Моделирование рака молочной железы в ткани молочной железы человека с использованием микрофизиологической системы

Резюме

Этот протокол описывает построение микрофизиологической системы in vitro для изучения рака молочной железы с использованием первичной ткани молочной железы человека с готовыми материалами.

Аннотация

Рак молочной железы (БК) остается основной причиной смерти женщин. Несмотря на то, что ежегодно в исследования BC инвестируется более 700 миллионов долларов, 97% препаратов-кандидатов не проходят клинические испытания. Поэтому необходимы новые модели, чтобы улучшить наше понимание болезни. Программа NIH Microphysiological Systems (MPS) была разработана для улучшения клинического перевода фундаментальных научных открытий и перспективных новых терапевтических стратегий. Здесь мы представляем метод генерации MPS для рака молочной железы (BC-MPS). Эта модель адаптирует ранее описанный подход культивирования первичной белой жировой ткани человека (WAT) путем сэндвичинга WAT между листами стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ASC). Новые аспекты нашего BC-MPS включают посев клеток BC в небольшнюю ткань молочной железы человека (HBT), содержащую нативный внеклеточный матрикс, зрелые адипоциты, резидентные фибробласты и иммунные клетки; и сэндвичинг примеси BC-HBT между листами ASC, полученными из HBT. Полученный BC-MPS стабилен в культуре ex vivo в течение не менее 14 дней. Эта модельная система содержит несколько элементов микросреды, которые влияют на БК, включая адипоциты, стромальные клетки, иммунные клетки и внеклеточный матрикс. Таким образом, BC-MPS может быть использован для изучения взаимодействий между BC и его микросредой.

Мы демонстрируем преимущества нашего BC-MPS, изучая два поведения BC, которые, как известно, влияют на прогрессирование рака и метастазирование: 1) подвижность BC и 2) метаболические перекрестные помехи BC-HBT. В то время как подвижность BC ранее была продемонстрирована с использованием прижизальной визуализации, BC-MPS позволяет получать покадровую визуализацию с высоким разрешением с использованием флуоресцентной микроскопии в течение нескольких дней. Кроме того, в то время как метаболические перекрестные помехи были ранее продемонстрированы с использованием клеток BC и мышиных преадипоцитов, дифференцированных в незрелые адипоциты, наша модель BC-MPS является первой системой, демонстрирующей этот перекрестный разговор между первичными адипоцитами молочной железы человека и клетками BC in vitro.

Введение

Каждый год более 40 000 женщин США умирают от рака молочной железы (BC)^1. Несмотря на то, что ежегодно в исследования BC инвестируется более 700 миллионов долларов, 97% препаратов-кандидатов BC не проходят клинические испытания^2,3. Новые модели необходимы для улучшения конвейера разработки лекарств и нашего понимания БК. Микрофизиологическая программа NIH (MPS) очерчена функции, необходимые для прорывных моделей для улучшения перевода фундаментальной науки в клинический успех⁴. Они включали использование первичных клеток или тканей человека, стабильных в культуре в течение 4 недель, и включение нативной тканевой архитектуры и физиологического ответа.

Современные модели IN vitro BC, такие как двумерная культура клеточных линий BC, кокультура мембранных вставок и трехмерные сфероиды и органоиды, не соответствуют критериям MPS NIH, потому что ни один из них не повторяет архитектуру нативной ткани молочной железы. Когда к этим системам добавляется внеклеточный матрикс (ECM), ECM молочной железы не используется; вместо этого используются коллагеновые гели и матрицы базальных мембран.

Современные системы in vivo, такие как ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX), также не соответствуют критериям MPS NIH, потому что мышиные ткани молочной железы значительно отличаются от человеческой груди. Кроме того, взаимодействия иммунной системы и BC все чаще признаются ключевыми в развитии опухоли, но иммунокомпрометированные мышиные модели, используемые для генерации опухолей PDX, не имеют зрелых Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров. Кроме того, в то время как PDX позволяет поддерживать и расширять первичные опухоли молочной железы, полученные опухоли PDX инфильтрируются первичными мышиными стромальными клетками и ECM^5.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали новый, ex vivo, трехмерный MPS человеческой груди, который соответствует критериям NIH MPS. Основа нашей молочной mpS производится путем сэндвичинга первичной ткани молочной железы человека (HBT) между двумя листами стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ASC), также выделенных из HBT(рисунок 1). Плунжеры для переноса листов ячеек на сэндвич HBT могут быть напечатаны на 3D-принтере или изготовлены из простых акриловых пластиков(Рисунок 1H,I). Этот метод адаптирует наш ранее описанный подход к культивации первичной ткани белых адипоцитов человека^6,7. Затем MPS молочной железы может быть засеяна моделью BC по выбору, начиная от стандартных клеточных линий BC до первичных опухолей молочной железы человека. Здесь мы показываем, что эти BC-MPS стабильны в культуре в течение нескольких недель(рисунок 2); включают нативные элементы HBT, такие как адипоциты молочной железы, ECM, эндотелий, иммунные клетки(рисунок 3); и резюмировать физиологические взаимодействия между БК и ГБТ, такие как метаболические перекрестные помехи(рисунок 4). Наконец, мы показываем, что BC-MPS позволяет изучать амебоидное движение клеток BC по всему HBT(рисунок 5).

протокол

Все человеческие ткани были собраны в соответствии с протоколом #9189 утвержденным Офисом Институционального наблюдательного совета LSUHSC.

1. Посев стволовых клеток, полученных из жировой основе (ИСК), для клеточных листов

1. Покупайте ИСС из коммерческих источников или изолируйте из первичной ткани молочной железы человека, следуя установленным протоколам^8,9. Посейте ИСС молочной железы человека с плотностью 70% (~ 80 000 клеток / см² площади поверхности) на 6-скважинные стандартные пластины для культивации тканей в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM), дополненной 10% фетальной бычий сывороткой и 1% пенициллином / стрептомицином (BC-MPS Media). Убедитесь, что ИКС, используемые для формирования листов ячеек, должны быть меньше прохода 10.
   1. Для каждого колодца микрофизиологической системы рака молочной железы (BC-MPS), который будет генерироваться, семена клеток в 1 стандартной тканевой культуре колодца и 1 скважине аналогичного размера на поли(N-изопропилакриламид) (pNIPAAm) с покрытием тканевой культуры пластиковой пластины. Для одной 6-скважинной пластины BC-MPS потребуется одна стандартная тканевая культура, 6-скважинная пластина (нижняя) и одна пластина с покрытием pNIPAAm (сверху). Пластины pNIPAAm можно приобрести из коммерческих источников или с покрытием в лаборатории^10,11,12.
2. Культивирование ИСК в тканевом культуре инкубатора при 37°С и 5%_СО2. Меняйте носитель каждые 2-3 дня в шкафу биобезопасности.
3. Культивируйте ИСК до тех пор, пока они не станут на 100% слиненными и не образуют полосатый рисунок. В зависимости от слияния, при котором они были посеяны, на это уйдет 7-10 дней. Листы слиющеных клеток необходимы для закрепления плавучих жировой ткани молочной железы.

2. Подготовка материалов, необходимых для BC-MPS

1. Для приготовления желатина для 6-скважинных пластин делают 12% раствор желатина в дистиллированном_H2O. Смешайте 19 г желатина типа B (прочность геля ~225 Bloom) и 125 мл_H2O в стеклянной среде 250 мл. Добавьте 1,6 мл 1 М NaOH в раствор для нейтрализации рН.
2. Автоклав раствора под жидким циклом в течение 25 мин для стерилизации раствора.
3. Дайте раствору остыть до 37 °C. В шкаф стерильной биобезопасности добавляют 16 мл стерильного 10x сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) в раствор для получения конечного объема 160 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Желатиновый раствор можно использовать сразу или хранить при комнатной температуре для последующего использования. Приготовленный желатин стабилен при комнатной температуре в течение 1 месяца. Если потребуется всего несколько плунжеров, то раствор 10 мл может быть изготовлен и стерильно отфильтрован в тот же день, что и изготовление BC-MPS, как описано^{ранее 7.}
   1. Для приготовления желатинового раствора путем фильтрации стерилизации разводят 1 мл 10x HBSS с 9 мл_H2O, чтобы сделать 1x раствор HBSS в конической трубке 15 мл. Добавьте 100 мкл 1 М NaOH к каждой пробирке 10 мл, а затем добавьте 0,7 г желатина в раствор. Энергично перемешайте раствор, чтобы растворить желатин.
   2. Высиживайте трубку на водяной бане при 75 °C в течение 20 минут, встряхивая каждые 5 минут. Используйте шприц 10 мл и шприц-фильтр 0,22 мкм для фильтрации желатинового раствора. Отфильтруйте желатиновый раствор непосредственно на плунжерах в шкафу биобезопасности.
4. 3D-печать или использование простого акрила для изготовления плунжеров, используемых для переноса листов ячеек. Убедитесь, что плунжеры свободно вписываются в нужный размер колодца. Стандартный 3D-печатный плунжер показан на рисунке 1. Плунжеры могут быть спроектированы с использованием стандартного программного обеспечения для автоматизированного проектирования, такого как TinkerCad, и напечатаны с использованием 3D-принтеров с нитью, совместимых с полимолочной кислотой (PLA)^13,14.
5. Для подготовки стойки для удержания плунжеров поместите трубчатую стойку на 15 мл в шкаф биобезопасности. Поместите плунжеры вверх ногами в стойку так, чтобы нижняя часть плунжеров была обращена вверх. Поместите пластиковую коробку с крышкой для транспортировки BC-MPS в шкаф биобезопасности. Рекомендуется, чтобы коробка была не менее 35,5 см длиной x 28 см шириной x 8,25 см высотой, чтобы поместиться 4 пластины BC-MPS. Снимите крышку с коробки и распылите вниз стойку, плунжеры и коробку с 70% EtOH.
6. Подготовьте стерильные бритвенные лезвия и щипцы путем автоклавирования или путем помещения их в шкаф биобезопасности и промывки 70% EtOH.
7. Распылите плунжеры и коробку с 70% EtOH и включите ультрафиолетовый свет в шкафу биобезопасности не менее чем на 30 минут, чтобы стерилизовать расходные материалы.

3. Подготовьте желатиновые плунжеры и нанесите на верхние листы клеток

1. Если желатиновый раствор был предварительно приготовлен, нагрейте его на водяной бане при температуре 37°С, чтобы растопить.
2. Пипетка желатиновым раствором на плунжеры в шкафу биобезопасности с помощью серологической пипетки 5 или 10 мл. Плунжер на 1 скважину из 6-ю скважинной пластины потребует ~2,5 мл желатина.
3. После того, как желатин затвердеет на плунжерах (~30-45 мин), переместите пластины ASC с покрытием pNIPAAm в шкаф биобезопасности. Аккуратно поместите плунжеры в колодцы пластин ASC с покрытием pNIPAAm так, чтобы желатин контактировал с ИСС. Поместите металлическую шайбу (~7,5 г) на плунжер, чтобы утяжелеть плунжер так, чтобы желатин находился в непосредственном контакте с листом ячейки ASC. Оставьте плунжеры на листах ячейки ASC при комнатной температуре на 30 мин.
4. Осторожно переместите пластину с плунжерами в стерильную коробку в шкафу биобезопасности и поместите на нее крышку. Переместите коробку в холодильник с 4 °C на 30 минут. Если холодильник с 4 °C недоступен, поместите тарелку на лед в ведро со льдом в шкаф биобезопасности на 30 минут.

4. Подготовка линий раковых клеток

1. Засейте линии раковых клеток в стандартную чашку для культуры тканей T75 и храните их в культуре, чтобы они были ~ 80% сливаться в день обработки BC-MPS. (~ 200 000 раковых клеток потребуется на BC-MPS). Выращивайте раковые клетки в нормальных средах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для идентификации и изоляции раковых клеток рекомендуется, чтобы клетки были трансфекционными флуоресцентными белками, чтобы отличить их от ИСС и ткани молочной железы. Количество раковых клеток, необходимых для BC-MPS, было оптимизировано для клеток MCF7 и MDA-MB-231. Другие клеточные линии могут потребовать дальнейшей оптимизации.
2. В день подготовки BC-MPS переместите колбу, содержащую раковые клетки, в кабинет биобезопасности. Аспирировать мочку из колбы. Промыть колбу 5 мл PBS.
3. Добавьте 1 мл раствора клеточного отслоения в колбу, содержащую раковые клетки, а затем инкубируют колбу в инкубаторе с 37 °C до тех пор, пока клетки не отделятся (~2-5 мин).
4. В шкафу биобезопасности добавляют 9 мл PBS в колбу, переносят клетки pBS в коническую трубку 15 мл и подсчитывают номер клеток с помощью гемоцитометра.
5. Центрифугируют раковые клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
6. Повторно суспендируют ячейки в среде BC-MPS таким образом, чтобы было 2 x 10⁶ ячеек / мл.
7. Поместите раковые клетки в водяную баню с 37 °C, пока они не будут готовы к добавлению в ткани человека.

5. Обработка тканей молочной железы человека

1. В шкафу биобезопасности промыть ткань молочной железы человека (HBT) 3x с 10 мл стерильного PBS.
2. Используйте стерильные щипцы и лезвие бритвы, чтобы грубо измерзть BC-MPS и попытаться удалить как можно больше фасций и соединительной ткани. Неспособность удалить соединительную ткань может привести к тому, что верхний слой ASC не будет должным образом закреплять HBT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фасция и соединительная ткань могут быть идентифицированы по ее белому или прозрачному внешнему виду по сравнению с желтым цветом жировой ткани.
3. После того, как соединительная ткань была удалена, используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы мелко измечить ткань, пока она не обреаст однородную жидкую консистенцию. Ткань тонко изменяется, когда ее можно легко пипетить с помощью серологического наконечника 25 мл.
4. Используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы отрезать наконечник от наконечника пипетки p1000, чтобы помочь в пипетке измельченного HBT.
5. В пробирке 1,5 мл смешайте измельченный HBT, линии раковых клеток и жиму BC-MPS (для 1 скважины из 6-й пластины для этого требуется 200 мкл измельченного HBT, 100 мкл среды BC-MPS и 100 мкл раковых клеток).
6. Переместите пластину ASC, которая будет использоваться для нижнего листа ячейки, из инкубатора в шкаф биобезопасности. Аспирировать носитель с нижней пластины ASC. Пипетка смеси на центр колодца нижней пластины ASC с помощью наконечника пипетки p1000, у которого дистальный конец был отрезан от шага 5.4
7. Переместите коробку, содержащую верхнюю пластину ASC с плунжерами на ней, в шкаф биобезопасности. Аккуратно снимите желатиновые плунжеры с пластины, покрытой pNIPAAm, и поместите поверх смеси HBT. Добавьте в скважину носитель BC-MPS (на 1 скважину из 6-скважинной пластины добавьте 2 мл среды). Осторожно переместите нижние пластины ASC со смесью BC-MPS и плунжерами в стерильную пластиковую коробку и поместите крышку коробки для транспортировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка пластины с 6 скважинами не будет помещаться обратно на пластину ASC, пока плунжеры включены. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать заражения культуры.
8. Инкубируют нижнюю пластину в коробке в инкубаторе при 37°С до тех пор, пока желатин не расплавится, а верхний слой ASC не начнет прилипать к нижнему слою (~30 мин).
9. Переместите коробку с пластинами в шкаф биобезопасности. Аккуратно снимите плунжеры с нижних пластин. Ткань с раковыми клетками будет закреплена на дне колодца.
10. Поместите крышку 6-скважинной пластины обратно на нижнюю пластину и инкубировать при 37 °C, чтобы полностью расплавить желатин и позволить верхнему слою полностью закрепиться на нижнем слое (~ 30-60 мин).
11. Аккуратно переместите пластины в шкаф биобезопасности и аспирируйте жиме серологической пипеткой 10 мл. Добавьте 2 мл свежих сред в каждую скважину. Аспирировать от края колодца и пипетку на край колодца, чтобы избежать смещения ткани.
12. Поддерживайте BC-MPS при 37 °C и 5% CO 2 в течение желаемого периода_{времени} и меняйте носитель каждые 2-3 дня.

6. Переваривание BC-MPS для анализа

1. Когда BC-MPS будет готов к анализу, переместите пластину в шкаф биобезопасности. Удалите жижи серологической пипеткой, чтобы избежать случайного смещения любой ткани.
2. Добавьте 1 объем PBS к каждой скважине.
3. Снимите PBS серологической пипеткой.
4. Добавьте 1 мл раствора для диссоциации клеток в каждую скважину. Переместите пластину обратно в инкубатор и инкубировать при 37 °C в течение 5 минут, чтобы клетки отсоегорели. В шкафу биобезопасности используйте клеточный скребок, чтобы полностью отсоедить клетки и ткани от культуральная пластина.
5. Переложите раствор с тканью в коническую трубку 15 мл с помощью серологической пипетки. Добавьте 2 мл PBS в каждую скважину, чтобы собрать оставшиеся ячейки и перенести этот раствор в коническую трубку. Если ячейки флуоресцентные, оберните трубку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.
6. Инкубируют трубку при 37 °C при постоянном перемешивании в орбитальном шейкере при 1 х г в течение 10-20 мин, чтобы полностью диссоциировать клетки из ткани.
7. В шкафу биобезопасности используйте серологическую пипетку, чтобы разрушить любые оставшиеся скопления клеток в пробирке и отфильтровать образец через тканевой сетчатый фильтр 250 мкм в новую пробирку 15 мл. Пипетку раствора медленно пробирают через ситечко, чтобы он не переполнился.
8. Промойте ситечко 1 мл PBS, чтобы собрать все клетки, все еще наблюдав в ситечке.
9. Центрифугировать образцы при 500 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугирования адипоциты будут плавать на верхнем слое раствора, в то время как раковые клетки и ИСС будут смешаны вместе в грануле в нижней части трубки.
10. Для выделения адипоцитов аккуратно перелейте верхний слой в новую трубку или альтернативно отрежьте наконечник пипетки p1000 и перенесите верхний слой в новую трубку. Центрифугируйте образец при 500 х г в течение 5 мин еще раз и используйте шприц и иглу для удаления раствора из-под адипоцитов так, чтобы остались только адипоциты. Адипоциты теперь готовы к анализу
11. После удаления адипоцитов из раствора отделите ИСС и раковые клетки друг от друга для анализа, если раковые клетки ранее были трансфектированы флуоресцентным белком. Аспирировать оставшийся раствор из трубки, содержащей ИСК и раковые клетки, не нарушая клеточную гранулу. Повторно суспендируйте гранулы в среде PBS или BC-MPS и используйте проточную цитометрию для сортировки клеток на основе флуоресценции.

Результаты

Стабильность в культуре
BC-MPS представляет собой стабильную микрофизиологическую систему, которую можно культивировать in vitro в течение не менее 14 дней. Яркое изображение листов ячейки ASC было сделано с 100-кратным увеличением для отображения полосатого рисунк...

Обсуждение

Новые системы моделирования рака молочной железы человека необходимы для лучшего понимания заболевания. Разработка микрофизиологических систем человека для моделирования условий заболевания, которые включают нативные ECM и стромальные клетки, увеличит прогностическую силу доклинич...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Innovative Cell Technologies	1333	Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase	Corning	25-058-CI	Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz	National Scientific Supply Co	MPCE-T016	For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks	Corning	430641U	For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL	ThermoScientific	339650
Curved Forceps	ThermoScientific	1631T5	For maneuvering tissue while mincing
DMEM low glucose, w/ Glutamax	Gibco	10567-014	For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified	Gibco	26140-079
Gelatin	Sigma	G9391
HBSS 10x	Gibco	14185-052
NaOH	Sigma	221465
Nunc UpCell 6 well plates	ThermoScientific	174901	Top ASC cell sheet
PBS	Gibco	10010-023
Pen/Strep 5,000U	Gibco	15070-063
Petri Dish 150 cm	FisherBrand	FB0875714	For holding tissue while mincing
Razor Blades	VWR	55411-055	Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um	ThermoScientific	87791	For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates	Corning	3506	Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers	BCP Fasteners	BCP672	For weighing plungers down 1/2" inner diameter