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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe la construcción de un sistema microfisiológico in vitro para estudiar el cáncer de seno usando el tejido humano primario del pecho con los materiales del estante.

Resumen

El cáncer de mama (BC) sigue siendo una de las principales causas de muerte entre las mujeres. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fracasan en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se necesitan nuevos modelos para mejorar nuestra comprensión de la enfermedad. El programa de sistemas microfisiológicos (MPS) de los NIH se desarrolló para mejorar la traducción clínica de los descubrimientos de la ciencia básica y las nuevas estrategias terapéuticas prometedoras. Aquí presentamos un método para generar las P.M. para los cánceres de seno (BC-MPS). Este modelo adapta un enfoque previamente descrito de cultivo de tejido adiposo blanco humano primario (WAT) intercalando WAT entre las hojas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) s. Los aspectos nuevos de nuestro BC-MPS incluyen la siembra de células bc en el tejido mamario humano no enfermo (HBT) que contiene matriz extracelular nativa, adipocitos maduros, fibroblastos residentes, y las células inmunes; y intercalar la mezcla BC-HBT entre las hojas asc derivadas de HBT. El BC-MPS resultante es estable en cultivo ex vivo durante al menos 14 días. Este sistema modelo contiene múltiples elementos del microambiente que influyen en bc incluyendo adipocitos, células del estroma, células inmunes, y la matriz extracelular. Por lo tanto, BC-MPS se puede utilizar para estudiar las interacciones entre BC y su microambiente.

Demostramos las ventajas de nuestro BC-MPS mediante el estudio de dos comportamientos de BC conocidos por influir en la progresión del cáncer y la metástasis: 1) la motilidad bc y 2) bc-HBT diafonía metabólica. Mientras que la movilidad de BC se ha demostrado previamente usando proyección de imagen intravital, BC-MPS permite la proyección de imagen de alta resolución del lapso de tiempo usando microscopia de la fluorescencia durante varios días. Además, mientras que la diafonía metabólica fue demostrada previamente usando las células de BC y los pre-adipocytes murine distinguidos en adipocytes inmaduros, nuestro modelo de BC-MPS es el primer sistema para demostrar esta diafonía entre los adipocytes mamarios humanos primarios y las células de BC in vitro.

Introducción

Cada año, más de 40.000 mujeres estadounidenses mueren de cáncer de mama (BC)1. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fallan los ensayos clínicos2,3. Se necesitan nuevos modelos para mejorar la cartera de desarrollo de fármacos y nuestra comprensión de BC. El Programa Microfisiológico (MPS) de los NIH delineó las características requeridas para los modelos innovadores para mejorar la traducción de la ciencia básica en éxito clínico4. Éstos incluyeron el uso de células o de tejidos humanos primarios, estables en cultura por 4 semanas, y la inclusión de la arquitectura nativa del tejido y de la respuesta fisiológica.

Los modelos actuales in vitro de BC, como el cultivo bidimensional de líneas celulares de BC, el co-cultivo de inserto de membrana y los esferoides y organoides tridimensionales, no cumplen con los criterios de MPS de los NIH porque ninguno de estos recapitula la arquitectura del tejido mamario nativo. Cuando la matriz extracelular (ECM) se agrega a estos sistemas, el ECM del pecho no se utiliza; en su lugar, se utilizan geles de colágeno y matrices de membrana basal.

Los sistemas in vivo actuales, tales como xenoinjertos derivados pacientes (PDX), semejantemente no resuelven los criterios de la P.M. de nih porque los tejidos mamarios murine diferencian grandemente de pechos humanos. Por otra parte, las interacciones del sistema inmune-BC se reconocen cada vez más como dominantes en el desarrollo del tumor, pero los modelos murine immunocompromised usados para generar tumores de PDX carecen de las células de T maduras, de las células de B, y de las células de asesino naturales. Además, mientras que PDX permite que los tumores primarios del pecho sean mantenidos y ser ampliados, los tumores resultantes de PDX se infiltran con las células murine primarias del estroma y ECM5.

Para superar estos desafíos, hemos desarrollado un nuevo, ex vivo, tridimensional mamario humano MPS que cumple con los criterios de NIH MPS. La base de nuestro MPS mamario se realiza intercalando tejido mamario humano primario (HBT) entre dos láminas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), también aisladas de HBT(Figura 1). Los émbolos para transferir las hojas celulares para emparedar el HBT pueden imprimirse en 3D o estar hechos de plásticos acrílicos simples (Figura 1H,I). Esta técnica adapta nuestro enfoque previamente descrito para el cultivo de tejido de adipocitos blancos humanos primarios6,7. El MPS del pecho se puede entonces sembrar por un modelo de BC de la opción, extendiéndose de variedades de células estándar de BC a los tumores humanos primarios del pecho. Aquí, mostramos que estos BC-MPS son estables en cultivo durante varias semanas(Figura 2); incluyen elementos nativos de hbt tales como adipocytes mamarios, ECM, endotelio, células inmunes (Figura 3); y recapitular las interacciones fisiológicas entre BC y HBT como la diafonía metabólica(Figura 4). Por último, mostramos que BC-MPS permite el estudio del movimiento ameboide de las células BC a lo largo de hbt (Figura 5).

Protocolo

Todos los tejidos humanos se recogieron de acuerdo con el protocolo #9189 aprobado por la Oficina de la Junta de Revisión Institucional de LSUHSC.

1. Siembra de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) para hojas celulares

  1. Compre ASC de fuentes comerciales o aísle del tejido mamario humano primario siguiendo los protocolosestablecidos8,9. Semilla de ascs humanos del pecho en la densidad del 70% (área superficial ~80.000 cells/cm2) sobre las placas estándar de la cultura del tejido de 6 pozos en el medio modificado del águila de Dulbecco (DMEM) complementado con el suero bovino fetal del 10%, y la penicilina/la estreptomicina del 1% (medios de BC-MPS). Asegúrese de que los ASC que se utilizarán para formar las hojas de celdas deben ser menores que el pasaje 10.
    1. Para cada pocillo del sistema microfisiológico del cáncer de seno (BC-MPS) que será generado, las células de semilla en 1 pozo estándar de la cultura del tejido y 1 pocillo del tamaño similar en la placa plástica del tejido recubierta poli (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm). Una placa de 6 pozos de BC-MPS requerirá una placa estándar de cultivo de tejido de 6 pozos (inferior) y una placa recubierta de pNIPAAm (arriba). Las placas pNIPAAm se pueden comprar de fuentes comerciales o se pueden recubrir en el laboratorio10,11,12.
  2. Cultivo de ASCs en una incubadora de cultivo de tejidos a 37°C y al 5% deCO2. Cambie los medios cada 2-3 días en un gabinete de bioseguridad.
  3. Cultíe los ASC hasta que se vuelvan 100% confluentes y formen un patrón estriado. Dependiendo de la confluencia en la que fueron sembrados, esto tomará de 7 a 10 días. Las hojas confluentes de la célula se requieren para anclar el tejido adiposo boyante del pecho.

2. Preparación de los suministros necesarios para BC-MPS

  1. Para preparar la gelatina para placas de 6 pozos, haga una solución de gelatina al 12% en destiladoH2O. Mezcle 19 g de gelatina tipo B (concentración de gel de ~ 225 Bloom) y 125 mL de H2O en una botella de medio de vidrio de 250 ml. Añadir 1,6 mL de NaOH de 1 M a la solución para neutralizar el pH.
  2. Autoclave la solución bajo un ciclo líquido durante 25 min para esterilizar la solución.
  3. Deje que la solución se enfríe a 37 °C. En un armario de bioseguridad estéril añadir 16 mL de solución salina balanceada estéril de 10x Hanks (HBSS) a la solución para obtener un volumen final de 160 mL.
    NOTA: La solución de gelatina se puede utilizar de inmediato o almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. La gelatina preparada es estable a temperatura ambiente durante 1 mes. Si sólo se necesitarán unos pocos émbolos, entonces se puede hacer una solución de 10 mL y filtrar estéril en el mismo día que se hace BC-MPS como se describió anteriormente7.
    1. Para preparar la solución de gelatina por esterilización por filtro, diluya 1 mL de 10x HBSS con 9 mL deH2O para hacer una solución de HBSS 1x en un tubo cónico de 15 mL. Añadir 100 μL de 1 M de NaOH a cada tubo de 10 mL y luego añadir 0,7 g de gelatina a la solución. Mezcle la solución vigorosamente para disolver la gelatina.
    2. Incubar el tubo en un baño de agua de 75 °C durante 20 min agitando cada 5 min. Use una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,22 μm para filtrar la solución de gelatina. Filtre la solución de gelatina directamente sobre los émbolos en un gabinete de bioseguridad.
  4. Impresión 3D o utilizar acrílico simple para hacer los émbolos utilizados para la transferencia de las hojas de la célula. Asegúrese de que los émbolos se ajusten holgadamente en el tamaño deseado del pozo. Un émbolo impreso en 3D estándar se muestra en la Figura 1. Los émbolos se pueden diseñar utilizando software de diseño asistido por ordenador estándar como TinkerCad e imprimirse utilizando impresoras 3D de filamentos que son compatibles con el ácido poliláctico (PLA)13,14.
  5. Para preparar un rack para sujetar los émbolos coloque un rack de tubo de 15 mL en un gabinete de bioseguridad. Coloque los émbolos boca abajo en el bastidor, de modo que la parte inferior de los émbolos esté boca arriba. Coloque una caja de plástico con una tapa para transportar BC-MPS en el gabinete de bioseguridad. Se recomienda que la caja tenga al menos 35,5 cm de largo x 28 cm de ancho x 8,25 cm de alto para adaptarse a 4 placas de BC-MPS. Retire la tapa de la caja y rocíe el estante, los émbolos y la caja con 70% de EtOH.
  6. Prepare cuchillas de afeitar estériles y pinzas de afeitar mediante autoclave o colocándolas en un gabinete de bioseguridad y lavándolas con 70% de EtOH.
  7. Rocíe los émbolos y la caja con 70% de EtOH y encienda la luz UV en el gabinete de bioseguridad durante al menos 30 minutos para esterilizar los suministros.

3. Preparar émbolos de gelatina y aplicar a las hojas de células superiores

  1. Si la solución de gelatina se preparó previamente, calentarla en un baño de agua de 37 ° C para derretirla.
  2. Pipetee la solución de gelatina sobre los émbolos en el gabinete de bioseguridad utilizando una pipeta serológica de 5 o 10 mL. Un émbolo para 1 pozo de una placa de 6 pozos requerirá ~ 2.5 mL de gelatina.
  3. Una vez que la gelatina se haya solidificado en los émbolos (~ 30-45 min) mueva las placas asc recubiertas de pNIPAAm al gabinete de bioseguridad. Coloque suavemente los émbolos en los pozos de las placas asc recubiertas de pNIPAAm para que la gelatina entre en contacto con los ASC. Coloque una arandela de metal (~ 7.5 g) en el émbolo para pesar el émbolo de modo que la gelatina esté en contacto directo con la hoja de células ASC. Deje los émbolos en las hojas de celdas ASC a temperatura ambiente durante 30 min.
  4. Mueva suavemente la placa con los émbolos en la caja estéril en el gabinete de bioseguridad y coloque la tapa sobre ella. Mueva la caja a una nevera de 4 °C durante 30 min. Si una nevera de 4 °C no está disponible, coloque la placa sobre hielo en un cubo de hielo en el gabinete de bioseguridad durante 30 min.

4. Preparación de líneas celulares de cáncer

  1. Sembra las líneas celulares de cáncer en un plato estándar de cultivo de tejido T75 y manténgalas en cultivo para que sean ~ 80% confluentes en el día en que se procesará BC-MPS. (Se necesitarán ~200,000 células cancerosas por BC-MPS). Cultivar las células cancerosas en medios normales.
    NOTA: Para identificar y aislar las células cancerosas se recomienda que las células se transfectan con una proteína fluorescente para distinguirlas de los ASC y del tejido mamario. El número de células cancerosas necesarias por BC-MPS se ha optimizado para las células MCF7 y MDA-MB-231. Otras líneas celulares pueden requerir una mayor optimización.
  2. El día en que se está preparando el BC-MPS, mueva el matraz que contiene las células cancerosas al gabinete de bioseguridad. Aspirar los medios del matraz. Lavar el matraz con 5 mL de PBS.
  3. Añadir 1 mL de solución de desprendimiento celular al matraz que contiene las células cancerosas y luego incubar el matraz en una incubadora de 37 °C hasta que las células se hayan desprendido (~2-5 min).
  4. En el gabinete de bioseguridad añadir 9 mL de PBS al matraz, transferir las células en PBS en un tubo cónico de 15 mL y contar el número de células utilizando un hemocitómetro.
  5. Centrifugar las células cancerosas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Resuspend las células en medios BC-MPS de modo que haya 2 x 106 células/mL.
  7. Coloque las células cancerosas en un baño de agua de 37 °C hasta que estén listas para ser agregadas al tejido humano.

5. Procesamiento del tejido mamario humano

  1. En un gabinete de bioseguridad lavar el tejido mamario humano (HBT) 3x con 10 mL de PBS estéril.
  2. Use fórceps estériles y una cuchilla de afeitar para picar toscamente el BC-MPS y trate de eliminar la mayor cantidad posible de fascia y tejido conectivo. Si no se extirpa el tejido conectivo, es posible que la capa superior del ASC no ancle correctamente el HBT.
    NOTA: La fascia y el tejido conectivo se pueden identificar por su aspecto blanco o claro en comparación con el color amarillo del tejido adiposo.
  3. Una vez que el tejido conectivo ha sido eliminado utilizar una cuchilla de afeitar estéril para picar finamente el tejido hasta que tenga una consistencia líquida homogénea. El tejido se inglesa finamente cuando se puede pipetear fácilmente utilizando una punta serológica de 25 mL.
  4. Use una cuchilla de afeitar estéril para cortar la punta de una punta de pipeta p1000 para ayudar a pipetear el HBT picado.
  5. En un tubo de 1,5 mL, mezcle el HBT picado, las líneas celulares cancerosas y los medios BC-MPS (para 1 pozo de una placa de 6 pozos, esto requiere 200 μL de HBT picado, 100 μL de medios BC-MPS y 100 μL de células cancerosas).
  6. Mueva la placa ASC que se utilizará para la hoja de celda inferior de la incubadora al gabinete de bioseguridad. Aspirar el medio desde la placa ASC inferior. Pipetear la mezcla en el centro del pozo de la placa asc inferior utilizando una punta de pipeta p1000 que tenía el extremo distal cortado del paso 5.4
  7. Mueva la caja que contiene la placa ASC superior con los émbolos en ella al gabinete de bioseguridad. Retire suavemente los émbolos de gelatina de la placa recubierta de pNIPAAm y colóquele encima de la mezcla hbt. Agregue medios BC-MPS al pozo (para 1 pozo de una placa de 6 pozos agregue 2 mL de medios). Mueva cuidadosamente las placas ASC inferiores con la mezcla BC-MPS y los émbolos a la caja de plástico estéril y coloque la tapa de la caja para su transporte.
    NOTA: La tapa de la placa de 6 pozos no cabe de nuevo en la placa ASC mientras los émbolos están encendidos. Se debe tener cuidado para evitar contaminar la cultura.
  8. Incubar la placa inferior en la caja en una incubadora a 37 ° C hasta que la gelatina se haya derretido, y la capa superior de ASC haya comenzado a adherirse a la capa inferior (~ 30 min).
  9. Mueva la caja con las placas al gabinete de bioseguridad. Retire suavemente los émbolos de las placas inferiores. El tejido con las células cancerosas se anclará al fondo del pozo.
  10. Coloque la tapa de la placa de 6 pozos de nuevo en la placa inferior e incube a 37 ° C para fundir completamente la gelatina y permitir que la capa superior se ancle completamente a la capa inferior (~ 30-60 min).
  11. Mueva suavemente las placas a un gabinete de bioseguridad y aspire el medio con una pipeta serológica de 10 mL. Agregue 2 mL de medios frescos a cada pozo. Aspirar desde el borde del pozo y pipetear en el borde del pozo para evitar desalojar el tejido.
  12. Mantenga el BC-MPS a 37 °C y 5% de CO2 durante el período de tiempo deseado y cambie el medio cada 2-3 días.

6. Digestión de BC-MPS para análisis

  1. Cuando el BC-MPS esté listo para ser analizado, mueva la placa al gabinete de bioseguridad. Retire los medios con una pipeta serológica para evitar el despreocupamiento accidental de cualquier tejido.
  2. Agregue 1 volumen de PBS a cada pozo.
  3. Retire el PBS con una pipeta serológica.
  4. Agregue 1 mL de solución de disociación celular a cada pozo. Mueva la placa de vuelta a la incubadora e incube a 37 °C durante 5 min para permitir que las células se desprencien. En un gabinete de bioseguridad, use un raspador de células para separar completamente las células y el tejido de la placa de cultivo.
  5. Transferir la solución con el tejido a un tubo cónico de 15 mL utilizando una pipeta serológica. Agregue 2 mL de PBS a cada pozo para recolectar las células restantes y transferir esta solución al tubo cónico. Si las células son fluorescentes, envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz.
  6. Incubar el tubo a 37 °C bajo agitación constante en una coctelera orbital a 1 x g durante 10-20 min para disociar completamente las células del tejido.
  7. En un gabinete de bioseguridad, utilice una pipeta serológica para interrumpir cualquier grupo restante de células en el tubo y filtrar la muestra a través de un colador de tejido de 250 μm en un nuevo tubo de 15 mL. Pipetear la solución lentamente a través del colador para que no se desborde.
  8. Enjuague el colador con 1 mL de PBS para recoger las células que aún están en el colador.
  9. Centrifugar las muestras a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Después de la centrifugación, los adipocitos estarán flotando en la capa superior de la solución, mientras que las células cancerosas y los ASC se mezclarán en un gránulo en la parte inferior del tubo.
  10. Para aislar los adipocitos, vierta suavemente la capa superior en un nuevo tubo o, alternativamente, corte la punta de una punta de pipeta p1000 y transfiera la capa superior a un nuevo tubo. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min de nuevo y utilizar una jeringa y una aguja para extraer la solución de debajo de los adipocitos para que sólo queden los adipocitos. Los adipocitos ya están listos para el análisis
  11. Después de quitar los adipocytes de la solución, separe los ASCs y las células cancerosas el uno del otro para el análisis si las células cancerosas fueron transfectadas previamente con una proteína fluorescente. Aspirar la solución restante del tubo que contiene los ASC y las células cancerosas sin interrumpir el pellet celular. Resuspend el pellet en medios PBS o BC-MPS y utilice citometría de flujo para clasificar las células en función de la fluorescencia.

Resultados

Estabilidad en la cultura
BC-MPS es un sistema microfisiológico estable que se puede cultivar in vitro durante al menos 14 días. Se tomó una imagen de campo brillante de las hojas de celdas ASC a un aumento de 100x para mostrar el patrón estriado de la hoja confluente (Figura 2A). Las hojas celulares de ASC son estables en cultivo durante al menos 4 semanas. BC-MPS a los 14 días en cultivo en un pozo de una placa de 6 pozos fue foto f...

Discusión

Se necesitan nuevos sistemas para modelar el cáncer de mama humano a fin de desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad. El desarrollo de sistemas microfisiológicos humanos para modelar los ajustes de la enfermedad que incluyen ecm nativo y las células stromal aumentará el poder profético de estudios preclínicos. El modelo BC-MPS presentado aquí es un sistema de nuevo desarrollo que supera las limitaciones de los modelos anteriores permite la evaluación de BC en su entorno HBT nativo. Este sistema se pued...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo y Clasificación Celular de Tulane, así como al Núcleo de Histología de Tulane por su soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por la Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant y la National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AccumaxInnovative Cell Technologies1333Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
AccutaseCorning25-058-CICell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16ozNational Scientific Supply CoMPCE-T016For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasksCorning430641UFor culturing ASCs
Conical Tubes 15mL ThermoScientific339650
Curved ForcepsThermoScientific1631T5For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ GlutamaxGibco10567-014For culturing ASCs and BC-MPS
FBS QualifiedGibco26140-079
GelatinSigmaG9391
HBSS 10xGibco14185-052
NaOHSigma221465
Nunc UpCell 6 well platesThermoScientific174901Top ASC cell sheet
PBSGibco10010-023
Pen/Strep 5,000UGibco15070-063
Petri Dish 150 cmFisherBrandFB0875714For holding tissue while mincing 
Razor BladesVWR55411-055Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um ThermoScientific87791For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well platesCorning3506Bottom ASC cell Sheet
Weights/WashersBCP FastenersBCP672For weighing plungers down 1/2" inner diameter

Referencias

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