微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

要約

このプロトコルは、貯蔵材料を使った原発性ヒト乳房組織を用いて乳癌を研究するためのインビトロ微小生理学的システムの構築を記述する。

要約

乳癌(BC)は依然として女性の主要な死因である。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験に失敗しています。したがって、病気の理解を深めるために新しいモデルが必要です。NIHの微生理学的システム(MPS)プログラムは、基礎科学の発見の臨床翻訳を改善し、新しい治療戦略を有望にするために開発されました。ここでは、乳癌(BC-MPS)のMPSを生成する方法を提示する。このモデルは、脂肪由来幹細胞シート(ASC)sの間にWATを挟み込み、ヒト一次脂肪組織(WAT)を培養するという先に説明したアプローチを適応させる。BC-MPSの新しい側面には、BC細胞を非疾患ヒト乳房組織(HBT)に播種し、天然の細胞外マトリックス、成熟した腺細胞、常駐線維芽細胞、免疫細胞を含む。HBT由来ASCシート間でBC-HBT混和剤を挟み込む。得られたBC-MPSは、少なくとも14日間の培養ex vivoにおいて安定である。このモデルシステムは、アディポサイト、間質細胞、免疫細胞、および細胞外マトリックスを含むBCに影響を与える微小環境の複数の要素を含む。したがって、BC-MPSは、BCとその微小環境との相互作用を研究するために使用することができる。

我々は、癌の進行と転移に影響を及ぼすと知られている2つのBC行動を研究することによって、BC-MPSの利点を実証する:1)BC運動性および2)BC-HBT代謝クロストーク。BC運動は以前、生体内イメージングを用いて実証されていましたが、BC-MPSでは数日間にわたって蛍光顕微鏡を用いた高分解能のタイムラプスイメージングが可能です。さらに、代謝クロストークは、BC細胞と未熟なアディポサイトに分化したマウス前アディポサイトを使用して以前に実証されましたが、BC-MPSモデルは、初代ヒト乳腺細胞とBC細胞の間でこのクロストークを実証した最初のシステムです。

概要

毎年、40,000人以上の米国の女性が乳癌(BC)1で死亡しています。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験^2,3に失敗しています。医薬品開発パイプラインとBCの理解を深めるためには、新しいモデルが必要です。NIHマイクロ生理学(MPS)プログラムは、基礎科学を臨床成功に翻訳するための画期的なモデルに必要な機能を説明^{しました 4}.これらには、ヒトの原発性細胞または組織の使用、4週間の培養における安定、およびネイティブ組織アーキテクチャおよび生理学的応答の包含が含まれていた。

BC細胞株の2次元培養、膜挿入共培養、三次元スフェロイドおよびオルガノイドなどの現在のインビトロBCモデルは、いずれも在来乳房組織アーキテクチャを再現しないため、NIHのMPS基準を満たしていない。細胞外マトリックス(ECM)がこれらのシステムに添加されると、乳房ECMは使用されません。代わりに、コラーゲンゲルと原膜マトリックスが使用されます。

患者由来異種移植片(PDX)などの生体外システムの電流は、同様に、マウス乳腺組織がヒトの乳房と大きく異なるため、NIHのMPS基準を満たしていない。さらに、免疫系とBCの相互作用は腫瘍の発症の鍵としてますます認識されているが、PDX腫瘍を発生させる免疫不全マウスモデルは成熟したT細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞を欠いている。さらに、PDXは原発性乳房腫瘍を維持および拡張することを可能にするが、得られたPDX腫瘍は原発性マウス間質細胞および^ECM5とに浸潤される。

これらの課題を克服するために、我々はNIH MPS基準を満たす新しい、ex vivo、3次元の人間の乳房MPSを開発しました。私たちの乳房MPSの基礎は、脂肪由来幹細胞(ASC)の2枚のシートの間に原発性ヒト乳房組織(HBT)を挟み込み、HBTからも分離することによって作られる(図1)。HBTを挟むためにセルシートを移すプランジャーは、3Dプリントまたはシンプルなアクリルプラスチックから作ることができます(図1H、I)。この技術は、原発性ヒト白色椎細胞組織^6,7を培養するための先に述べたアプローチを適応させる。乳房MPSは、標準的なBC細胞株から原発性ヒト乳房腫瘍に至るまで、選択したBCモデルによって播種することができる。ここでは、これらのBC-MPSが数週間培養中安定していることを示します(図2)。乳腺腺細胞、ECM、内皮、免疫細胞などのHBTのネイティブ要素が含まれます (図 3);代謝クロストークなどのBCとHBTの生理学的相互作用を再現する(図4)。最後に、BC-MPSがHBT全体のBC細胞のアメーバ運動の研究を可能にすることを示す(図5)。

プロトコル

すべてのヒト組織は、LSUHSCの機関審査委員会事務所によって承認されたプロトコル#9189に従って収集された。

1. 脂肪由来幹細胞(ASC)の細胞シートの播種

1. 商業ソースからASCを購入するか、確立されたプロトコル^8、9に従うことによって、原発性ヒト乳房組織から分離する。人間の乳房ASCを70%密度(約80,000細胞/cm²表面積)で、10%のウシ胎児血清を添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の6ウェル標準組織培養プレートに、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(BC-MPSメディア)を添加します。セルシートの形成に使用するASCが、通過10より小さくなるようにしてください。
   1. 発生する乳がん微小生理学的システム(BC-MPS)の各ウェルについて、1つの標準的な組織培養井戸の種子細胞と同様の大きさの1つのポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAAm)コーティングされた組織培養プラスチックプレート。BC-MPSの1つの6ウェルプレートは、1つの標準的な組織培養6ウェルプレート(底)と1つのpNIPAAmコーティングプレート(上)を必要とする。pNIPAAmプレートは、市販のソースから購入することも、ラボ内^10、11、12をコーティングすることもできます。
2. 培養ASCは、37°Cおよび5%CO2で組織培養インキュベーター中に含_まれる。バイオセーフティキャビネットで2~3日ごとにメディアを交換してください。
3. ASCが100%コンフルエントになるまで培養し、線状のパターンを形成します。彼らが播種された合流点に応じて、これは7-10日かかります。コンフルエント細胞シートは浮力脂肪乳房組織を固定するために必要とされる。

2. BC-MPSに必要な補給品の準備

1. 6ウェルプレート用のゼラチンを調製するには、蒸留した_H2Oで12%ゼラチン溶液を作り、ゼラチンタイプB(ゲル強度は〜225ブルーム)と125mLの_H2Oを250mLガラス培地ボトルに混ぜます。1 M NaOH の 1.6 mL を溶液に加えるし、pH を中和します。
2. 25分間液体サイクル下で溶液をオートクレーブし、溶液を殺菌します。
3. 溶液を37°Cに冷却します。 滅菌バイオセーフティキャビネットでは、溶液に16mLの無菌10xハンクスバランス塩溶液(HBSS)を加え、160mLの最終容積を得る。
   注:ゼラチン溶液はすぐに使用するか、または後で使用するために室温で保存することができます。調製したゼラチンは室温で1ヶ月間安定である。ほんの数個のプランジャーが必要な場合、10 mL溶液を作り、前述の⁷のようにBC-MPSを作るのと同じ日に無菌でフィルタリングすることができます。
   1. フィルター滅菌法でゼラチン溶液を調製するには、10x HBSSの1mLを9 mLの_H2Oで希釈し、15 mLの円錐管に1x HBSS溶液を作製した。10 mL チューブに 1 M NaOH の 100 μL を加え、0.7 g のゼラチンを溶液に加えます。ゼラチンを溶解するために溶液を激しく混ぜる。
   2. 75°Cの水浴でチューブを5分ごとに20分間振ってインキュベートします。ゼラチン溶液をフィルター処理するには、10 mLシリンジと0.22 μmのシリンジフィルターを使用します。バイオセーフティキャビネットのプランジャーにゼラチン溶液を直接フィルターします。
4. 3Dプリントまたは簡単なアクリルを使用して、セルシートを転送するために使用されるプランジャーを作ります。プランジャーが望ましいサイズの井戸にゆるやかに収まることを確認してください。標準の 3D 印刷プランジャを図 1に示します。プランジャーはTinkerCadのような標準的なコンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して設計することができ、ポリ乳酸^(PLA)13、14と互換性のあるフィラメント3Dプリンタを使用して印刷される。
5. プランジャーを保持するためのラックを準備するには、バイオセーフティキャビネットに15 mLチューブラックを置きます。プランジャーの底面が上向きになるように、プランジャーをラックに逆さまに置きます。BC-MPSを輸送するための蓋付きのプラスチック製の箱をバイオセーフティキャビネットに入れます。箱はBC-MPSの4つの版に合うために少なくとも35.5 cmの長さx 28 cmの幅x8.25 cmの高さであることを推薦する。箱から蓋を外し、ラック、プランジャー、および70%のEtOHでボックスを吹き付けます。
6. 無菌カミソリの刃と鉗子をオートクレーブするか、バイオセーフティキャビネットに入れて70%のEtOHで洗浄して準備します。
7. 70%のEtOHでプランジャーとボックスをスプレーし、少なくとも30分間バイオセーフティキャビネットのUVライトをオンにして消耗品を殺菌します。

3. ゼラチンプランジャーを準備し、上のセルシートに適用

1. ゼラチン溶液をあらかじめ調製した場合は、それを37°Cの水浴で加熱して溶融させる。
2. 5 mL または 10 mL 血清ピペットを使用して、バイオセーフティ キャビネット内のプランジャーにゼラチン溶液をピペットします。6ウェルプレートの1ウェル用プランジャーは、ゼラチンの〜2.5 mLを必要とします。
3. ゼラチンがプランジャー(〜30〜45分)で固まったら、pNIPAAmコーティングされたASCプレートをバイオセーフティキャビネットに移動させます。ゼラチンがASCに接触するように、pNIPAAmコーティングされたASCプレートの井戸にプランジャーをそっと置きます。プランジャーに金属ワッシャー(約7.5g)を置き、ゼラチンがASC細胞シートに直接接触するようにプランジャーを計量します。ASCセルシートのプランジャーを室温で30分間放置します。
4. プランジャー付きプレートをバイオセーフティキャビネットの滅菌箱にそっと動かし、蓋をします。箱を4°Cの冷蔵庫に30分間移動します。4°Cの冷蔵庫が利用できない場合は、30分間のバイオセーフティキャビネットのアイスバケツに氷の上にプレートを置きます。

4. がん細胞株の調製

1. 標準的なT75組織培養皿に癌細胞株を播種し、BC-MPSが処理される日に約80%コンフルエントになるように培養しておきます。(BC-MPS当たり20万個のがん細胞が必要になります)。正常な培地で癌細胞を成長させます。
   注:がん細胞を同定して単離するには、細胞を蛍光タンパク質でトランスフェクトしてASCや乳房組織と区別することをお勧めします。BC-MPS当たりに必要ながん細胞の数は、MCF7およびMDA-MB-231細胞に対して最適化されています。他の細胞株は、さらなる最適化を必要とするかもしれない。
2. BC-MPSが準備されている日に、癌細胞を含むフラスコをバイオセーフティキャビネットに移動させる。フラスコからメディアを吸引する。5 mLのPBSでフラスコを洗います。
3. 癌細胞を含むフラスコに1mLの細胞剥離液を加え、細胞が剥離するまでフラスコを37°Cインキュベーターでインキュベートする(〜2〜5分)。
4. バイオセーフティキャビネットでは、9 mLのPBSをフラスコに加え、PBS内の細胞を15 mL円錐管に移し、ヘモサイトメーターを使用して細胞数を数えます。
5. 癌細胞を室温で5分間500xgで遠心分離する。
6. 2 x 10⁶ 個のセル/mL が存在するように、BC-MPS メディアのセルを再中断します。
7. 癌細胞を37°Cの水浴に入れ、ヒト組織に加える準備が整うまで入れます。

5. ヒト乳房組織の加工

1. バイオセーフティキャビネットでは、ヒト乳房組織(HBT)3xを10 mLの無菌PBSで洗浄します。
2. 無菌鉗子とカミソリの刃を使用してBC-MPSを粗くミンチし、できるだけ多くの筋膜および結合組織を除去してみてください。結合組織を除去しないと、HBTを適切に固定しないASC上層が生じる可能性があります。
   注:鼻隠しおよび結合組織は脂肪組織の黄色と比較して白または明確な外観によって識別することができる。
3. 結合組織が除去されたら、滅菌カミソリの刃を使用して、均質な液体の一貫性がなくなるまで組織を細かくミンチします。組織は、25 mLの血清学的先端を使用して容易にピペット加工できる場合に細かく細かく刻む。
4. 滅菌カミソリの刃を使用して、p1000ピペットチップの先端を切り落とし、ひき肉HBTをピペット化するのを助けます。
5. 1.5 mLチューブでは、細かく入ったHBT、がん細胞株、およびBC-MPS培地(6ウェルプレートの1ウェルに対して、200μLの細切りHBT、100μLのBC-MPS培地、100μLの癌細胞)を混合します。
6. 下部セルシートに使用する ASC プレートをインキュベーターからバイオセーフティ キャビネットに移動します。下部ASCプレートからメディアを吸引します。ステップ5.4から遠位端を切り取ったp1000ピペットチップを使用して、底ASCプレートのウェルの中央に混合物をピペット
7. 上部のASCプレートを含むボックスを、プランジャーを置いてバイオセーフティキャビネットに移動します。pNIPAAmコーティングプレートからゼラチンプランジャーを静かに取り出し、HBT混合物の上に置きます。ウェルにBC-MPSメディアを追加します(6ウェルプレートの1ウェルに2mLのメディアを追加します)。BC-MPS混合物とプランジャーを含む底のASCプレートを滅菌プラスチックボックスに慎重に移動させ、箱の蓋を入れ、輸送します。
   注:6ウェルプレートの蓋は、プランジャーがオンになっている間はASCプレートに戻りません。文化を汚染しないように注意する必要があります。
8. ゼラチンが溶けるまで37°Cで箱の中の底板をインキュベーターにインキュベートし、最上のASC層が底層に付着し始めた(〜30分)。
9. プレート付きのボックスをバイオセーフティキャビネットに移動します。下のプレートからプランジャーをそっと取り出します。癌細胞を有する組織は、井戸の底に固定されます。
10. 6ウェルプレートの蓋を底板に戻し、37°Cでインキュベートしてゼラチンを完全に溶融させ、最上層を底層に完全に固定させます(〜30〜60分)。
11. プレートをバイオセーフティキャビネットにそっと移動し、10 mL血清ピペットでメディアを吸引します。各井戸に新鮮なメディアの2 mLを追加します。組織を取り除かないように、井戸とピペットの端から井戸の端に吸引する。
12. BC-MPSを37°C、5%CO2で所望の時間を維持し、2〜3日ごとにメディアを交換してください。

6. 分析のためのBC-MPSの消化

1. BC-MPSを分析する準備ができたら、プレートをバイオセーフティキャビネットに移動します。セロロジカルピペットでメディアを除去し、偶発的な組織の脱外を避けます。
2. 各井戸にPBSの1ボリュームを追加します。
3. 血清ピペットでPBSを取り出します。
4. 各ウェルに細胞の解離液の1 mLを追加します。プレートをインキュベーターに戻し、37°Cで5分間インキュベートし、細胞を取り外します。バイオセーフティキャビネットでは、細胞スクレーパーを使用して、細胞と組織を培養プレートから完全に取り外します。
5. 血清ピペットを使用して、組織と溶液を15 mLの円錐管に移します。各ウェルに2 mLのPBSを加えて、残りの細胞を収集し、この溶液を円錐管に移します。細胞が蛍光である場合は、チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。
6. 1 x g の軌道シェーカーで一定の撹拌の下で 37 °C でチューブをインキュベートし、細胞を組織から完全に解離します。
7. バイオセーフティキャビネットでは、血清学的ピペットを使用してチューブ内の残りの細胞塊を破壊し、250 μmの組織ストレーナーを通してサンプルを新しい15 mLチューブにフィルターします。それがオーバーフローしないように、ストレーナーを通してゆっくりと溶液をピペット。
8. ストレーナーを1 mL PBSでリンスし、ストレーナーに残っている細胞を採取します。
9. 室温で500 x g でサンプルを5分間遠心する。遠心分離後、アディポサイトは溶液の最上層に浮遊し、癌細胞とASCはチューブの下部のペレットに一緒に混合されます。
10. アディポサイトを分離するには、新しいチューブに最上層を静かに注ぐか、代わりにp1000ピペットチップから先端を切断し、上層を新しいチューブに移します。500 x g でサンプルを 5 分間遠心分離し、シリンジと針を使用して、アディポサイトの下から溶液を除去し、アディポサイトのみが残るようにします。アディポサイトは分析の準備が整いました
11. 溶液からアディポサイトを除去した後、癌細胞が以前に蛍光タンパク質でトランスフェクションされた場合、ASCと癌細胞を互いに分離して分析する。細胞ペレットを破壊することなく、ASCおよび癌細胞を含むチューブから残りの溶液を吸引する。PBSまたはBC-MPS培地中のペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを使用して蛍光に基づいて細胞を選別します。

結果

培養の安定性
BC-MPSは、少なくとも14日間インビトロで培養することができる安定した微生理学的システムである。ASC細胞シートの明視野画像を100倍倍で撮影し、コンフルエントシートの線状パターンを表示した(図2A)。ASC細胞シートは、少なくとも4週間培養において安定である。6ウェルプレートの1ウェルで培養した14日でのBC-MPS?...

ディスカッション

ヒト乳癌をモデル化するための新しいシステムは、この疾患のより良い理解を開発するために必要とされる。ネイティブECMおよび間質細胞を含む疾患設定をモデル化するヒト微小生理学的システムの開発は、前臨床試験の予測力を高める。ここで示すBC-MPSモデルは、以前のモデルの限界を克服し、ネイティブHBT環境でのBCの評価を可能にする新開発のシステムです。このシステムは癌細胞株?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Innovative Cell Technologies	1333	Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase	Corning	25-058-CI	Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz	National Scientific Supply Co	MPCE-T016	For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks	Corning	430641U	For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL	ThermoScientific	339650
Curved Forceps	ThermoScientific	1631T5	For maneuvering tissue while mincing
DMEM low glucose, w/ Glutamax	Gibco	10567-014	For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified	Gibco	26140-079
Gelatin	Sigma	G9391
HBSS 10x	Gibco	14185-052
NaOH	Sigma	221465
Nunc UpCell 6 well plates	ThermoScientific	174901	Top ASC cell sheet
PBS	Gibco	10010-023
Pen/Strep 5,000U	Gibco	15070-063
Petri Dish 150 cm	FisherBrand	FB0875714	For holding tissue while mincing
Razor Blades	VWR	55411-055	Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um	ThermoScientific	87791	For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates	Corning	3506	Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers	BCP Fasteners	BCP672	For weighing plungers down 1/2" inner diameter