JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, raf malzemeleri ile birincil insan meme dokusu kullanılarak meme kanserini incelemek için bir in vitro mikrofizyolojik sistemin inşasını açıklar.

Özet

Meme kanseri (M.Ö. ) kadınlar için önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmektedir. Bc araştırmalarına yılda 700 milyon dolardan fazla yatırım olmasına rağmen, aday BC ilaçlarının% 97'si klinik çalışmalarda başarısız oluyor. Bu nedenle, hastalığı anlamamızı geliştirmek için yeni modellere ihtiyaç vardır. NIH Mikrofizyolojik Sistemler (MPS) programı, temel bilim keşiflerinin klinik çevirisini geliştirmek ve yeni terapötik stratejiler vaat etmek için geliştirilmiştir. Burada meme kanserleri için MPS (BC-MPS) üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu model, adipoz türevli kök hücre sayfaları (ASC) arasında WAT sandviç yaparak birincil insan beyaz yağ dokusunu (WAT) kültleme yaklaşımını daha önce tanımlanmış bir şekilde uyarlar. BC-MPS'mizin yeni yönleri arasında BC hücrelerinin yerel hücre dışı matris, olgun adipositler, yerleşik fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri içeren hastalıksız insan meme dokusuna (HBT) tohumlama; ve BC-HBT admixture'ı HBT türevi ASC levhalar arasında sandviç. Elde edilen BC-MPS, kültür ex vivo'sunda en az 14 gün boyunca kararlıdır. Bu model sistemi, Adipositler, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri ve hücre dışı matris dahil olmak üzere M.Ö.'yü etkileyen mikroçevrinin birden fazla unsurunu içerir. Böylece BC-MPS, BC ve mikroçevrim arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

BC-MPS'mizin avantajlarını, kanserin ilerlemesini ve metastazını etkilediği bilinen iki BC davranışını inceleyerek gösteriyoruz: 1) BC hareketliliği ve 2) BC-HBT metabolik çapraz konuşma. BC hareketliliği daha önce intravital görüntüleme kullanılarak gösterilmiş olsa da, BC-MPS birkaç gün boyunca floresan mikroskopi kullanarak yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülemeye izin verir. Ayrıca, metabolik çapraz konuşma daha önce bc hücreleri ve olgunlaşmamış adipositlere farklılaştırılmış murine pre-adipositler kullanılarak gösterilmiş olsa da, BC-MPS modelimiz birincil insan meme adipositleri ile BC hücreleri in vitro arasındaki bu çapraz sapı gösteren ilk sistemdir.

Giriş

Her yıl, 40.000'den fazla ABD'li kadın meme kanserinden ölüyor (M.Ö.1. Bc araştırmalarına yılda 700 milyon dolardan fazla yatırım olmasına rağmen, aday BC ilaçlarının% 97'si klinik çalışmalarda başarısız2,3. İlaç geliştirme boru hattını ve M.Ö. anlayışımızı geliştirmek için yeni modellere ihtiyaç vardır. NIH Mikrofizyolojik (MPS) Programı, temel bilimi klinik başarıya çevirmek için çığır açan modeller için gerekli özellikleri tanımlamamıştır4. Bunlar arasında birincil insan hücrelerinin veya dokularının kullanımı, 4 hafta boyunca kültürde stabil ve doğal doku mimarisinin ve fizyolojik yanıtın dahil edilmesi yer aldı.

BC hücre çizgilerinin iki boyutlu kültürü, membran kesici uç ortak kültürü ve üç boyutlu küreseller ve organoidler gibi mevcut in vitro BC modelleri NIH'nin MPS kriterlerini karşılamaz, çünkü bunların hiçbiri yerel meme dokusu mimarisini yeniden tamamlamaz. Bu sistemlere hücre dışı matris (ECM) eklendiğinde meme ECM kullanılmaz; bunun yerine kollajen jelleri ve bodrum membran matrisleri kullanılır.

Hasta türevli ksinograftlar (PDX) gibi mevcut in vivo sistemler de benzer şekilde NIH'nin MPS kriterlerini karşılamamaktadır, çünkü murine meme dokuları insan göğüslerinden büyük ölçüde farklıdır. Ayrıca, immün sistem-BC etkileşimleri tümör gelişiminde giderek daha fazla anahtar olarak kabul edilmektedir, ancak PDX tümörleri üretmek için kullanılan immün sistemi baskılanmış murin modelleri olgun T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücrelerden yoksundur. Ayrıca, PDX primer meme tümörlerinin korunmasına ve genişletilmesine izin verirken, ortaya çıkan PDX tümörleri primer murine stromal hücreler ve ECM5ile sızmaktadır.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, NIH MPS kriterlerini karşılayan bir roman, ex vivo, üç boyutlu insan göğsü MPS geliştirdik. Meme MPS'mizin temeli, birincil insan meme dokusunun (HBT) HBT'den izole edilmiş iki yağ türevi kök hücre (ASC) yaprağı arasına sandviç yapılmasıyla yapılır (Şekil 1). Hücre yapraklarını sandviç HBT'ye aktarmak için pistonlar 3D baskılı veya basit akrilik plastiklerden yapılabilir(Şekil 1H,I). Bu teknik, birincil insan beyaz adiposit dokusunu kültleme için daha önce tarif ettiğimiz yaklaşımı uyarlar6,7. Meme MPS daha sonra standart BC hücre çizgilerinden primer insan meme tümörlerine kadar tercih edilen bir BC modeli ile tohumlanabilir. Burada, bu BC-MPS'lerin kültürde birkaç hafta boyunca istikrarlı olduğunu gösteriyoruz (Şekil 2); meme adipositleri, ECM, endotel, bağışıklık hücreleri gibi HBT'nin doğal unsurlarını içerir (Şekil 3); ve M.Ö. ile HBT arasındaki metabolik çapraz konuşma gibi fizyolojik etkileşimleri yeniden özetler (Şekil 4). Son olarak, BC-MPS'nin HBT boyunca BC hücrelerinin amipoid hareketinin incelenmesine izin verdiğini gösteriyoruz (Şekil 5).

Protokol

Tüm insan dokuları LSUHSC Kurumsal İnceleme Kurulu Ofisi tarafından onaylandığı şekilde protokol #9189 uygun olarak toplanarak toplandırıldı.

1. Hücre sayfaları için Yağ türevi Kök Hücrelerin (ASC) tohumlama

  1. Asc'leri ticari kaynaklardan satın alın veya belirlenen protokolleri izleyerek birincil insan meme dokusundan izole edin8,9. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) 6 kuyu standart doku kültürü plakalarına%70 yoğunlukta (~80.000 hücre/cm 2 yüzey alanı) tohum insan meme ASC'leri %10 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin/Streptomisin (BC-MPS Media) ile desteklenmiştir. Hücre sayfalarını oluşturmak için kullanılacak ASC'lerin geçiş 10'dan az olmasını sağlayın.
    1. Üretilecek meme kanseri mikrofizyolojik sisteminin (BC-MPS) her kuyusu için, 1 standart doku kültüründe tohum hücreleri iyi ve poli (N-izopropilakrilamid) (pNIPAAm) kaplı doku kültürü plastik plakası üzerinde benzer boyutta 1 kuyu. Bir adet 6 kuyulu BC-MPS plakası, bir standart doku kültürü 6 kuyu plakası (alt) ve bir pNIPAAm kaplı plaka (üst) gerektirecektir. pNIPAAm plakaları ticari kaynaklardan satın alınabilir veya laboratuvar içi10, 11,12.
  2. 37 ° C ve% 5 CO 2'de bir doku kültürü inkübatöründe kültürASC'leri. Biyogüvenlik kabininde her 2-3 günde bir medyayı değiştirin.
  3. ASC'leri %100 birleşene ve çizgili bir desen oluşturana kadar kültürlendirin. Tohumlandıkları izdihama bağlı olarak, bu 7-10 gün sürecektir. Şamandıra yağ meme dokusunu tutturmak için birleştirilmiş hücre tabakaları gereklidir.

2. BC-MPS için gerekli malzemelerin hazırlanması

  1. 6 kuyulu plakalar için jelatin hazırlamak için damıtılmış H 2 O'da%12jelatin çözeltisi yapın, 250 mL cam medya şişesinde 19 g jelatin tipi B (jel mukavemeti ~ 225 Bloom) ve125mL H 2 O karıştırın. pH'ı nötralize etmek için çözeltiye 1,6 mL 1 M NaOH ekleyin.
  2. Çözeltiyi sterilize etmek için çözeltiyi 25 dakika boyunca sıvı bir döngü altında otoklavlayın.
  3. Çözeltinin 37 °C'ye kadar soğumasını bekleyin. Steril bir biyogüvenlik kabininde, 160 mL'lik son bir hacim elde etmek için çözeltiye 16 mL steril 10x Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ekleyin.
    NOT: Jelatin çözeltisi hemen kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında saklanabilir. Hazırlanan jelatin 1 ay boyunca oda sıcaklığında stabildir. Sadece birkaç pistona ihtiyaç duyulursa, daha önce açıklandığı gibi BC-MPS yapmakla aynı gün içinde 10 mL'lik bir çözelti yapılabilir ve steril filtrelenebilir7.
    1. Filtre sterilizasyonu ile jelatin çözeltisi hazırlamak için, 15 mL konik tüpte 1x HBSS çözeltisi yapmak için 10x HBSS'nin 1 mL'si ile 9 mL H2O seyreltin. Her 10 mL tüpe 100 μL 1 M NaOH ekleyin ve ardından çözeltiye 0,7 g jelatin ekleyin. Jelatin çözmek için çözeltiyi kuvvetlice karıştırın.
    2. Tüpü 75 °C'lik bir su banyosunda her 5 dakikada bir 20 dakika sallayarak kuluçkaya yatırın. Jelatin çözeltisini filtrelemek için 10 mL şırınna ve 0,22 μm şırınna filtresi kullanın. Jelatin çözeltisini doğrudan bir biyogüvenlik kabininde pistonlara filtreleyin.
  4. 3D baskı veya hücre sayfalarını aktarmak için kullanılan pistonları yapmak için basit akrilik kullanın. Pistonların istenen boyuta gevşek bir şekilde uyduğundan emin olun. Şekil 1'de standart bir 3D baskılı piston gösterilmiştir. Pistonlar, TinkerCad gibi standart bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak tasarlanabilir ve polilaktik asit (PLA)13, 14ile uyumlu filament 3D yazıcılar kullanılarak basılabilir.
  5. Pistonları tutmak için bir raf hazırlamak için biyogüvenlik kabinine 15 mL tüp rafı yerleştirin. Pistonları rafa baş aşağı yerleştirin, böylece pistonların altı yukarı bakacak şekilde. BC-MPS'yi taşımak için kapaklı plastik bir kutuyu biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Kutunun 4 plaka BC-MPS'ye uyacak şekilde en az 35,5 cm uzunluğunda x 28 cm genişliğinde x 8,25 cm yüksekliğinde olması önerilir. Kapağı kutudan çıkarın ve rafı, pistonları ve kutuyu% 70 EtOH ile püskürtün.
  6. Steril jilet ve forsepsleri otoklavlayarak veya biyogüvenlik kabinine yerleştirerek ve % 70 EtOH ile yıkayarak hazırlayın.
  7. Pistonları ve kutuyu% 70 EtOH ile püskürtün ve malzemeleri sterilize etmek için biyogüvenlik kabininde UV ışığını en az 30 dakika açın.

3. Jelatin pistonları hazırlayın ve üst hücre sayfalarına uygulayın

  1. Jelatin çözeltisi daha önce hazırlanmışsa, eritmek için 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
  2. Jelatin çözeltisini 5 veya 10 mL serolojik pipet kullanarak biyogüvenlik kabindeki pistonlara pipetlayın. 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu için bir piston ~ 2,5 mL jelatin gerektirecektir.
  3. Jelatin pistonlarda katılaştıktan sonra (~30-45 dk) pNIPAAm kaplı ASC plakalarını biyogüvenlik kabinine taşıyın. Pistonları pNIPAAm kaplı ASC plakalarının kuyularına hafifçe yerleştirin, böylece jelatin ASC'lere temas eder. Jelatin ASC hücre tabakasıyla doğrudan temas edecek şekilde pistonu tartmak için pistona bir metal yıkayıcı (~7,5 g) yerleştirin. Pistonları ASC hücre levhalarında oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
  4. Pistonlu plakayı hafifçe biyogüvenlik dolabındaki steril kutuya hareket ettirin ve kapağı üzerine yerleştirin. Kutuyu 30 dakika boyunca 4 °C buzdolabına taşıyın. 4 °C buzdolabı yoksa, plakayı 30 dakika boyunca biyogüvenlik dolabındaki bir buz kovasına yerleştirin.

4. Kanser hücre hatlarının hazırlanması

  1. Kanser hücre hatlarını standart bir T75 doku kültürü çanağı ile tohumlayın ve BC-MPS'nin işlanacağı gün ~% 80 birleştiğinde kültürde tutun. (~BC-MPS başına 200.000 kanser hücresine ihtiyaç duyulacaktır). Kanser hücrelerini normal ortamda büyütün.
    NOT: Kanser hücrelerini tanımlamak ve izole etmek için, hücrelerin ASC'lerden ve meme dokusundan ayırt etmek için floresan bir proteinle transktöre edilmesi önerilir. BC-MPS başına ihtiyaç duyulan kanser hücrelerinin sayısı MCF7 ve MDA-MB-231 hücreleri için optimize edilmiştir. Diğer hücre hatları daha fazla iyileştirme gerektirebilir.
  2. BC-MPS'nin hazırlandığı gün kanser hücrelerini içeren şişeyi biyogüvenlik kabinine taşıyın. Medyayı şişeden epire edin. Matarayı 5 mL PBS ile yıkayın.
  3. Kanser hücrelerini içeren şişeye 1 mL hücre müfrezesi çözeltisi ekleyin ve ardından hücreler ayrılana kadar şişeyi 37 °C'lik bir inkübatörde kuluçkaya yatırın (~2-5 dk).
  4. Biyogüvenlik kabininde şişeye 9 mL PBS ekleyin, PBS'deki hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın ve hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın.
  5. Kanser hücrelerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin.
  6. BC-MPS ortamlarındaki hücreleri 2 x 106 hücre/mL olacak şekilde yeniden kullanın.
  7. Kanser hücrelerini insan dokusuna eklenmeye hazır olana kadar 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.

5. İnsan meme dokusunun işlenmesi

  1. Biyogüvenlik kabininde insan meme dokusunu (HBT) 10 mL steril PBS ile 3x yıkayın.
  2. BC-MPS'yi kaba bir şekilde kıymak için steril forseps ve jilet kullanın ve mümkün olduğunca fazla fasya ve bağ dokusunu çıkarmaya çalışın. Bağ dokusunun çıkarılmaması, ASC üst tabakasının HBT'yi düzgün bir şekilde tutturamamasına neden olabilir.
    NOT: Fasya ve bağ dokusu yağ dokusunun sarı rengine göre beyaz veya berrak görünümü ile tanımlanabilir.
  3. Bağ dokusu çıkarıldıktan sonra, homojen bir sıvı kıvamına gelene kadar dokuyu ince bir şekilde kıymak için steril bir jilet kullanın. Doku, 25 mL serolojik bir uç kullanılarak kolayca pipetlenebildiğinde ince bir şekilde kıyılır.
  4. Kıyılmış HBT'nin pipetlemesine yardımcı olmak için p1000 pipet ucunun ucunu kesmek için steril bir jilet kullanın.
  5. 1,5 mL'lik bir tüpte kıyılmış HBT, kanser hücresi hatları ve BC-MPS ortamını karıştırın (6 kuyu plakasının 1 kuyusu için bu 200 μL kıyılmış HBT, 100 μL BC-MPS ortamı ve 100 μL kanser hücresi gerektirir).
  6. Alt hücre sayfası için kullanılacak ASC plakasını inkübatörden biyogüvenlik kabinine taşıyın. Ortamı alt ASC plakasından aspire edin. Karışımı, distal ucu 5.4 adımından kesilmiş bir p1000 pipet ucu kullanarak alt ASC plakasının kuyusunun ortasına pipetleyin
  7. Üzerinde pistonlar bulunan üst ASC plakasını içeren kutuyu biyogüvenlik kabinine taşıyın. Jelatin pistonlarını pNIPAAm kaplı plakadan hafifçe çıkarın ve HBT karışımının üzerine yerleştirin. Kuyuya BC-MPS medya ekleyin (6 kuyu plakasının 1 kuyusu için 2 mL medya ekleyin). BC-MPS karışımı ve pistonları ile alt ASC plakalarını steril plastik kutuya dikkatlice hareket ettirin ve taşıma için kutunun kapağını yerleştirin.
    NOT: Pistonlar açıkken 6 kuyulu plaka kapağı ASC plakasına geri sığmaz. Kültürü kirletmemek için dikkatli olunmalıdır.
  8. Alt plakayı, jelatin eriyene ve üst ASC tabakası alt katmana (~30 dk) yapışmaya başlayana kadar 37 ° C'de bir inkübatörde kutuya inkübe edin.
  9. Plakaların olduğu kutuyu biyogüvenlik kabinine taşıyın. Pistonları alt plakalardan yavaşça çıkarın. Kanser hücrelerinin olduğu doku kuyunun dibine tutturulacak.
  10. 6 kuyu plakasının kapağını tekrar alt plakaya yerleştirin ve jelatinleri tamamen eritmek ve üst tabakanın alt katmana tamamen tutturulmasını sağlamak için 37 °C'de kuluçkaya yatırın (~30-60 dk).
  11. Plakaları hafifçe bir biyogüvenlik kabinine taşıyın ve medyayı 10 mL serolojik pipetle aspire edin. Her kuyuya 2 mL taze medya ekleyin. Dokuyu yerinden çıkarmaktan kaçınmak için kuyunun kenarından ve pipetten kuyunun kenarına aspire edin.
  12. BC-MPS'yi istediğiniz süre boyunca 37 °C ve%5 CO 2'de saklayıp her 2-3 günde bir ortam değiştirin.

6. Analiz için BC-MPS sindirimi

  1. BC-MPS analize hazır olduğunda, plakayı biyogüvenlik kabinine taşıyın. Herhangi bir dokunun yanlışlıkla yerinden çıkarılmasını önlemek için medyayı serolojik pipetle çıkarın.
  2. Her kuyuya 1 birim PBS ekleyin.
  3. PBS'yi serolojik pipetle çıkarın.
  4. Her kuyuya 1 mL hücre ilişkilendirme çözümü ekleyin. Plakayı inkübatöre geri taşıyın ve hücrelerin kopmasını sağlamak için 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Biyogüvenlik kabininde, hücreleri ve dokuyu kültür plakasından tamamen ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
  5. Çözeltiyi doku ile serolojik pipet kullanarak 15 mL konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve bu çözeltiyi konik tüpe aktarmak için her kuyuya 2 mL PBS ekleyin. Hücreler floresan ise, tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
  6. Hücreleri dokudan tamamen ayrıştırmak için 10-20 dakika boyunca 1 x g'da bir yörünge çalkalayıcıda sürekli ajitasyon altında tüpü 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  7. Biyogüvenlik kabininde, tüpte kalan hücre kümelerini bozmak için serolojik bir pipet kullanın ve numuneyi 250 μm'lik bir doku süzgecinden yeni bir 15 mL tüpe filtreleyin. Çözeltiyi taşmaması için süzgeçten yavaşça geçirin.
  8. Süzgeçte hala bulunan hücreleri toplamak için süzgeci 1 mL PBS ile durulayın.
  9. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjlayın. Santrifüjlemeden sonra, adipositler çözeltinin üst tabakasında yüzerken, kanser hücreleri ve ASC'ler tüpün altındaki bir peletle birbirine karıştırılacaktır.
  10. Adipositleri izole etmek için üst katmanı yavaşça yeni bir tüpe dökün veya alternatif olarak p1000 pipet ucunu kesin ve üst katmanı yeni bir tüpe aktarın. Numuneyi 500 x g'da tekrar 5 dakika santrifüjlayın ve çözeltiyi adipositlerin altından çıkarmak için bir şırınga ve iğne kullanın, böylece sadece adipositler kalır. Adipositler analize hazır
  11. Adipositleri çözeltiden çıkardıktan sonra, kanser hücrelerinin daha önce floresan bir proteinle transklümlü olup olmadığını analiz etmek için ASC'leri ve kanser hücrelerini birbirinden ayırın. Kalan çözeltiyi, hücre peletini bozmadan ASC'leri ve kanser hücrelerini içeren tüpten epire edin. Peleti PBS veya BC-MPS ortamlarında yeniden kullanın ve hücreleri floresansa göre sıralamak için akış sitometrisi kullanın.

Sonuçlar

Kültürde istikrar
BC-MPS, en az 14 güne kadar in vitro olarak kültürlenebilen kararlı bir mikrofizyolojik sistemdir. Asc hücre sayfalarının parlak alan görüntüsü, birleştiği levhanın çizgili desenini görüntülemek için 100x büyütmede alınmıştır (Şekil 2A). ASC hücre sayfaları kültürde en az 4 hafta boyunca stabildir. BC-MPS kültürde 14 gün boyunca bir kuyuda 6 kuyu plakası, şamandıra HBT'nin 14 gün son...

Tartışmalar

Hastalığın daha iyi anlaşılması için insan meme kanserinin modelleneceği yeni sistemlere ihtiyaç vardır. Yerli ECM ve stromal hücreleri içeren hastalık ayarlarını modellemek için insan mikrofizyolojik sistemlerinin geliştirilmesi, klinik öncesi çalışmaların tahmin gücünü artıracaktır. Burada sunulan BC-MPS modeli, önceki modellerin sınırlamalarını aşarak BC'nin kendi yerel HBT ortamında değerlendirilmesini sağlayan yeni geliştirilmiş bir sistemdir. Bu sistem kanser hücre hatları il...

Açıklamalar

Yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Tulane Akış Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeği'nin yanı sıra Tulane Histoloji Çekirdeği'ne de teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant ve National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AccumaxInnovative Cell Technologies1333Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
AccutaseCorning25-058-CICell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16ozNational Scientific Supply CoMPCE-T016For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasksCorning430641UFor culturing ASCs
Conical Tubes 15mL ThermoScientific339650
Curved ForcepsThermoScientific1631T5For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ GlutamaxGibco10567-014For culturing ASCs and BC-MPS
FBS QualifiedGibco26140-079
GelatinSigmaG9391
HBSS 10xGibco14185-052
NaOHSigma221465
Nunc UpCell 6 well platesThermoScientific174901Top ASC cell sheet
PBSGibco10010-023
Pen/Strep 5,000UGibco15070-063
Petri Dish 150 cmFisherBrandFB0875714For holding tissue while mincing 
Razor BladesVWR55411-055Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um ThermoScientific87791For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well platesCorning3506Bottom ASC cell Sheet
Weights/WashersBCP FastenersBCP672For weighing plungers down 1/2" inner diameter

Referanslar

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmasSay 170meme kanserimikrofizyolojik sisteminsan meme dokusuya t revi k k h crelerbirincil k lt rila geli tirmemetabolik apraz konu ma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır