JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרופיזיולוגית במבחנה לחקר סרטן השד באמצעות רקמת שד אנושית ראשונית עם חומרי מדף.

Abstract

סרטן השד (BC) נשאר הגורם המוביל למוות עבור נשים. למרות יותר מ -700 מיליון דולר שהושקעו במחקר BC מדי שנה, 97% מהתרופות המועמדות BC נכשלות בניסויים קליניים. לכן, מודלים חדשים נדרשים כדי לשפר את ההבנה שלנו של המחלה. תוכנית NIH Microphysiological Systems (MPS) פותחה כדי לשפר את התרגום הקליני של תגליות מדעיות בסיסיות ואסטרטגיות טיפוליות חדשות ומבטיחות. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת MPS עבור סרטן השד (BC-MPS). מודל זה מתאים גישה שתוארה בעבר של culturing רקמת שומן לבן אנושי ראשוני (WAT) על ידי דחיקת WAT בין יריעות תאי גזע נגזר שומן (ASC)s. היבטים חדשניים של BC-MPS שלנו כוללים זריעת תאי BC לתוך רקמת שד אנושית לא חולה (HBT) המכיל מטריצה חוץ תאית מקורית, adipocytes בוגרת, פיברובלסטים תושב, ותאי חיסון; וכריך תערובת BC-HBT בין גיליונות ASC נגזר HBT. BC-MPS וכתוצאה מכך יציב בתרבות ex vivo לפחות 14 ימים. מערכת מודל זו מכילה אלמנטים מרובים של microenvironment המשפיעים על BC כולל adipocytes, תאים סטרומה, תאים חיסוניים, ואת המטריצה חוץ תאית. לכן BC-MPS יכול לשמש כדי ללמוד את האינטראקציות בין BC ו microenvironment שלה.

אנו מדגימים את היתרונות של BC-MPS שלנו על ידי חקירת שתי התנהגויות BC הידועות כמשפיעות על התקדמות סרטן ועגורות: 1) תנועתיות BC ו -2) CROSSTALK מטבולי BC-HBT. בעוד תנועתיות BC הוכח בעבר באמצעות הדמיה תוך-וvital, BC-MPS מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על פני מספר ימים. יתר על כן, בעוד crosstalk מטבולית הודגם בעבר באמצעות תאי BC ו מורין טרום adipocytes מובחן לתוך adipocytes בשלים, מודל BC-MPS שלנו היא המערכת הראשונה להדגים crosstalk זה בין אדיפוציטים mammary האדם העיקרי ותאי BC במבחנה.

Introduction

בכל שנה, יותר מ 40,000 נשים בארה"ב למות מסרטן השד (BC)1. למרות יותר מ 700 מיליון דולר שהושקעו במחקר BC מדי שנה, 97% של תרופות BC מועמד להיכשל בניסויים קליניים2,3. מודלים חדשים נדרשים כדי לשפר את צינור פיתוח התרופה ואת ההבנה שלנו של BC. התוכנית המיקרופיזיולוגית של NIH (MPS) סימנה את התכונות הנדרשות למודלים פורצי דרך לשיפור תרגום המדע הבסיסי להצלחה קלינית4. אלה כללו את השימוש בתאים אנושיים ראשוניים או ברקמות, יציב בתרבות במשך 4 שבועות, והכללה של ארכיטקטורת רקמות ילידיות ותגובה פיזיולוגית.

מודלים נוכחיים במבחנה BC, כגון תרבות דו מימדית של קווי תאים BC, ממברנה להוסיף תרבות משותפת, וספרואידים תלת מימדיים אורגנואידים, אינם עומדים בקריטריונים MPS של NIH כי אף אחד מאלה recapitulate ארכיטקטורת רקמת השד המקומי. כאשר מטריצה חוץ-תאית (ECM) מתווספת למערכות אלה, לא נעשה שימוש ב- ECM של השד; במקום זאת, ג'לים קולגן מטריצות קרום מרתף משמשים.

מערכות in vivo הנוכחי, כגון קסנוגרפטים נגזר המטופל (PDX), באופן דומה אינם עומדים בקריטריונים MPS של NIH כי רקמות חלב מורין שונים בהרבה משדיים אנושיים. יתר על כן, אינטראקציות מערכת החיסון-BC מוכרים יותר ויותר כמפתח בהתפתחות הגידול, אבל מודלים מורין immunocompromised המשמש ליצירת גידולים PDX חסרים תאי T בוגרים, תאי B, ותאים רוצח טבעי. יתר על כן, בעוד PDX מאפשר גידולים השד העיקרי להישמר ולהרחיב, הגידולים PDX וכתוצאה מכך הם הסתננו עם תאים סטרומה מורין ראשוני ECM5.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו רומן, ex vivo, תלת מימדי השד האנושי MPS העונה על הקריטריונים MPS NIH. הבסיס של MPS השד שלנו נעשה על ידי דחיקה רקמת השד האנושית העיקרית (HBT) בין שני גיליונות של תאי גזע נגזר שומן (ASCs), גם מבודד HBT (איור 1). בוכנות להעברת יריעות התא לכריך HBT יכול להיות 3D מודפס או עשוי פלסטיק אקרילי פשוט(איור 1H,I). טכניקה זו מתאימה את הגישה שתוארה לעיל שלנו עבור culturing רקמת אדיפוציטים לבנים אנושיים ראשוניים6,7. השד MPS לאחר מכן יכול להיות זרע על ידי מודל BC של בחירה, החל קווי תאים סטנדרטיים BC לגידולים השד האנושי העיקרי. כאן, אנו מראים כי BC-MPS אלה יציבים בתרבות במשך שבועות מרובים (איור 2); כוללים אלמנטים מקוריים של HBT כגון אדיפוציטים ממותה, ECM, אנדותל, תאים חיסוניים (איור 3); ולסיכום מחדש של האינטראקציות הפיזיולוגיות בין BC ל-HBT, כגון crosstalk מטבולי(איור 4). לבסוף, אנו מראים כי BC-MPS מאפשר לחקור תנועה אמובואידית של תאי BC ברחבי HBT (איור 5).

Protocol

כל הרקמות האנושיות נאספו בהתאם לפרוטוקול #9189 כפי שאושר על ידי משרד ועדת הביקורת המוסדית של LSUHSC.

1. זריעה של תאי גזע (ASCs) שמקורם בשומן עבור יריעות תאים

  1. לרכוש ASCs ממקורות מסחריים או לבודד מרקמת השד האנושית העיקרית על ידי ביצוע פרוטוקולים הוקמה8,9. זרע ASCs השד האנושי ב 70% צפיפות (~ 80,000 תאים / ס"מ2 שטח פנים) על 6-טוב צלחות תרבית רקמות סטנדרטיות בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברי, ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (BC-MPS מדיה). ודא ש- ASCs שישמשו ליצירת גליונות התאים צריכים להיות פחותים ממעבר 10.
    1. עבור כל באר של מערכת מיקרופיזיולוגית של סרטן השד (BC-MPS) שייווצרו, תאי זרע ב 1 תרבות רקמה סטנדרטית היטב 1 גם בגודל דומה על פולי (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm)מצופה רקמה תרבות צלחת פלסטיק. צלחת אחת של 6 בארות של BC-MPS תדרוש תרבית רקמה סטנדרטית אחת 6 צלחת באר (למטה) וצלחת מצופה pNIPAAm אחת (למעלה). את לוחות ה-pNIPAAm ניתן לרכוש ממקורות מסחריים, או לציפוי במעבדה10,11,12.
  2. תרבות ASCs באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. לשנות את התקשורת כל 2-3 ימים בארון biosafety.
  3. תרבות ASCs עד שהם הופכים 100% confluent וליצור דפוס מפוספס. בהתאם למפגשו שבו הם זרעו, זה ייקח 7-10 ימים. גיליונות תאים קונפלונטיים נדרשים לעגן את רקמת השד השומן המצוף.

2. הכנת אספקה הדרושה ל- BC-MPS

  1. כדי להכין ג'לטין עבור 6-באר צלחות לעשות 12% פתרון ג'לטין Hמזוקק 2O. לערבב 19 גרם של סוג ג'לטין B (חוזק ג'ל של ~ 225 בלום) ו 125 מ"ל של H2O בבקבוק 250 מ"ל זכוכית מדיה. הוסף 1.6 מ"ל של 1 M NaOH לפתרון כדי לנטרל את ה- pH.
  2. Autoclave את הפתרון תחת מחזור נוזלי במשך 25 דקות כדי לעקר את הפתרון.
  3. אפשר לפתרון להתקרר עד 37 °C (60 °F). בארון biosafety סטרילי להוסיף 16 מ"ל של סטרילי 10x הנקס פתרון מלח מאוזן (HBSS) לפתרון כדי להשיג נפח סופי של 160 מ"ל.
    הערה: ניתן להשתמש בתמיסת הג'לטין באופן מיד או לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר. הג'לטין המוכן יציב בטמפרטורת החדר למשך חודש. אם רק כמה בוכנות יהיה צורך אז פתרון 10 מ"ל יכול להיעשות סטרילי מסונן באותו יום כמו ביצוע BC-MPS כפי שתואר קודםלכן 7.
    1. כדי להכין פתרון ג'לטין על ידי עיקור מסנן, לדלל 1 מ"ל של 10x HBSS עם 9 מ"ל של H2O כדי להפוך פתרון 1x HBSS בצינור חרוט 15 מ"ל. הוסף 100 μL של 1 M NaOH לכל צינור 10 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 0.7 גרם של ג'לטין לפתרון. מערבבים את הפתרון במרץ כדי להמיס את הג'לטין.
    2. דגירה הצינור באמבט מים 75 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות רועד כל 5 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן מזרק 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון ג'לטין. מסננים את תמיסת הג'לטין ישירות על הוכנות בארון בטיחות ביולוגית.
  4. 3D להדפיס או להשתמש אקריליק פשוט כדי להפוך את הוכנות המשמשות להעברת גיליונות התא. ודא כי הבוכנות להתאים באופן רופף בגודל הרצוי של היטב. בוכנה רגילה המודפסת בתלת-ממד מוצגת באיור 1. ניתן לתכנן את הכוענים באמצעות תוכנת תכנון סטנדרטית בסיוע מחשב כגון TinkerCad ומודפסת באמצעות מדפסות תלת-ממד חוטיות התואמות לחומצה פולילקטית (PLA)13,14.
  5. כדי להכין מתלה להחזקת הבוכנות מניחים מתלה צינור 15 מ"ל בארון biosafety. מניחים בוכנות הפוכות במתלה, כך שתחתית הבוכנות פונה כלפי מעלה. מניחים קופסת פלסטיק עם מכסה להובלת BC-MPS בארון biosafety. מומלץ שהתיבה תהיה באורך של לפחות 35.5 ס"מ x רוחב 28 ס"מ x גובה 8.25 ס"מ כדי להתאים ל-4 לוחות BC-MPS. הסר את המכסה מהתיבה וריסוס במורד ארון התקשורת, הבוכנות והתיבה עם 70% EtOH.
  6. הכינו סכיני גילוח ומלקחיים סטריליים על ידי תיל אוטומטי או על ידי הנחתם בארון biosafety וכביסה עם 70% EtOH.
  7. לרסס את הבוכנות ואת התיבה עם 70% EtOH ולהדליק את אור UV בארון biosafety לפחות 30 דקות כדי לעקר את האספקה.

3. להכין בוכנות ג'לטין ולהחיל על יריעות התא העליון

  1. אם פתרון הג'לטין הוכן בעבר, מחממים אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס אותו.
  2. פיפטה פתרון ג'לטין על הבולענים בארון biosafety באמצעות פיפטה סרולוגית 5 או 10 מ"ל. בוכנה עבור 1 באר של צלחת 6-באר ידרוש ~ 2.5 מ"ל של ג'לטין.
  3. לאחר הג'לטין התגבש על הכובעים (~ 30-45 דקות) להעביר את לוחות ASC מצופה pNIPAAm לארון biosafety. מניחים בעדינות את הבוכנות בבארות של צלחות ASC מצופות pNIPAAm כך הג'לטין יוצר קשר עם ASCs. מניחים מכונת כביסה מתכת (~ 7.5 גרם) על הבוכנה כדי להכביד על הבוכנה, כך ג'לטין נמצא במגע ישיר עם גיליון התא ASC. השאירו את הכוענים על גיליונות התא ASC בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  4. בעדינות להזיז את הצלחת עם הבוכנות לתוך התיבה סטרילית בארון biosafety ומניחים את המכסה על זה. מעבירים את התיבה למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אם מקרר 4 מעלות צלזיוס אינו זמין מניחים את הצלחת על קרח בדלי קרח בארון biosafety במשך 30 דקות.

4. הכנת קווי תאים סרטניים

  1. זרע את קווי התאים הסרטניים בצלחת תרבית רקמת T75 סטנדרטית ולשמור אותם בתרבות, כך שהם ~ 80% confluent ביום BC-MPS יעובד. (~ 200,000 תאים סרטניים יהיה צורך לכל BC-MPS). לגדל את התאים הסרטניים בתקשורת נורמלית.
    הערה: כדי לזהות ולבודד את התאים הסרטניים מומלץ כי התאים הם transfected עם חלבון פלואורסצנטי כדי להבדיל אותם מן ASCs ורקמת השד. מספר התאים הסרטניים הדרושים לכל BC-MPS עבר אופטימיזציה לתאי MCF7 ומד"א-MB-231. קווי תא אחרים עשויים לדרוש מיטוב נוסף.
  2. ביום שבו BC-MPS הוא להיות מוכן להעביר את הבקבוק המכיל את התאים הסרטניים לארון biosafety. שאף את התקשורת מהבקבוקון. לשטוף את הבקבוק עם 5 מ"ל של PBS.
  3. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים לבקבוק המכיל את התאים הסרטניים ולאחר מכן לדגר את הבקבוק באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים נותקו (~ 2-5 דקות).
  4. בארון biosafety להוסיף 9 מ"ל של PBS לבקבוק, להעביר את התאים PBS לתוך צינור חרוט 15 מ"ל ולספור את מספר התא באמצעות המוציטרומטר.
  5. צנטריפוגה התאים הסרטניים ב 500 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השהה מחדש את התאים במדיית BC-MPS כך שיהיו 2 x 106 תאים/מ"ל.
  7. מניחים את התאים הסרטניים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להתווסף לרקמה האנושית.

5. עיבוד של רקמת השד האנושית

  1. בארון biosafety לשטוף את רקמת השד האנושית (HBT) 3x עם 10 מ"ל של PBS סטרילי.
  2. השתמש מלקחיים סטריליים סכין גילוח כדי לטחון גס את BC-MPS ולנסות להסיר כמה שיותר fascia ורקמת חיבור ככל האפשר. כשל בהסרת רקמת החיבור עלול לגרום לשכבה העליונה של ASC לא לעגן כראוי את HBT.
    הערה: ניתן לזהות את הפאשיה ורקמת החיבור על ידי המראה הלבן או הברור שלה בהשוואה לצבע הצהוב של רקמת השומן.
  3. לאחר רקמת החיבור הוסר להשתמש סכין גילוח סטרילי כדי לטחון דק את הרקמה עד שיש לו עקביות נוזלי הומוגנית. הרקמה טחונה דק כאשר זה יכול בקלות להיות pipetted באמצעות קצה סרולוגי 25 מ"ל.
  4. השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לחתוך את הקצה מקצה פיפטה p1000 כדי לסייע בצנרת HBT טחון.
  5. בצינור 1.5 מ"ל לערבב HBT טחון, קווי תאים סרטניים, ומדיה BC-MPS (עבור 1 גם של צלחת 6 גם זה דורש 200 μL של HBT טחון, 100 μL של מדיה BC-MPS, ו 100 μL של תאים סרטניים).
  6. להעביר את צלחת ASC שישמש עבור גיליון התא התחתון מן החממה לארון biosafety. שאף את המדיה מלוח ASC התחתון. פיפטה התערובת למרכז הבאר של צלחת ASC התחתון באמצעות קצה פיפטה p1000 כי היה סוף דיסטלי מנותק משלב 5.4
  7. הזז את התיבה המכילה את צלחת ASC העליונה עם הבוכנות עליה לארון biosafety. מוציאים בעדינות את הבוכנות לג'לטין מהצלחת מצופה pNIPAAm ומניחים על גבי תערובת HBT. הוסף מדיה BC-MPS לבאר (עבור 1 גם של צלחת 6-באר להוסיף 2 מ"ל של מדיה). בזהירות להעביר את לוחות ASC התחתון עם תערובת BC-MPS ובוכנות לתיבת פלסטיק סטרילי ומניחים את המכסה של התיבה על להובלה.
    הערה: מכסה צלחת 6 באר לא יתאים בחזרה על צלחת ASC בזמן הבוכנות הם על. יש להקפיד להימנע מזיהום התרבות.
  8. דגירה את הצלחת התחתונה בתיבה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד הג'לטין נמס, ואת שכבת ASC העליון החלה לדבוק בשכבה התחתונה (~ 30 דקות).
  9. להעביר את התיבה עם הצלחות לארון biosafety. מוציאים בעדינות את הוכנות מהצלחות התחתונות. הרקמה עם התאים הסרטניים תעוגן לתחתית הבאר.
  10. מניחים את המכסה של צלחת 6 באר בחזרה על הצלחת התחתונה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את הג'לטין ולאפשר את השכבה העליונה לעגן לחלוטין לשכבה התחתונה (~ 30-60 דקות).
  11. בעדינות להעביר את הצלחות לארון biosafety ולשאוף את התקשורת עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של מדיה טרייה לכל באר. לשאוף מקצה הבאר פיפטה על קצה הבאר, כדי למנוע עקירת הרקמה.
  12. שמור על BC-MPS ב 37 °C (70 °F) ו 5% CO 2 עבורמשך הזמן הרצוי ולשנות את המדיה כל 2-3 ימים.

6. עיכול של BC-MPS לניתוח

  1. כאשר BC-MPS מוכן לניתוח, להעביר את הצלחת לארון biosafety. הסר מדיה עם פיפטה סרולוגית כדי למנוע עקירה מקרית של כל רקמה.
  2. הוסף נפח אחד של PBS לכל באר.
  3. הסר את PBS עם פיפטה סרולוגית.
  4. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים לכל באר. מעבירים את הצלחת חזרה לאינקובטור ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק. בארון biosafety, להשתמש מגרד תאים לנתק לחלוטין את התאים ואת הרקמה מצלחת התרבות.
  5. להעביר את הפתרון עם הרקמה לצינור חרוט 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית. הוסף 2 מ"ל של PBS לכל באר כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ולהעביר פתרון זה לצינור חרוט. אם התאים הם פלואורסצנטיים, לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור.
  6. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמדת שייקר מסלולית ב 1 x g במשך 10-20 דקות כדי לנתק לחלוטין תאים מהרקמה.
  7. בארון biosafety להשתמש פיפטה סרולוגית לשבש את כל גושים שנותרו של תאים בצינור ולסנן את המדגם דרך מסננת רקמת μm 250 לתוך צינור חדש 15 מ"ל. פיפטה הפתרון לאט דרך מסננת, כך שהוא לא עולה על גדותיו.
  8. לשטוף את מסננת עם 1 מ"ל PBS כדי לאסוף את כל התאים עדיין מסננת.
  9. צנטריפוגה הדגימות ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, adipocytes יהיה צף על השכבה העליונה של הפתרון בעוד תאים סרטניים ASCs יהיה מעורבב יחד גלולה בתחתית הצינור.
  10. כדי לבודד את adipocytes בעדינות לשפוך את השכבה העליונה לתוך צינור חדש או לחילופין לחתוך את הקצה את קצה פיפטה p1000 ולהעביר את השכבה העליונה לצינור חדש. צנטריפוגה המדגם ב 500 x g במשך 5 דקות שוב ולהשתמש מזרק ומחט כדי להסיר את הפתרון מתחת adipocytes כך רק adipocytes נשארים. האדיפוציטים מוכנים כעת לניתוח
  11. לאחר הסרת adipocytes מן הפתרון, להפריד את ASCs ותאים סרטניים אחד מהשני לניתוח אם התאים הסרטניים היו חרוטים בעבר עם חלבון פלואורסצנטי. לשאוף את הפתרון הנותר מן הצינור המכיל את ASCs ותאים סרטניים מבלי לשבש את גלולת התא. השתמש שוב בכדור במדיית PBS או BC-MPS והשתמש בציטומטריית זרימה כדי למיין את התאים בהתבסס על הפלואורסצנטיות.

תוצאות

יציבות בתרבות
BC-MPS היא מערכת מיקרופיזיולוגית יציבה שיכולה להיות תרבותית במבחנה עד 14 ימים לפחות. תמונת שדה בהיר של גליונות התאים של ASC צולמה בהגדלה של פי 100 כדי להציג את התבנית המנוסה של גיליון המפגש (איור 2A). גיליונות התא ASC יציבים בתרבות לפחות 4 שב...

Discussion

מערכות חדשות למידול סרטן השד האנושי נדרשות כדי לפתח הבנה טובה יותר של המחלה. פיתוח מערכות מיקרופיזיולוגיות אנושיות למידול הגדרות מחלות הכוללות ECM מקורי ותאי סטרומה יגדיל את כוח החיזוי של מחקרים פרה-קליניים. מודל BC-MPS המוצג כאן הוא מערכת שפותחה לאחרונה המתגברת על המגבלות של מודלים קודמים מ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לסיטומטריית זרימת טוליין וליבת מיון התאים, כמו גם לליבת ההיסטולוגיה של טוליין על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הדרום-מזרחית למנתחים פלסטיים ומשחזרים 2019 מענק מחקר והקרן הלאומית למדע (מסלול EPSCoR 2 RII, OIA 1632854).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccumaxInnovative Cell Technologies1333Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
AccutaseCorning25-058-CICell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16ozNational Scientific Supply CoMPCE-T016For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasksCorning430641UFor culturing ASCs
Conical Tubes 15mL ThermoScientific339650
Curved ForcepsThermoScientific1631T5For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ GlutamaxGibco10567-014For culturing ASCs and BC-MPS
FBS QualifiedGibco26140-079
GelatinSigmaG9391
HBSS 10xGibco14185-052
NaOHSigma221465
Nunc UpCell 6 well platesThermoScientific174901Top ASC cell sheet
PBSGibco10010-023
Pen/Strep 5,000UGibco15070-063
Petri Dish 150 cmFisherBrandFB0875714For holding tissue while mincing 
Razor BladesVWR55411-055Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um ThermoScientific87791For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well platesCorning3506Bottom ASC cell Sheet
Weights/WashersBCP FastenersBCP672For weighing plungers down 1/2" inner diameter

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170crosstalk

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved