي من البئر.
  10. ضع غطاء اللوحة ذات 6 آبار مرة أخرى على اللوحة السفلية واحتضنها عند 37 درجة مئوية لإذابة الجيلاتين تماما والسماح للطبقة العليا بالإرساء تماما في الطبقة السفلية (~ 30-60 دقيقة).
  11. نقل لوحات بلطف إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية و يستنشق وسائل الإعلام مع ماصة المصلية 10 مل. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الطازجة إلى كل بئر. يستنشق من حافة البئر وماصة على حافة البئر لتجنب إزاحة الأنسجة.
  12. حافظ على BC-MPS عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للطول المطلوب من الوقت وغير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

6. الهضم من قبل الميلاد - MPS للتحليل

  1. عندما تكون BC-MPS جاهزة للتحليل، حرك اللوحة إلى خزانة السلامة الحيوية. إزالة الوسائط مع ماصة المصلية لتجنب إزاحة عرضي من أي أنسجة.
  2. إضافة 1 حجم برنامج تلفزيوني لكل بئر.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة المصلية.
  4. إضافة 1 مل من حل فصل الخلية لكل بئر. حرك اللوحة مرة أخرى إلى الحاضنة واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالفصل. في خزانة السلامة البيولوجية، استخدم مكشطة الخلايا لفصل الخلايا والأنسجة تماما عن لوحة الثقافة.
  5. نقل الحل مع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام ماصة المصلية. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر لجمع أي خلايا المتبقية ونقل هذا الحل إلى أنبوب مخروطي. إذا كانت الخلايا الفلورية، التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
  6. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية تحت التحريض المستمر في شاكر المدارية في 1 × ز لمدة 10-20 دقيقة لنأي الخلايا تماما عن الأنسجة.
  7. في خزانة السلامة الحيوية استخدام ماصة المصلية لتعطيل أي كتل المتبقية من الخلايا في الأنبوب وتصفية العينة من خلال مصفاة الأنسجة 250 ميكرومتر في أنبوب جديد 15 مل. Pipette الحل ببطء من خلال مصفاة بحيث لا تجاوز.
  8. شطف مصفاة مع برنامج تلفزيوني 1 مل لجمع أي خلايا لا تزال في مصفاة.
  9. طرد مركزي العينات في 500 × ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، سوف تطفو الخلايا الدهنية على الطبقة العليا من المحلول في حين سيتم خلط الخلايا السرطانية و ASCs معا في بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
  10. لعزل الخلايا الدهنية صب بلطف الطبقة العليا في أنبوب جديد أو بدلا من ذلك قطع طرف قبالة تلميح ماصة p1000 ونقل الطبقة العليا إلى أنبوب جديد. الطرد المركزي عينة في 500 × ز لمدة 5 دقائق مرة أخرى واستخدام حقنة وإبرة لإزالة الحل من تحت adipocytes بحيث تبقى فقط الخلايا الدهنية. الخلايا الدهنية جاهزة الآن للتحليل
  11. بعد إزالة الخلايا الدهنية من المحلول ، افصل ASCs والخلايا السرطانية عن بعضها البعض للتحليل إذا كانت الخلايا السرطانية مصابة سابقا ببروتين فلوري. يستنشق المحلول المتبقي من الأنبوب الذي يحتوي على ASCs والخلايا السرطانية دون تعطيل بيليه الخلية. Resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني أو قبل الميلاد - MPS وسائل الإعلام واستخدام تدفق قياس الخلايا لفرز الخلايا على أساس الفلورسينس.

النتائج

الاستقرار في الثقافة
BC-MPS هو نظام فيزيائي دقيق مستقر يمكن استزراعه في المختبر لمدة تصل إلى 14 يوما على الأقل. تم التقاط صورة brightfield من أوراق الخلية ASC في التكبير 100x لعرض نمط المخططات من ورقة التقاء (الشكل 2A). أوراق الخلية ASC مستقرة في الثقافة لمدة 4 أ...

Discussion

هناك حاجة إلى أنظمة جديدة لنمذجة سرطان الثدي البشري لتطوير فهم أفضل للمرض. تطوير النظم الفيزيائية الدقيقة البشرية لنمذجة إعدادات المرض التي تشمل ECM الأصلي والخلايا السترومية سيزيد من القوة التنبؤية للدراسات ما قبل السريرية. نموذج BC-MPS المعروض هنا هو نظام تم تطويره حديثا يتغلب على قيود الن...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نود أن نشكر تولين تدفق قياس الخلايا وخلية الفرز الأساسية وكذلك تولين الأنسجة الأساسية لدعمهم التقني. تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الجنوبية الشرقية للجراحين التجميليين والترميميين 2019 منحة بحثية والمؤسسة الوطنية للعلوم (EPSCoR Track 2 RII، OIA 1632854).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccumaxInnovative Cell Technologies1333Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
AccutaseCorning25-058-CICell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16ozNational Scientific Supply CoMPCE-T016For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasksCorning430641UFor culturing ASCs
Conical Tubes 15mL ThermoScientific339650
Curved ForcepsThermoScientific1631T5For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ GlutamaxGibco10567-014For culturing ASCs and BC-MPS
FBS QualifiedGibco26140-079
GelatinSigmaG9391
HBSS 10xGibco14185-052
NaOHSigma221465
Nunc UpCell 6 well platesThermoScientific174901Top ASC cell sheet
PBSGibco10010-023
Pen/Strep 5,000UGibco15070-063
Petri Dish 150 cmFisherBrandFB0875714For holding tissue while mincing 
Razor BladesVWR55411-055Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um ThermoScientific87791For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well platesCorning3506Bottom ASC cell Sheet
Weights/WashersBCP FastenersBCP672For weighing plungers down 1/2" inner diameter

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved