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Résumé

Ce protocole décrit la construction d’un système microphysiologique in vitro pour étudier le cancer du sein utilisant le tissu humain primaire de sein avec les matériaux de commerce.

Résumé

Le cancer du sein (C.-B.) demeure l’une des principales causes de décès chez les femmes. Malgré plus de 700 millions de dollars investis dans la recherche en Colombie-Britannique chaque année, 97 % des médicaments candidats de la Colombie-Britannique échouent aux essais cliniques. Par conséquent, de nouveaux modèles sont nécessaires pour améliorer notre compréhension de la maladie. Le programme de systèmes microphysiologiques (MPS) des NIH a été développé pour améliorer l’application clinique des découvertes scientifiques fondamentales et des nouvelles stratégies thérapeutiques prometteuses. Nous présentons ici une méthode de génération de MPS pour les cancers du sein (BC-MPS). Ce modèle adapte une approche précédemment décrite de culture du tissu adipeux blanc humain primaire (WAT) en prenant en sandwich WAT entre les feuilles de cellules souches adipeuses-dérivées (ASC) s. Les nouveaux aspects de notre BC-MPS comprennent l’ensemencement de cellules BC dans le tissu mammaire humain non malade (HBT) contenant la matrice extracellulaire native, les adipocytes matures, les fibroblastes résidents et les cellules immunitaires; et la prise en sandwich du mélange BC-HBT entre les feuilles ASC dérivées de HBT. Le BC-MPS résultant est stable en culture ex vivo pendant au moins 14 jours. Ce système modèle contient plusieurs éléments du microenvironnement qui influencent la Colombie-Britannique, y compris les adipocytes, les cellules stromales, les cellules immunitaires et la matrice extracellulaire. Ainsi, BC-MPS peut être utilisé pour étudier les interactions entre BC et son microenvironnement.

Nous démontrons les avantages de notre BC-MPS en étudiant deux comportements de BC connus pour influencer la progression et la métastase de cancer : 1) motilité de BC et 2) diaphonie métabolique de BC-HBT. Tandis que la motilité de BC a été précédemment démontrée utilisant l’imagerie intravital, BC-MPS tient compte de l’imagerie time-lapse à haute résolution utilisant la microscopie de fluorescence pendant plusieurs jours. En outre, tandis que la diaphonie métabolique a été précédemment démontrée utilisant des cellules de BC et des pre-adipocytes murins différenciés en adipocytes non mûrs, notre modèle de BC-MPS est le premier système à démontrer cette diaphonie entre les adipocytes mammaires humains primaires et les cellules de BC in vitro.

Introduction

Chaque année, plus de 40 000 femmes américaines meurent d’un cancer du sein (BC)1. Malgré plus de 700 millions de dollars investis dans la recherche en Colombie-Britannique chaque année, 97 % des médicaments candidats de la Colombie-Britannique échouent aux essais cliniques2,3. De nouveaux modèles sont nécessaires pour améliorer le pipeline de développement de médicaments et notre compréhension de la Colombie-Britannique. Le programme microphysiologique (MPS) des NIH a délimité les caractéristiques requises pour des modèles révolutionnaires visant à améliorer la traduction de la science fondamentale en succès clinique4. Ceux-ci comprenaient l’utilisation de cellules ou de tissus humains primaires, stables en culture pendant 4 semaines, et l’inclusion de l’architecture tissulaire native et de la réponse physiologique.

Les modèles actuels in vitro de BC, tels que la culture bidimensionnelle des variétés de cellule de BC, la co-culture d’insertion de membrane, et les sphéroïdes et organoïdes tridimensionnels, ne répondent pas aux critères de MPS des NIH parce qu’aucun de ces derniers récapitule l’architecture native de tissu de sein. Lorsque la matrice extracellulaire (ECM) est ajoutée à ces systèmes, l’ECM du sein n’est pas utilisée; au lieu de cela, des gels de collagène et des matrices de membrane basale sont utilisés.

Les systèmes in vivo actuels, tels que les xénogreffes dérivées de patients (PDX), ne répondent pas de même aux critères de MPS des NIH parce que les tissus mammaires murins diffèrent considérablement des seins humains. D’ailleurs, les interactions système immunitaire-BC sont de plus en plus reconnues comme clés dans le développement de tumeur, mais les modèles murins immunocompromised utilisés pour générer des tumeurs pdx manquent des cellules T mûres, des cellules de B, et des cellules tueuses naturelles. En outre, tandis que PDX permet aux tumeurs primaires de sein d’être maintenues et développées, les tumeurs de PDX résultantes sont infiltrées avec les cellules stromal murines primaires et l’ECM5.

Pour surmonter ces défis, nous avons développé un nouveau, ex vivo, mps humain tridimensionnel de sein qui répond aux critères de MPS nih. La base de notre MPS mammaire est faite en sandwichant le tissu mammaire humain primaire (HBT) entre deux feuilles de cellules souches dérivées de l’adipose (ASC), également isolées de HBT (Figure 1). Les pistons pour le transfert des feuilles de cellules en sandwich le HBT peuvent être imprimés en 3D ou fabriqués à partir de plastiques acryliques simples(Figure 1H,I). Cette technique adapte notre approche précédemment décrite pour la culture du tissu adipocytaire blanc humain primaire6,7. Le mps de sein peut alors être ensemencé par un modèle de BC de choix, s’étendant des variétés de cellule standard de BC aux tumeurs humaines primaires de sein. Ici, nous montrons que ces BC-MPS sont stables en culture pendant plusieurs semaines (Figure 2) ; inclure des éléments natifs de l’HBT tels que les adipocytes mammaires, l’ECM, l’endothélium, les cellules immunitaires (Figure 3); et récapituler les interactions physiologiques entre BC et HBT telles que la diaphonie métabolique (Figure 4). Enfin, nous montrons que BC-MPS permet l’étude du mouvement amiboïde des cellules BC dans tout HBT (Figure 5).

Protocole

Tous les tissus humains ont été prélevés conformément au protocole #9189 tel qu’approuvé par le Bureau du Conseil d’examen institutionnel du LSUHSC.

1. Ensemencement de cellules souches dérivées d’adipeux (ASC) pour les feuilles cellulaires

  1. Acheter des CSA de sources commerciales ou isoler du tissu mammaire humain primaire en suivant les protocoles établis8,9. Ensemencer des ASC du sein humain à une densité de 70 % (~ 80 000 cellules/cm2 de surface) sur des plaques de culture tissulaire standard à 6 puits dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétées par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine (milieu BC-MPS). S’assurer que les CSA à utiliser pour former les feuilles cellulaires doivent être inférieurs au passage 10.
    1. Pour chaque puits du système microphysiologique du cancer du sein (BC-MPS) qui sera généré, des cellules de semence dans 1 puits de culture tissulaire standard et 1 puits de taille similaire sur une plaque en plastique de culture tissulaire revêtue de poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm). Une plaque de 6 puits de BC-MPS nécessitera une culture tissulaire standard 6 plaque de puits (en bas) et une plaque revêtue de pNIPAAm (en haut). Les plaques pNIPAAm peuvent être achetées auprès de sources commerciales ou peuvent être revêtues en laboratoire10,11,12.
  2. Culture asc dans un incubateur de culture tissulaire à 37°C et 5% deCO2. Changez les médias tous les 2-3 jours dans une armoire de biosécurité.
  3. Culturez les ASC jusqu’à ce qu’ils deviennent 100% confluents et forment un motif strié. Selon la confluence à laquelle ils ont été ensemencés, cela prendra 7 à 10 jours. Des feuilles de cellules confluentes sont exigées pour ancrer le tissu adipeux flottaillant de sein.

2. Préparation des fournitures nécessaires pour BC-MPS

  1. Pour préparer la gélatine pour les plaques à 6 puits, faites une solution de gélatine à 12% dans H2O. Distillé Mélangez 19 g de gélatine de type B (force de gel de ~ 225 Bloom) et 125 mL deH2O dans une bouteille de support en verre de 250 mL. Ajouter 1,6 mL de NaOH 1 M à la solution pour neutraliser le pH.
  2. Autoclaver la solution sous un cycle liquide pendant 25 min pour stériliser la solution.
  3. Laisser refroidir la solution à 37 °C. Dans une armoire de biosécurité stérile, ajouter 16 mL de solution saline équilibrée (HBSS) hanks stérile 10x à la solution pour obtenir un volume final de 160 mL.
    REMARQUE: La solution de gélatine peut être utilisée immédiatement ou stockée à température ambiante pour une utilisation ultérieure. La gélatine préparée est stable à température ambiante pendant 1 mois. Si seulement quelques pistons sont nécessaires, une solution de 10 mL peut être fabriquée et filtrée stérile le même jour que la fabrication de BC-MPS comme décrit précédemment7.
    1. Pour préparer la solution de gélatine par stérilisation par filtre, diluer 1 mL de 10x HBSS avec 9 mL deH2Opour faire une solution 1x HBSS dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 100 μL de NaOH 1 M à chaque tube de 10 mL, puis ajouter 0,7 g de gélatine à la solution. Mélanger vigoureusement la solution pour dissoudre la gélatine.
    2. Incuber le tube dans un bain-marie à 75 °C pendant 20 minutes en secouant toutes les 5 minutes. Utilisez une seringue de 10 mL et un filtre à seringue de 0,22 μm pour filtrer la solution de gélatine. Filtrer la solution de gélatine directement sur les pistons dans une armoire de biosécurité.
  4. Imprimez en 3D ou utilisez de l’acrylique simple pour fabriquer les pistons utilisés pour transférer les feuilles de cellule. Assurez-vous que les pistons s’adaptent lâchement à la taille souhaitée de puits. Un piston imprimé en 3D standard est illustré à la figure 1. Les pistons peuvent être conçus à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur standard tel que TinkerCad et imprimés à l’aide d’imprimantes 3D à filament compatibles avec l’acide polylactique (PLA)13,14.
  5. Pour préparer un rack pour tenir les pistons, placez un rack à tubes de 15 mL dans une armoire de biosécurité. Placez les pistons à l’envers dans le rack, de sorte que le bas des pistons soit orienté vers le haut. Placez une boîte en plastique avec un couvercle pour le transport de BC-MPS dans l’armoire de biosécurité. Il est recommandé que la boîte ait une longueur d’au moins 35,5 cm x 28 cm de largeur x 8,25 cm de hauteur pour s’adapter à 4 plaques de BC-MPS. Retirez le couvercle de la boîte et vaporisez le rack, les pistons et la boîte avec 70% d’EtOH.
  6. Préparez des lames et des pinces de rasoir stériles en les autoclavant ou en les plaçant dans une armoire de biosécurité et en les lavant avec 70% d’EtOH.
  7. Vaporisez les pistons et la boîte avec 70% d’EtOH et allumez la lumière UV dans l’armoire de biosécurité pendant au moins 30 minutes pour stériliser les fournitures.

3. Préparez les pistons de gélatine et appliquez-les sur les feuilles cellulaires supérieures

  1. Si la solution de gélatine a été préalablement préparée, chauffer dans un bain-marie à 37°C pour la faire fondre.
  2. Pipeter la solution de gélatine sur les pistons de l’armoire de biosécurité à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ou 10 mL. Un piston pour 1 puits d’une plaque de 6 puits nécessitera environ 2,5 mL de gélatine.
  3. Une fois que la gélatine s’est solidifiée sur les pistons (~ 30-45 min), déplacez les plaques ASC revêtues de pNIPAAm vers l’armoire de biosécurité. Placez délicatement les pistons dans les puits des plaques ASC revêtues de pNIPAAm afin que la gélatine entre en contact avec les ASC. Placez une rondelle métallique (~ 7,5 g) sur le piston pour alourdir le piston afin que la gélatine soit en contact direct avec la feuille de cellule ASC. Laissez les pistons sur les feuilles cellulaires ASC à température ambiante pendant 30 min.
  4. Déplacez doucement la plaque avec les pistons dans la boîte stérile de l’armoire de biosécurité et placez le couvercle dessus. Déplacez la boîte dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 30 min. Si un réfrigérateur à 4 °C n’est pas disponible, placez l’assiette sur de la glace dans un seau à glace dans l’armoire de biosécurité pendant 30 min.

4. Préparation des lignées cellulaires cancéreuses

  1. Ensemencez les lignées cellulaires cancéreuses dans un plat de culture tissulaire T75 standard et conservez-les en culture afin qu’elles soient confluentes à environ 80 % le jour où BC-MPS sera traité. (~ 200 000 cellules cancéreuses seront nécessaires par BC-MPS). Cultiver les cellules cancéreuses dans des milieux normaux.
    REMARQUE: Pour identifier et isoler les cellules cancéreuses, il est recommandé que les cellules soient transfectées avec une protéine fluorescente pour les distinguer des ASC et du tissu mammaire. Le nombre de cellules cancéreuses nécessaires par BC-MPS a été optimisé pour les cellules MCF7 et MDA-MB-231. D’autres lignées cellulaires peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire.
  2. Le jour de la préparation du BC-MPS, déplacez le ballon contenant les cellules cancéreuses vers l’armoire de biosécurité. Aspirer le support du ballon. Laver le ballon avec 5 mL de PBS.
  3. Ajouter 1 mL de solution de décollement cellulaire dans le ballon contenant les cellules cancéreuses, puis incuber le ballon dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se sont détachées (~2-5 min).
  4. Dans l’armoire de biosécurité, ajouter 9 mL de PBS au ballon, transférer les cellules du PBS dans un tube conique de 15 mL et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  5. Centrifuger les cellules cancéreuses à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Ressuscitez les cellules dans les médias BC-MPS de sorte qu’il y ait 2 x 106 cellules/mL.
  7. Placer les cellules cancéreuses dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être ajoutées au tissu humain.

5. Traitement du tissu mammaire humain

  1. Dans une armoire de biosécurité, lavez le tissu mammaire humain (HBT) 3x avec 10 mL de PBS stérile.
  2. Utilisez une pince stérile et une lame de rasoir pour hacher grossièrement le BC-MPS et essayez d’enlever autant de fascia et de tissu conjonctif que possible. Le défaut d’enlever le tissu conjonctif peut avoir comme conséquence la couche supérieure de l’ASC pour ne pas ancrer correctement le HBT.
    REMARQUE: Le fascia et le tissu conjonctif peuvent être identifiés par son aspect blanc ou clair par rapport à la couleur jaune du tissu adipeux.
  3. Une fois que le tissu conjonctif a été enlevé, utilisez une lame de rasoir stérile pour hacher finement le tissu jusqu’à ce qu’il ait une consistance liquide homogène. Le tissu est finement haché quand il peut facilement être pipeté utilisant une pointe sérologique de 25 mL.
  4. Utilisez une lame de rasoir stérile pour couper la pointe d’une pointe de pipette p1000 pour aider à pipetter le HBT haché.
  5. Dans un tube de 1,5 mL, mélanger le HBT haché, les lignées cellulaires cancéreuses et les milieux BC-MPS (pour 1 puits d’une plaque de 6 puits, cela nécessite 200 μL de HBT haché, 100 μL de milieu BC-MPS et 100 μL de cellules cancéreuses).
  6. Déplacez la plaque ASC qui sera utilisée pour la feuille de cellule inférieure de l’incubateur à l’armoire de biosécurité. Aspirez le support à partir de la plaque ASC inférieure. Pipetter le mélange sur le centre du puits de la plaque ASC inférieure à l’aide d’une pointe de pipette p1000 dont l’extrémité distale était coupée de l’étape 5.4
  7. Déplacez la boîte contenant la plaque ASC supérieure avec les pistons dessus vers l’armoire de biosécurité. Retirez délicatement les pistons de gélatine de la plaque recouverte de pNIPAAm et placez-les sur le mélange hbt. Ajouter un support BC-MPS au puits (pour 1 puits d’une plaque de 6 puits, ajoutez 2 mL de support). Déplacez soigneusement les plaques ASC inférieures avec le mélange BC-MPS et les pistons vers la boîte en plastique stérile et placez le couvercle de la boîte pour le transport.
    REMARQUE: Le couvercle de la plaque de 6 puits ne rentrera pas sur la plaque ASC pendant que les pistons sont allumés. Il faut prendre soin d’éviter de contaminer la culture.
  8. Incuber la plaque inférieure dans la boîte dans un incubateur à 37 ° C jusqu’à ce que la gélatine ait fondu et que la couche ASC supérieure ait commencé à adhérer à la couche inférieure (~ 30 min).
  9. Déplacez la boîte avec les plaques vers l’armoire de biosécurité. Retirez délicatement les pistons des plaques inférieures. Le tissu avec les cellules cancéreuses sera ancré au fond du puits.
  10. Replacez le couvercle de la plaque de 6 puits sur la plaque inférieure et incuber à 37 ° C pour faire fondre complètement la gélatine et permettre à la couche supérieure de s’ancrer complètement à la couche inférieure (~ 30-60 min).
  11. Déplacez délicatement les plaques dans une armoire de biosécurité et aspirez le support avec une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 2 mL de supports frais à chaque puits. Aspirer du bord du puits et pipetter sur le bord du puits pour éviter de délaliser le tissu.
  12. Maintenir le BC-MPS à 37 °C et 5 % deCO2 pendant la durée souhaitée et changer de milieu tous les 2-3 jours.

6. Digestion du BC-MPS pour analyse

  1. Lorsque le BC-MPS est prêt à être analysé, déplacez la plaque vers l’armoire de biosécurité. Retirez les supports à l’munis d’une pipette sérologique pour éviter le délogement accidentel de tout tissu.
  2. Ajoutez 1 volume de PBS à chaque puits.
  3. Retirez le PBS à l’muni d’une pipette sérologique.
  4. Ajouter 1 mL de solution de dissociation cellulaire à chaque puits. Ramenez la plaque à l’incubateur et incuber à 37 °C pendant 5 min pour permettre aux cellules de se détacher. Dans une armoire de biosécurité, utilisez un grattoir à cellules pour détacher complètement les cellules et le tissu de la plaque de culture.
  5. Transférer la solution avec le tissu dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique. Ajouter 2 mL de PBS à chaque puits pour recueillir les cellules restantes et transférer cette solution dans le tube conique. Si les cellules sont fluorescentes, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
  6. Incuber le tube à 37 °C sous agitation constante dans un agitateur orbital à 1 x g pendant 10-20 min pour dissocier complètement les cellules du tissu.
  7. Dans une armoire de biosécurité, utilisez une pipette sérologique pour perturber les touffes de cellules restantes dans le tube et filtrez l’échantillon à travers une passoire tissulaire de 250 μm dans un nouveau tube de 15 mL. Pipeter la solution lentement à travers la passoire afin qu’elle ne déborde pas.
  8. Rincez la crépine avec 1 mL de PBS pour recueillir toutes les cellules encore dans la passoire.
  9. Centrifuger les échantillons à 500 x g à température ambiante pendant 5 min. Après centrifugation, les adipocytes flotteront sur la couche supérieure de la solution tandis que les cellules cancéreuses et les ASC seront mélangés ensemble dans une pastille au fond du tube.
  10. Pour isoler les adipocytes, versez doucement la couche supérieure dans un nouveau tube ou coupez alternativement la pointe d’une pointe de pipette p1000 et transférez la couche supérieure dans un nouveau tube. Centrifuger à nouveau l’échantillon à 500 x g pendant 5 min et utiliser une seringue et une aiguille pour retirer la solution sous les adipocytes afin qu’il ne reste que les adipocytes. Les adipocytes sont maintenant prêts pour l’analyse
  11. Après avoir retiré les adipocytes de la solution, séparez les ASC et les cellules cancéreuses les unes des autres pour l’analyse si les cellules cancéreuses ont déjà été transfectées avec une protéine fluorescente. Aspirer la solution restante du tube contenant les ASC et les cellules cancéreuses sans perturber la pastille cellulaire. Ressusciter la pastille dans des milieux PBS ou BC-MPS et utiliser la cytométrie en flux pour trier les cellules en fonction de la fluorescence.

Résultats

Stabilité dans la culture
BC-MPS est un système microphysiologique stable qui peut être cultivé in vitro pendant au moins 14 jours. Une image en champ clair des feuilles de cellules ASC a été prise à un grossissement de 100x pour afficher le motif strié de la feuille confluente(Figure 2A). Les feuilles cellulaires ASC sont stables en culture pendant au moins 4 semaines. BC-MPS à 14 jours en culture dans un puits d’une plaque de ...

Discussion

De nouveaux systèmes de modélisation du cancer du sein humain sont nécessaires pour mieux comprendre la maladie. Le développement de systèmes microphysiologiques humains pour modéliser les contextes de la maladie qui incluent des cellules PHY et stromales natives augmentera le pouvoir prédictif des études précliniques. Le modèle BC-MPS présenté ici est un système nouvellement développé qui surmonte les limites des modèles précédents permet l’évaluation de BC dans son environnement HBT natif. Ce syst?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Nous tenons à remercier le tulane flow cytometry et le cell sorting core ainsi que le Tulane Histology Core pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par la southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant et la National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AccumaxInnovative Cell Technologies1333Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
AccutaseCorning25-058-CICell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16ozNational Scientific Supply CoMPCE-T016For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasksCorning430641UFor culturing ASCs
Conical Tubes 15mL ThermoScientific339650
Curved ForcepsThermoScientific1631T5For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ GlutamaxGibco10567-014For culturing ASCs and BC-MPS
FBS QualifiedGibco26140-079
GelatinSigmaG9391
HBSS 10xGibco14185-052
NaOHSigma221465
Nunc UpCell 6 well platesThermoScientific174901Top ASC cell sheet
PBSGibco10010-023
Pen/Strep 5,000UGibco15070-063
Petri Dish 150 cmFisherBrandFB0875714For holding tissue while mincing 
Razor BladesVWR55411-055Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um ThermoScientific87791For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well platesCorning3506Bottom ASC cell Sheet
Weights/WashersBCP FastenersBCP672For weighing plungers down 1/2" inner diameter

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