미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

요약

이 프로토콜은 선반 재료가 없는 1차 인간 유방 조직을 사용하여 유방암을 연구하기 위한 체외 미생물 시스템의 건설을 설명합니다.

초록

유방암 (BC)은 여성을위한 주요 사망 원인으로 남아 있습니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고 BC 주 약의 97%가 임상 시험에 실패합니다. 따라서 질병에 대한 우리의 이해를 향상시키기 위해 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물시스템(MPS) 프로그램은 기초과학 발견의 임상번역을 개선하고 새로운 치료 전략을 약속하기 위해 개발되었다. 여기에서 우리는 유방암을 위한 MPS를 생성하는 방법을 제시합니다 (BC-MPS). 이 모델은 지방 유래 줄기 세포 시트 (ASC) 사이에 WAT를 끼운하여 1 차 인간 백색 지방 조직 (WAT)을 배양하는 이전에 설명된 접근 방식을 조정합니다. 우리의 BC-MPS의 새로운 양상은 종아메리카세포 외 매트릭스, 성숙한 세포세포, 상주 섬유아세포 및 면역 세포를 포함하는 비병인간 유방 조직 (HBT)으로 BC 세포를 종향하는 것을 포함합니다; 및 HBT 유래 ASC 시트 사이에 BC-HBT 혼화제를 끼우고. 결과 BC-MPS는 적어도 14 일 동안 문화 전 생체 에서 안정적입니다. 이 모델 시스템에는 선포세포, 기질 세포, 면역 세포 및 세포 외 매트릭스를 포함하여 BC에 영향을 미치는 마이크로 환경의 여러 요소가 포함되어 있습니다. 따라서 BC-MPS는 BC와 그 마이크로 환경 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 암 진행과 전이에 영향을 미치는 것으로 알려진 두 개의 BC 동작을 연구하여 BC-MPS의 장점을 보여줍니다 : 1) BC 운동성과 2) BC-HBT 대사 크로스토크. BC 운동성은 이전에 인트라바이탈 이미징을 사용하여 입증되었지만 BC-MPS는 며칠 동안 형광 현미경 검사를 사용하여 고해상도 시간 경과 이미징을 허용합니다. 더욱이, 대사 크로스토크는 이전에 BC 세포와 미숙한 선포세포로 분화된 뮤린 프리-아포세포를 사용하여 입증되었지만, 우리의 BC-MPS 모델은 1차 인간 유방 선포세포와 체외세포 사이의 이 교차토크를 보여주는 최초의 시스템입니다.

서문

매년 40,000명 이상의 미국 여성이 유방암(BC)^1로사망합니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고, 후보 BC 약물의 97%가 임상 시험^2,3에실패합니다. 신약 개발 파이프라인과 BC에 대한 이해를 개선하기 위해서는 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물학(MPS) 프로그램은 기본 과학을 임상^성공4로 번역하는 것을 개선하기 위한 획기적인 모델에 필요한 특징을 설명했습니다. 이들은 1 차적인 인간 세포 또는 조직의 사용을 포함, 4 주 동안 문화에 안정, 네이티브 조직 아키텍처 및 생리 반응의 포함.

BC 세포주 2차원 배양, 멤브레인 삽입 공동 배양, 3차원 스페로이드 및 오르가노이드와 같은 현재 시험관 내 BC 모델은 NIH의 MPS 기준을 충족시키지 못하기 때문에 이러한 생체 조직 아키텍처를 재구성하지 않기 때문이다. 세포 외 매트릭스 (ECM)가 이러한 시스템에 추가되면 유방 ECM이 사용되지 않습니다. 대신 콜라겐 젤과 지하 멤브레인 행렬이 사용됩니다.

환자 유래 제노이....

프로토콜

모든 인간 조직은 LSUHSC의 기관 검토 위원회 사무소의 승인에 따라 프로토콜 #9189 따라 수집되었습니다.

1. 세포 시트에 대한 Adipose 유래 줄기 세포 (ASC)의 파종

1. 상용 소스에서 ASC를 구입하거나 확립 된^{프로토콜8을}따라 1 차 인간 유방 조직으로부터 분리^8,9. 종자 인간 유방 ASC70% 밀도 (~80,000 세포/cm² 표면적) 6-well 표준 조직 배양 플레이트에 덜벡코의 수정된 독수리 매체 (DMEM) 보충 10% 태아 소 혈 청, 그리고 1% 페니실린/스트렙토마이신 (BC-MPS 미디어). 세포 시트를 형성하는 데 사용되는 ASC가 통과 10 보다 적어야 하는지 확인합니다.
   1. 유방암 미생물학적 시스템(BC-MPS)의 각 웰에 대해, 1표준 조직 배양에서 종자 세포는 폴리(N-iso프로필acrylamide)에 유사한 크기의 1웰(N-iso프로필acrylamide)(pNIPAAm)-코팅조직 배양 플라스틱 플레이트에 있다. BC-MPS의 6웰 플레이트 1개에는 하나의 표준 조직 배양 6 웰 플레이트(아래)와 1개의 pNIPAAm 코팅 플레이트(상단)가 필요합니다.....

결과

문화의 안정성
BC-MPS는 적어도 14 일 동안 시험관 내에서 배양 될 수있는 안정적인 미생물 학적 시스템입니다. ASC 세포 시트의 브라이트필드 이미지는 컨서크시트(도 2A)의줄무늬 패턴을 표시하기 위해 100배율로 촬영하였다. ASC 세포 시트는 적어도 4 주 동안 배양에서 안정적입니다. BC-MPS는 14일 동안 6웰 플레이트의 한 우물에서 양문화?.......

토론

인간의 유방암 모델링을 위한 새로운 시스템은 질병의 더 나은 이해를 개발하기 위하여 필요합니다. 네이티브 ECM 및 기질 세포를 포함하는 질병 설정을 모델링하는 인간 미생물 시스템의 개발은 전임상 연구의 예측 능력을 증가시킬 것이다. 여기에 제시된 BC-MPS 모델은 기존 모델의 한계를 극복하여 네이티브 HBT 환경에서 BC를 평가할 수 있는 새로 개발된 시스템입니다. 이 시스템은 암 세포주 또?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Innovative Cell Technologies	1333	Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase	Corning	25-058-CI	Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz	National Scientific Supply Co	MPCE-T016	For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks	Corning	430641U	For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL	ThermoScientific	339650
Curved Forceps	ThermoScientific	1631T5	For maneuvering tissue while mincing
DMEM low glucose, w/ Glutamax	Gibco	10567-014	For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified	Gibco	26140-079
Gelatin	Sigma	G9391
HBSS 10x	Gibco	14185-052
NaOH	Sigma	221465
Nunc UpCell 6 well plates	ThermoScientific	174901	Top ASC cell sheet
PBS	Gibco	10010-023
Pen/Strep 5,000U	Gibco	15070-063
Petri Dish 150 cm	FisherBrand	FB0875714	For holding tissue while mincing
Razor Blades	VWR	55411-055	Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um	ThermoScientific	87791	For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates	Corning	3506	Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers	BCP Fasteners	BCP672	For weighing plungers down 1/2" inner diameter