미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

요약

이 프로토콜은 선반 재료가 없는 1차 인간 유방 조직을 사용하여 유방암을 연구하기 위한 체외 미생물 시스템의 건설을 설명합니다.

초록

유방암 (BC)은 여성을위한 주요 사망 원인으로 남아 있습니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고 BC 주 약의 97%가 임상 시험에 실패합니다. 따라서 질병에 대한 우리의 이해를 향상시키기 위해 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물시스템(MPS) 프로그램은 기초과학 발견의 임상번역을 개선하고 새로운 치료 전략을 약속하기 위해 개발되었다. 여기에서 우리는 유방암을 위한 MPS를 생성하는 방법을 제시합니다 (BC-MPS). 이 모델은 지방 유래 줄기 세포 시트 (ASC) 사이에 WAT를 끼운하여 1 차 인간 백색 지방 조직 (WAT)을 배양하는 이전에 설명된 접근 방식을 조정합니다. 우리의 BC-MPS의 새로운 양상은 종아메리카세포 외 매트릭스, 성숙한 세포세포, 상주 섬유아세포 및 면역 세포를 포함하는 비병인간 유방 조직 (HBT)으로 BC 세포를 종향하는 것을 포함합니다; 및 HBT 유래 ASC 시트 사이에 BC-HBT 혼화제를 끼우고. 결과 BC-MPS는 적어도 14 일 동안 문화 전 생체 에서 안정적입니다. 이 모델 시스템에는 선포세포, 기질 세포, 면역 세포 및 세포 외 매트릭스를 포함하여 BC에 영향을 미치는 마이크로 환경의 여러 요소가 포함되어 있습니다. 따라서 BC-MPS는 BC와 그 마이크로 환경 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 암 진행과 전이에 영향을 미치는 것으로 알려진 두 개의 BC 동작을 연구하여 BC-MPS의 장점을 보여줍니다 : 1) BC 운동성과 2) BC-HBT 대사 크로스토크. BC 운동성은 이전에 인트라바이탈 이미징을 사용하여 입증되었지만 BC-MPS는 며칠 동안 형광 현미경 검사를 사용하여 고해상도 시간 경과 이미징을 허용합니다. 더욱이, 대사 크로스토크는 이전에 BC 세포와 미숙한 선포세포로 분화된 뮤린 프리-아포세포를 사용하여 입증되었지만, 우리의 BC-MPS 모델은 1차 인간 유방 선포세포와 체외세포 사이의 이 교차토크를 보여주는 최초의 시스템입니다.

서문

매년 40,000명 이상의 미국 여성이 유방암(BC)^1로사망합니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고, 후보 BC 약물의 97%가 임상 시험^2,3에실패합니다. 신약 개발 파이프라인과 BC에 대한 이해를 개선하기 위해서는 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물학(MPS) 프로그램은 기본 과학을 임상^성공4로 번역하는 것을 개선하기 위한 획기적인 모델에 필요한 특징을 설명했습니다. 이들은 1 차적인 인간 세포 또는 조직의 사용을 포함, 4 주 동안 문화에 안정, 네이티브 조직 아키텍처 및 생리 반응의 포함.

BC 세포주 2차원 배양, 멤브레인 삽입 공동 배양, 3차원 스페로이드 및 오르가노이드와 같은 현재 시험관 내 BC 모델은 NIH의 MPS 기준을 충족시키지 못하기 때문에 이러한 생체 조직 아키텍처를 재구성하지 않기 때문이다. 세포 외 매트릭스 (ECM)가 이러한 시스템에 추가되면 유방 ECM이 사용되지 않습니다. 대신 콜라겐 젤과 지하 멤브레인 행렬이 사용됩니다.

환자 유래 제노이식(PDX)과 같은 생체 내 시스템은 유사하게 Murine 유방 조직이 인간의 가슴과 크게 다르기 때문에 NIH의 MPS 기준을 충족시키지 못합니다. 더욱이, 면역 계통-BC 상호 작용은 종양 발달에 있는 열쇠로 점점 인식되고 있습니다, 그러나 PDX 종양을 생성하기 위하여 이용된 면역타협한 뮤린 모형은 성숙한 T 세포, B 세포 및 자연적인 살인자 세포부족. 더욱이, PDX는 1차 유방 종양을 유지 및 확장할 수 있도록 허용하지만, 생성된 PDX 종양은 1차 뮤린 기질 세포 및 ECM^5로침투된다.

이러한 과제를 극복하기 위해 NIH MPS 기준을 충족하는 새로운 ex vivo, 입체적인 인간 유방 MPS를 개발했습니다. 우리의 유방 MPS의 기초는 또한 HBT(그림 1)에서분리된 지방 유래 줄기 세포의 2장 사이 1 차 인간 유방 조직 (HBT)를 샌드위치해서 만들어집니다. HBT를 샌드위치로 셀 시트를 전송하는 플런저는 간단한 아크릴 플라스틱(그림 1H,I)으로3D 인쇄 되거나 만들 수 있습니다. 이 기술은 1 차적인 인간 백색 반포세포 조직을 배양하기 위한 우리의 이전에 기술된 접근 방식을 적응합니다^6,7. 유방 MPS는 표준 BC 세포주에서 1 차적인 인간 유방 종양에 구역 수색하는 선택의 BC 모형에 의해 그 때 시드될 수 있습니다. 여기서, 우리는 이러한 BC-MPS가 여러 주 동안 문화에서 안정되어 있음을 보여줍니다(그림 2); 유방 선포세포, ECM, 내피, 면역 세포와 같은 HBT의 토착 요소를 포함한다(도 3); 대사 크로스토크(도4)와같은 BC와 HBT 간의 생리적 상호작용을 재구성한다. 마지막으로, BC-MPS는 HBT(도5)를통해 BC 세포의 아모에이드 이동연구를 허용한다는 것을 보여준다.

프로토콜

모든 인간 조직은 LSUHSC의 기관 검토 위원회 사무소의 승인에 따라 프로토콜 #9189 따라 수집되었습니다.

1. 세포 시트에 대한 Adipose 유래 줄기 세포 (ASC)의 파종

1. 상용 소스에서 ASC를 구입하거나 확립 된^{프로토콜8을}따라 1 차 인간 유방 조직으로부터 분리^8,9. 종자 인간 유방 ASC70% 밀도 (~80,000 세포/cm² 표면적) 6-well 표준 조직 배양 플레이트에 덜벡코의 수정된 독수리 매체 (DMEM) 보충 10% 태아 소 혈 청, 그리고 1% 페니실린/스트렙토마이신 (BC-MPS 미디어). 세포 시트를 형성하는 데 사용되는 ASC가 통과 10 보다 적어야 하는지 확인합니다.
   1. 유방암 미생물학적 시스템(BC-MPS)의 각 웰에 대해, 1표준 조직 배양에서 종자 세포는 폴리(N-iso프로필acrylamide)에 유사한 크기의 1웰(N-iso프로필acrylamide)(pNIPAAm)-코팅조직 배양 플라스틱 플레이트에 있다. BC-MPS의 6웰 플레이트 1개에는 하나의 표준 조직 배양 6 웰 플레이트(아래)와 1개의 pNIPAAm 코팅 플레이트(상단)가 필요합니다. pNIPAAm 플레이트는 상업용 소스에서 구입할 수 있거나 실험실 내^10,11,12로코팅할 수 있다.
2. 37 ° C 및 5 % CO_2에서조직 배양 인큐베이터에서 의 배양 ASC. 바이오 세이프티 캐비닛에서 2-3일마다 미디어를 변경합니다.
3. ASC가 100% 수렴될 때까지 문화하고 줄무늬 패턴을 형성합니다. 시드를 받은 합류에 따라 7-10일이 소요됩니다. 부력 지방 유방 조직을 고정하려면 컨런트 세포 시트가 필요합니다.

2. BC MPS에 필요한 소모품 준비

1. 6웰 플레이트용 젤라틴을 준비하려면 250mL 유리 미디어 병에 블라틴 B형 B(젤 강도 ~225블룸)와 H_2O125mL의 증류된 H₂O. 믹스 19g에 12% 젤라틴 용액을 만듭니다. pH를 중화하기 위해 용액에 1M NaOH의 1.6mL를 추가합니다.
2. 용액을 살균하기 위해 25분 동안 액체 사이클에서 용액을 오토클레이브합니다.
3. 용액이 37°C로 냉각되도록 합니다. 멸균 생물안전 캐비닛에서 16mL의 멸균 10x 행크스 균형 소금 용액(HBSS)을 용액에 첨가하여 최종 부피를 160mL로 획득한다.
   참고: 젤라틴 용액을 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 실온에서 저장할 수 있습니다. 준비된 젤라틴은 실온에서 1개월 동안 안정적입니다. 몇 플런서만 필요한 경우 10mL 용액을 만들고 이전에 설명한 대로 BC-MPS를 만드는 것과 같은 날에 걸러질 수^{있습니다.}
   1. 필터 살균에 의해 젤라틴 용액을 준비하기 위해 10x HBSS 1mL을 H₂O9mL로 희석하여 15mL 원문 튜브에서 1x HBSS 용액을 만듭니다. 각 10mL 튜브에 1M NaOH의 100 μL을 추가한 다음 용액에 0.7 g의 젤라틴을 추가합니다. 젤라틴을 용해시키기 위해 용액을 적극적으로 섞습니다.
   2. 튜브를 75°C의 수조에 20분 동안 배양하여 5분마다 흔들어 보냅니다. 젤라틴 용액을 필터링하려면 10mL 주사기와 0.22 μm 주사기 필터를 사용합니다. 젤라틴 용액을 생물 안전 캐비닛의 플런스터에 직접 필터링합니다.
4. 3D 인쇄 또는 간단한 아크릴을 사용하여 셀 시트를 전송하는 데 사용되는 플런저를 만듭니다. 플런저가 원하는 크기의 우물크기에 느슨하게 맞는지 확인하십시오. 표준 3D 인쇄 플런저그림 1에표시됩니다. 플런처는 팅커캐드와 같은 표준 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있으며 폴리락산(PLA)^13,14와호환되는 필라멘트 3D 프린터를 사용하여 인쇄할 수 있습니다.
5. 플런저를 잡기 위한 랙을 준비하려면 15mL 튜브 랙을 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 플런저 의 바닥이 위를 향하고 있도록 랙에 거꾸로 플런저를 배치합니다. 생물 안전 캐비닛에 BC-MPS를 운반하기 위해 뚜껑이 있는 플라스틱 상자를 놓습니다. BC-MPS 4 플레이트에 맞게 35.5cm 길이 x 28cm 너비 x 8.25 cm 높이 8.25 cm 이상이어야 합니다. 상자에서 뚜껑을 제거하고 70 % EtOH로 랙, 플런지 및 상자를 스프레이합니다.
6. 멸균 면도날과 집게를 자동화하거나 생물 안전 캐비닛에 넣고 70% EtOH로 세척하여 멸균 면도날과 집게를 준비합니다.
7. 플런서와 박스에 70% EtOH를 분사하고 생체 안전 캐비닛에 UV 광을 최소 30분 동안 켜서 보급품을 살균합니다.

3. 젤라틴 플런서를 준비하고 상부 셀 시트에 적용

1. 젤라틴 용액이 이전에 준비된 경우 37° C 수조에서 가열하여 녹입니다.
2. 5-또는 10mL 세로지컬 파이펫을 사용하여 생물 안전 캐비닛의 플런저에 젤라틴 용액을 피펫. 6웰 플레이트의 1웰에 대한 플런저에는 ~2.5mL의 젤라틴이 필요합니다.
3. 젤라틴이 플런저(~30-45분)에 고화되면 pNIPAAm 코팅 ASC 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 옮습니다. 젤라틴이 ASC에 접촉할 수 있도록 pNIPAAm 코팅 ASC 플레이트의 우물에 플런지를 부드럽게 배치합니다. 플런저에 금속 와셔(~7.5g)를 배치하여 플런저를 계량하여 젤라틴이 ASC 셀 시트와 직접 접촉하도록 합니다. 30 분 동안 실온에서 ASC 셀 시트에 플런저를 둡니다.
4. 플런저로 접시를 부드럽게 움직여 생물 안전 캐비닛의 멸균 상자에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 상자를 4°C 냉장고로 30분 동안 이동합니다. 4°C 냉장고를 사용할 수 없는 경우 30분 동안 바이오 세이프티 캐비닛의 얼음 양동이에 접시를 놓습니다.

4. 암 세포 주 준비

1. 표준 T75 조직 배양 접시에 암 세포 주를 시드하 고 BC-MPS가 처리 될 날에 ~ 80 % 컨실수 되도록 배양에 보관하십시오. (~200,000암세포는 BC-MPS당 필요합니다). 정상 매체에서 암세포를 성장시다.
   참고: 암세포를 확인하고 분리하려면 세포가 형광 단백질로 전염되어 ASC 및 유방 조직과 구별하는 것이 좋습니다. BC-MPS 당 필요한 암세포의 수는 MCF7 및 MDA-MB-231 세포에 최적화되었습니다. 그밖 세포주추가 최적화를 요구할 수 있습니다.
2. BC-MPS가 준비되고 있는 날에는 암세포를 함유한 플라스크를 생물안전 캐비닛으로 이동시한다. 플라스크에서 미디어를 흡인. PBS의 5mL로 플라스크를 씻으세요.
3. 암세포를 함유하는 플라스크에 세포 분리 용액 1mL을 추가한 다음 세포가 분리될 때까지 플라스크를 37°C 인큐베이터로 배양한다(~2-5분).
4. 생물안전 성 캐비닛에서 플라스크에 PBS의 9mL를 추가하고, PBS의 세포를 15mL 원추형 튜브로 옮기고 혈종계를 사용하여 세포 수를 계산한다.
5. 실온에서 5 분 동안 500 x g의 암세포를 원심 분리합니다.
6. 2 x 10⁶ 셀/mL이 있도록 BC-MPS 미디어에서 세포를 다시 중단합니다.
7. 암세포를 인간 조직에 첨가할 준비가 될 때까지 37°C 의 수조에 넣습니다.

5. 인간 유방 조직의 처리

1. 생체 안전 캐비닛에서 멸균 PBS의 10mL로 인간 유방 조직 (HBT) 3배 세척.
2. 멸균 집게와 면도날을 사용하여 BC-MPS를 거칠게 다진 다음 가능한 한 많은 근막과 결합 조직을 제거하십시오. 결합 조직을 제거하지 못하면 ASC 상층이 HBT를 제대로 고정하지 못할 수 있습니다.
   참고: 근막 과 결합 조직은 지방 조직의 황색에 비해 흰색 또는 명확한 외관에 의해 식별 될 수있다.
3. 결합 조직이 제거되면 균질성 액체 일관성이 될 때까지 조직을 미세하게 다진 멸균 면도날을 사용하십시오. 조직은 25 mL 세로릭 팁을 사용하여 쉽게 파이프화 될 수있을 때 미세하게 다진다.
4. 멸균 면도날을 사용하여 p1000 파이펫 팁에서 팁을 잘라 다진 HBT를 파이펫팅에 지원합니다.
5. 1.5mL 튜브에서 다진 HBT, 암 세포주 및 BC-MPS 미디어를 혼합합니다(6웰 플레이트의 1웰은 다진 HBT 200 μL, BC-MPS 미디어의 100 μL 및 암세포의 100 μL)이 필요합니다.
6. 인큐베이터에서 바이오 세이프티 캐비닛으로 하단 셀 시트에 사용되는 ASC 플레이트를 이동합니다. 하단 ASC 플레이트에서 미디어를 흡인합니다. 5.4 단계에서 절단된 단종 끝이 있는 p1000 파이펫 팁을 사용하여 바닥 ASC 플레이트의 우물 중앙에 혼합물을 파이펫
7. 상부 ASC 플레이트가 들어 있는 상자를 생체 안전 캐비닛에 플런서로 이동합니다. pNIPAAm 코팅 플레이트에서 젤라틴 플런지를 부드럽게 제거하고 HBT 혼합물 위에 놓습니다. 우물에 BC-MPS 미디어를 추가합니다 (6 웰 플레이트의 1 웰에 2 mL의 미디어를 추가). BC-MPS 혼합물과 플런저로 바닥 ASC 플레이트를 멸균 플라스틱 상자에 조심스럽게 옮기고 상자 뚜껑을 배치하여 운송합니다.
   참고: 플런서가 켜지는 동안 6웰 플레이트 뚜껑이 ASC 플레이트에 다시 맞지 않습니다. 문화를 오염하지 않도록 주의를 기울여야 합니다.
8. 젤라틴이 녹을 때까지 37 ° C의 인큐베이터에서 상자내의 바닥 플레이트를 배양하고 상단 ASC 층이 바닥 층 (~30 분)에 부착되기 시작했습니다.
9. 플레이트가 있는 상자를 생물안전 캐비닛으로 이동합니다. 바닥 플레이트에서 플런저를 부드럽게 제거합니다. 암세포를 가진 조직은 우물의 바닥에 고정될 것입니다.
10. 6웰 플레이트의 뚜껑을 다시 하단 플레이트에 놓고 37°C에서 배양하여 젤라틴을 완전히 녹여 서 상단 층이 바닥 층(~30-60분)에 완전히 고정되도록 합니다.
11. 플레이트를 생물안전 캐비닛으로 부드럽게 이동하고 10mL 세로지학적 파이펫으로 미디어를 흡인합니다. 각 웰에 신선한 미디어의 2 mL을 추가합니다. 우물의 가장자리에서 흡인하고 조직을 해피하지 않도록 우물의 가장자리에 파이펫.
12. 원하는 시간 동안 BC-MPS를 37°C 및 5%_CO2로 유지하고 2-3일마다 미디어를 변경한다.

6. 분석을 위한 BC-MPS의 소화

1. BC-MPS를 분석할 준비가 되면 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 이동합니다. 조직의 우발적 인 탈지방지를 위해 혈청 피펫으로 미디어를 제거하십시오.
2. 각 웰에 1볼륨의 PBS를 추가합니다.
3. 세로지학적 파이펫으로 PBS를 제거합니다.
4. 각 웰에 1mL의 셀 분리 솔루션을 추가합니다. 플레이트를 다시 인큐베이터로 이동하고 37°C에서 5분 동안 배양하여 세포가 분리되도록 합니다. 생물 안전 캐비닛에서 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포와 조직을 배양판에서 완전히 분리하십시오.
5. 조직으로 용액을 15mL 원문 튜브로 이체피를 이용하여 전달한다. 남은 세포를 수집하고 이 솔루션을 원물 튜브로 전송하기 위해 각 웰에 PBS 2mL을 추가합니다. 세포가 형광인 경우 튜브를 알루미늄 호일로 감싸빛으로부터 보호하십시오.
6. 조직으로부터 세포를 완전히 해리하기 위해 10-20 분 동안 1 x g에서 궤도 셰이커에서 일정한 동요 하에서 37 °C에서 튜브를 배양합니다.
7. 생물 안전 캐비닛에서 혈청 피펫을 사용하여 튜브에 남아있는 세포 덩어리를 방해하고 250 μm 조직 여과기를 통해 샘플을 새로운 15 mL 튜브로 필터링합니다. 스트레이너를 통해 솔루션을 천천히 피펫하여 오버플로하지 않도록 합니다.
8. 스트레이너를 1mL PBS로 헹구어 여과기에 남아 있는 모든 세포를 수집합니다.
9. 원심 분리는 5 분 동안 실온에서 500 x g에서 샘플을 원심 분리합니다. 원심분리 후, 암세포와 ASC가 튜브 바닥의 펠릿에 함께 혼합되는 동안, 심포세포는 용액의 상단 층에 떠있을 것이다.
10. 지방세포가 상단 층을 새 튜브에 부드럽게 붓거나 p1000 파이펫 팁에서 팁을 잘라내고 상단 층을 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 원심분리기 샘플을 500 x g에서 5분 동안 다시 사용하고 주사기와 바늘을 사용하여 교포 세포 아래에서 용액을 제거하여 교포세포만 남게 됩니다. 이제 분석 준비가 되었습니다.
11. 용액으로부터 아디포세포를 제거한 후, 암세포가 이전에 형광단백질로 전감염되었는지 분석을 위해 ASC및 암세포를 서로 분리한다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 ASC 및 암세포를 포함하는 관에서 나머지 용액을 흡인. PBS 또는 BC-MPS 매체에서 펠릿을 다시 중단하고 유동 세포측정을 사용하여 형광에 기초하여 세포를 정렬합니다.

결과

문화의 안정성
BC-MPS는 적어도 14 일 동안 시험관 내에서 배양 될 수있는 안정적인 미생물 학적 시스템입니다. ASC 세포 시트의 브라이트필드 이미지는 컨서크시트(도 2A)의줄무늬 패턴을 표시하기 위해 100배율로 촬영하였다. ASC 세포 시트는 적어도 4 주 동안 배양에서 안정적입니다. BC-MPS는 14일 동안 6웰 플레이트의 한 우물에서 양문화?...

토론

인간의 유방암 모델링을 위한 새로운 시스템은 질병의 더 나은 이해를 개발하기 위하여 필요합니다. 네이티브 ECM 및 기질 세포를 포함하는 질병 설정을 모델링하는 인간 미생물 시스템의 개발은 전임상 연구의 예측 능력을 증가시킬 것이다. 여기에 제시된 BC-MPS 모델은 기존 모델의 한계를 극복하여 네이티브 HBT 환경에서 BC를 평가할 수 있는 새로 개발된 시스템입니다. 이 시스템은 암 세포주 또?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Innovative Cell Technologies	1333	Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase	Corning	25-058-CI	Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz	National Scientific Supply Co	MPCE-T016	For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks	Corning	430641U	For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL	ThermoScientific	339650
Curved Forceps	ThermoScientific	1631T5	For maneuvering tissue while mincing
DMEM low glucose, w/ Glutamax	Gibco	10567-014	For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified	Gibco	26140-079
Gelatin	Sigma	G9391
HBSS 10x	Gibco	14185-052
NaOH	Sigma	221465
Nunc UpCell 6 well plates	ThermoScientific	174901	Top ASC cell sheet
PBS	Gibco	10010-023
Pen/Strep 5,000U	Gibco	15070-063
Petri Dish 150 cm	FisherBrand	FB0875714	For holding tissue while mincing
Razor Blades	VWR	55411-055	Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um	ThermoScientific	87791	For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates	Corning	3506	Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers	BCP Fasteners	BCP672	For weighing plungers down 1/2" inner diameter