使用微生理系统模拟人体乳房组织中的乳腺癌

摘要

该协议描述了使用原始人体乳房组织与现成材料研究乳腺癌的体外微生理系统的构建。

摘要

乳腺癌（BC）仍然是妇女的主要死因。尽管每年在不列颠哥伦比亚省的研究上投资超过7亿美元，但97%的候选BC药物没有通过临床试验。因此，需要新的模型来改善我们对这种疾病的理解。NIH微生理系统（MPS）计划旨在改善基础科学发现和有前途的新治疗策略的临床翻译。在这里，我们介绍了一种产生乳腺癌 MPS 的方法 （BC-MPS）。该模型通过将WAT夹在脂肪衍生的干细胞片（ASC）之间，来适应先前描述的培养原人类白脂肪组织（WAT）的方法。我们的BC-MPS的新方面包括将BC细胞植入非疾病的人类乳房组织（HBT），其中含有原生细胞外基质、成熟的脂肪细胞、常驻成纤维细胞和免疫细胞:并将BC-HBT混合在HBT衍生的ASC表之间。由此产生的BC-MPS在文化前活力中稳定至少14天。此模型系统包含影响 BC 的微环境的多个元素，包括脂肪细胞、频闪细胞、免疫细胞和细胞外基质。因此，BC-MPS可用于研究BC与其微环境之间的相互作用。

我们通过研究两种已知影响癌症进展和转移的 BC-MPS 行为来展示我们的 BC-MPS 的优势:1） BC 运动和 2） BC-HBT 代谢相声。虽然 BC-MPS 以前曾使用静脉成像来证明其运动性，但允许使用荧光显微镜在几天内进行高分辨率延时成像。此外，虽然代谢相声以前是使用BC细胞和穆林前脂肪细胞分化成不成熟的脂肪细胞来证明的，但我们的BC-MPS模型是第一个在体外证明原人类乳腺脂肪细胞和BC细胞之间的相声的系统。

引言

每年，超过40，000名美国妇女死于乳腺癌^（BC）1。尽管每年在不列颠哥伦比亚省的研究上投资超过7亿美元，但97%的候选BC药物在临床试验^{中失败2，3。}需要新的模式来改善药物开发管道和我们对不列颠哥伦比亚省的理解。NIH微生理学（MPS）计划界定了突破模型所需的功能，以改进将基础科学转化为临床成功^4。其中包括使用原生人体细胞或组织，稳定培养4周，并纳入原生组织结构和生理反应。

目前的体外BC模型，如BC细胞系的二维培养，膜插入共同培养，三维球体和器官，不符合NIH的MPS标准，因为这些都没有回顾本地乳房组织结构。当细胞外基质 （ECM） 添加到这些系统中时，不使用乳房 ECM:相反，使用胶原蛋白凝胶和地下室膜矩阵。

目前体内系统，如患者衍生的异种移植物（PDX），同样不符合NIH的MPS标准，因为乳腺组织与人类乳房有很大的不同。此外，免疫系统-BC相互作用越来越被公认为肿瘤发展的关键，但用于生成PDX肿瘤的免疫功能低下的穆林模型缺乏成熟的T细胞、B细胞和天然杀伤细胞。此外，虽然PDX允许维持和扩大原发性乳房肿瘤，但由此产生的PDX肿瘤被原发性穆林频闪细胞和ECM⁵渗透。

为了克服这些挑战，我们开发了符合NIH MPS标准的新型、前活体、三维人类乳房MPS。我们的乳房MPS的基础是通过将原发性人类乳房组织（HBT）夹在两片脂肪衍生干细胞（ASCs）之间，也从HBT（图1）中分离出来。将细胞板转移到夹心的柱子可以3D打印或由简单的丙烯酸塑料制成（图1H，I）。这项技术适应了我们以前描述的培养人类白脂肪组织^6，7的方法。然后，乳房MPS可以通过不列颠哥伦比亚省的模型进行播种，从标准的BC细胞系到人类原始乳房肿瘤。在这里，我们显示，这些BC-MPS在文化中稳定了几个星期（图2）:包括HBT的原生元素，如乳腺脂肪细胞，ECM，内皮，免疫细胞（图3）:并回顾BC和HBT之间的生理相互作用，如代谢相声（图4）。最后，我们表明，BC-MPS允许研究整个HBT（图5）中BC细胞的动物体运动。

研究方案

所有人体组织都是按照经LSUHSC机构审查委员会办公室批准的议定书#9189收集的。

1. 为细胞片播种脂肪衍生干细胞（ASC）

1. 从商业来源购买ASC或按照既定协议^8，9从原人类乳房组织分离。种子人类乳房ASCs在70%密度（+80，000细胞/厘米²表面积）到6井标准组织培养板在杜尔贝科的修改鹰介质（DMEM）补充10%胎儿牛血清，和1%青霉素/链霉素（BC-MPS媒体）。确保用于形成细胞片的 ASC 应小于通道 10。
   1. 对于将产生的每口乳癌微生理系统（BC-MPS），1个标准组织培养井中的种子细胞和1个大小相近的多（N-异丙烯酰胺）（pNIPAAm）涂层组织培养塑料板上的种子细胞。一个 6 井的 BC-MPS 板将需要一个标准组织培养 6 井板 （底部） 和一个 pNIPAAm 涂层板 （顶部）。pNIPAAm板可以从商业来源购买，也可以涂在实验室^{10，11，12。}
2. 组织培养孵化器中的培养 ASC 为 37 °C，二氧化碳_{为 5%。}在生物安全柜中每 2-3 天更换一次媒体。
3. 培养 ASC，直到它们成为 100% 的汇合体，并形成一个条纹模式。根据他们播种时的汇合，这需要7-10天。需要结流细胞片来锚定浮力脂肪乳房组织。

2. 准备 BC-MPS 所需的用品

1. 要为 6 井板准备明胶，在蒸馏的 H₂O. 混合 19 克明胶 B 型（凝胶强度为 +225 Bloom）和 125 毫升 H₂O 在 250 mL 玻璃介质瓶中。将 1.6 mL 的 1 M NaOH 添加到中和 pH 的解决方案中。
2. 在液体循环下自动将溶液解25分钟，以消毒溶液。
3. 允许解决方案冷却到 37 °C。 在无菌生物安全柜中，将 16 mL 的无菌 10 倍汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） 添加到溶液中，以获得最终 160 mL 的体积。
   注:明胶溶液可立即使用或储存在室温下供以后使用。准备好的明胶在室温下稳定1个月。如果只需要几个柱塞，那么就可以制作一个10mL的解决方案，并在制造BC-MPS的同一天进行无菌过滤，如前所述^的7。
   1. 要通过滤芯灭菌来制备明胶溶液，用 9 mL 的 H₂O 稀释 1 mL 的 10 倍 HBSS，在 15 mL 锥形管中制作 1 倍 HBSS 溶液。将 100 μL 的 1 M NaOH 添加到每个 10 mL 管中，然后在溶液中加入 0.7 克明胶。将溶液大力混合以溶解明胶。
   2. 将管子孵化在 75 °C 的水浴中，每 5 分钟摇晃 20 分钟。使用 10 mL 注射器和 0.22μm 注射器过滤器过滤明胶溶液。将明胶溶液直接过滤到生物安全柜中的柱塞上。
4. 3D 打印或使用简单的丙烯酸制作用于传输细胞片的柱塞。确保柱塞松散地适合所需的大小井。标准的 3D 打印柱塞显示在图 1 中。柱塞可以使用标准的计算机辅助设计软件，如丁克卡德和打印使用灯丝3D打印机，是兼容的聚乳酸（PLA）13，14。
5. 为了准备一个架子，将一个15mL的管架放在生物安全柜中。将柱塞倒置在机架上，使柱塞底部朝上。在生物安全柜中放置一个带盖子的塑料盒，用于运输 BC-MPS。建议该框至少为 35.5 厘米长 x 28 厘米宽 x 8.25 厘米高，以适合 4 板 BC-MPS。从盒子上取下盖子，用 70% 的 EtOH 喷洒到机架、柱塞和盒子下。
6. 准备无菌剃须刀刀片和钳子，通过自动切割或放置在生物安全柜和洗涤与70%EtOH。
7. 用 70% EtOH 喷洒柱塞和盒子，打开生物安全柜中的紫外线至少 30 分钟，对用品进行消毒。

3. 准备明胶柱塞并涂抹在上部细胞片上

1. 如果明胶溶液以前已准备好，请在 37°C 的水浴中加热以将其熔化。
2. 使用 5 或 10 mL 血清学移液器将明胶溶液输送到生物安全柜中的柱塞上。6井板1口井的柱塞需要约2.5毫升明胶。
3. 一旦明胶凝固在柱塞上（+30-45分钟），将pNIPAAm涂层的ASC板移动到生物安全柜。轻轻地将柱塞放入 pNIPAAm 涂层 ASC 板的井中，以便明胶与 ASC 接触。将金属洗衣机（约7.5克）放在柱塞上，以压低柱塞，使明胶与ASC细胞片直接接触。将柱塞放在 ASC 细胞片上，在室温下 30 分钟。
4. 将柱塞轻轻移动板，放入生物安全柜中的无菌箱中，盖上盖子。将盒子移到 4 °C 冰箱 30 分钟。如果没有 4 °C 冰箱，请将盘子放在生物安全柜的冰桶中 30 分钟。

4. 癌细胞系的准备

1. 将癌细胞系播种在标准的 T75 组织培养皿中，并将其保存在培养物中，以便在 BC-MPS 处理当天它们达到 80% 的汇流。（BC-MPS 需要 200，000 个癌细胞）。在正常介质中生长癌细胞。
   注意:为了识别和分离癌细胞，建议细胞与荧光蛋白相分离，以区别于ASC和乳房组织。MCF7 和 MDA-MB-231 细胞优化了每个 BC-MPS 所需的癌细胞数量。其他细胞系可能需要进一步优化。
2. 在 BC-MPS 正在准备的当天，将含有癌细胞的烧瓶移到生物安全柜。从烧瓶中吸气媒体。用 5 mL 的 PBS 清洗烧瓶。
3. 将 1 mL 的细胞分离溶液添加到含有癌细胞的烧瓶中，然后在 37 °C 孵化器中孵化烧瓶，直到细胞分离（+2-5 分钟）。
4. 在生物安全柜中，将 9 mL 的 PBS 添加到烧瓶中，将 PBS 中的细胞转移到 15 mL 锥形管中，然后使用血细胞计计算细胞号。
5. 在室温下以500 x g 的5分钟将癌细胞离心。
6. 在 BC-MPS 介质中恢复细胞，以便有 2 x 10⁶ 个单元格/mL。
7. 将癌细胞放在37°C的水浴中，直到它们准备好加入人体组织。

5. 处理人体乳房组织

1. 在生物安全柜中，用10毫升无菌PBS清洗人体乳房组织（HBT）3倍。
2. 使用无菌钳子和剃须刀刀片粗切BC-MPS，并尝试去除尽可能多的筋膜和结缔组织。未能去除结缔组织可能导致 ASC 上层无法正确锚定 HBT。
   注意:与脂肪组织的黄色相比，筋膜和结缔组织可以通过其白色或清晰的外观来识别。
3. 结缔组织被移除后，使用无菌剃须刀刀片细切组织，直到其具有同质液体一致性。当组织可以使用 25 mL 血清学尖端轻松地吹笛时，组织会被细碎。
4. 使用无菌剃须刀刀片切断 p1000 移液器尖端的尖端，以帮助管道切割切碎的 HBT。
5. 在1.5 mL管混合切碎的HBT，癌细胞系和BC-MPS介质（对于1井的6井板，这需要200μL的切碎的HBT，100μL的BC-MPS介质，和100μL的癌细胞）。
6. 将用于底部细胞板的 ASC 板从孵化器移动到生物安全柜。从底部 ASC 板块吸气媒体。使用 p1000 移液器尖端将混合物输送到底部 ASC 板的井中央，该点末端从步骤 5.4 中切断
7. 将装有上部 ASC 板的盒子与上面的柱塞移到生物安全柜中。轻轻地从 pNIPAAm 涂层板中取出明胶柱塞，放在 HBT 混合物的顶部。将BC-MPS介质添加到井中（6井板中的1口井添加2 mL介质）。小心地将底部 ASC 板与 BC-MPS 混合物和柱塞移动到无菌塑料盒上，并将盒子的盖子打开以进行运输。
   注:6井板盖在柱塞打开时无法重新贴回ASC板。必须小心避免对文化进行恶害。
8. 在37°C的孵化器中孵化底部板，直到明胶融化，顶部ASC层开始粘附在底部层（+30分钟）。
9. 将带盘子的盒子移到生物安全柜。轻轻地从底部板中取出柱塞。带有癌细胞的组织将被固定在井底。
10. 将 6 井板的盖子放回底部板，在 37 °C 孵化，以完全熔化明胶，并让顶层完全锚定到底层（+30-60 分钟）。
11. 轻轻地将盘子移到生物安全柜中，然后用 10 mL 血清学移液器吸气介质。为每口井添加2 mL的新鲜介质。从井边吸气，将移液器移到井边，以避免将组织移走。
12. 将 BC-MPS 保持在 37 °C 和 5% CO_2， 以保持所需的时间长度，每 2-3 天更换一次介质。

6. BC-MPS 的消化供分析

1. 当 BC-MPS 准备好分析时，将板移到生物安全柜。用血清移液器取出介质，以避免意外地移除任何组织。
2. 向每口井添加 1 卷 PBS。
3. 用血清学移液器取出 PBS。
4. 向每口井添加 1 mL 的细胞分离解决方案。将板移回孵化器，在37°C下孵育5分钟，使细胞分离。在生物安全柜中，使用细胞刮刀将细胞和组织从培养板中完全分离出来。
5. 使用血清学移液器将溶液与组织转移到 15 mL 圆锥管中。将 2 mL 的 PBS 添加到每个井中，以收集任何剩余的细胞，并将此溶液转移到圆锥管中。如果细胞是荧光的，用铝箔包裹管子，以保护它免受光线的照射。
6. 在轨道摇床中持续搅拌下，在 37 °C 下孵化管，持续搅拌 1 x g， 持续 10-20 分钟，将细胞与组织完全分离。
7. 在生物安全柜中，使用血清学移液器破坏管中剩余的细胞团，并通过 250 μm 组织过滤器将样品过滤到新的 15 mL 管中。将溶液缓慢地通过过滤器，使其不会溢出。
8. 用 1 mL PBS 冲洗滤网以收集仍在滤网中的任何细胞。
9. 在室温下以 500 x g 的速度将样品离心 5 分钟。离心后，脂肪细胞将漂浮在溶液的顶层，而癌细胞和ASC将混合在管底部的颗粒中。
10. 将脂肪细胞分离，轻轻地将顶层倒入新管中，或者切断 p1000 移液器尖端的尖端，并将顶层转移到新管中。将样品在 500 x g 下再离心 5 分钟，并使用注射器和针头从脂肪细胞下方去除溶液，以便仅剩余脂肪细胞。脂肪细胞现在已准备好进行分析
11. 从溶液中取出脂肪细胞后，如果癌细胞以前被荧光蛋白转染，则将ASC和癌细胞彼此分离以进行分析。从含有ASC和癌细胞的管子里吸气剩余的溶液，同时不破坏细胞颗粒。在PBS或BC-MPS介质中补充颗粒，并使用流动细胞测量法根据荧光对细胞进行排序。

结果

文化稳定
BC-MPS 是一个稳定的微生理系统，可以在体外培养至少 14 天。以 100 倍的放大倍数拍摄了 ASC 细胞片的明亮场图像，以显示共体表 （图 2A）的条纹图案。ASC 细胞片在培养中稳定至少 4 周。BC-MPS在6口井板的一口井中进行了14天的培养，用彩色照相机进行成像，表明浮力高清在14天后仍然由ASC细胞板稳定地固定在井底（

讨论

需要新的系统来模拟人类乳腺癌，以更好地了解这种疾病。开发人类微生理系统来模拟疾病设置，包括原生 ECM 和频闪细胞，将提高临床前研究的预测能力。这里介绍的BC-MPS模型是一个新开发的系统，克服了以前模型的局限性，允许在其原生HBT环境中对BC进行评估。该系统可用于癌细胞系或肿瘤外植，稳定至少14天。荧光标记 BC 细胞允许实时可视化癌细胞的活力和细胞-细胞相互作用、迁移、生存?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Innovative Cell Technologies	1333	Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase	Corning	25-058-CI	Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz	National Scientific Supply Co	MPCE-T016	For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks	Corning	430641U	For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL	ThermoScientific	339650
Curved Forceps	ThermoScientific	1631T5	For maneuvering tissue while mincing
DMEM low glucose, w/ Glutamax	Gibco	10567-014	For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified	Gibco	26140-079
Gelatin	Sigma	G9391
HBSS 10x	Gibco	14185-052
NaOH	Sigma	221465
Nunc UpCell 6 well plates	ThermoScientific	174901	Top ASC cell sheet
PBS	Gibco	10010-023
Pen/Strep 5,000U	Gibco	15070-063
Petri Dish 150 cm	FisherBrand	FB0875714	For holding tissue while mincing
Razor Blades	VWR	55411-055	Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um	ThermoScientific	87791	For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates	Corning	3506	Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers	BCP Fasteners	BCP672	For weighing plungers down 1/2" inner diameter