JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف بروتوكولا للتلازم الكيميائي لنموذج مستضد ovalbumin إلى الأجسام المضادة مستقبلات الغدد الصماء محددة لاستهداف الخلايا في الجسم الحي التغصني. ويشمل البروتوكول تنقية الأجسام المضادة، والتحواز الكيميائي للمضاد، فضلا عن تنقية المترافق والتحقق من كفاءة التواؤم.

Abstract

يؤدي تسليم المستضد المستهدف إلى الخلايا التغصنية المتقاطعة في الجسم الحي بكفاءة إلى تحفيز استجابات الخلايا التأثيرية T ويعرض نهجا قيما في تصميم اللقاح. يتم تسليم مستضد إلى العاصمة عن طريق الأجسام المضادة محددة لمستقبلات الغدد الصماء مثل DEC-205 التي تحفز امتصاص, تجهيز, وMHC فئة I- و II-العرض.

يعد اقتران المستضد المطلوب بكفاءة وموثوقية بأجسام مضادة مناسبة خطوة حاسمة في استهداف DC ، ومن بين عوامل أخرى يعتمد على شكل المستضد. يعد اقتران البروتين الكامل الطول بالأجسام المضادة النقية استراتيجية ممكنة. في الماضي، أنشأنا بنجاح الربط المتبادل بين نموذج مستضد ovalbumin (OVA) والأجسام المضادة IgG2a DEC-205 محددة (αDEC-205) لدراسات استهداف في الجسم الحي DC في الفئران. الخطوة الأولى من البروتوكول هي تنقية الجسم المضاد من الناتات من NLDC (الخلايا التشعبية غير اللمفاوية)-145 الورم الهجين عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب. يتم تنشيط الأجسام المضادة المنقى للتضمين الكيميائي بواسطة sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] سيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات) وفي الوقت نفسه تتعرض مجموعات سلفهيدريل من بروتين OVA من خلال الحضانة مع TCEP-HCl (ثلاثيات (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). تتم إزالة فائض TCEP-HCl وs sulfo-SMCC ويتم خلط المستضد مع الأجسام المضادة المنشطة للاقتران بين عشية وضحاها. ويتركز الناتج αDEC-205/OVA اقتران وتحريرها من OVA غير منضم. يتم التحقق من نجاح اقتران OVA إلى αDEC-205 من خلال تحليل البقع الغربية واختصاص المناعة المرتبط بالإنزيم (ELISA).

لقد استخدمنا بنجاح αDEC-205/OVA المترابط كيميائيا للحث على استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا في الكبد ومقارنة المساعدين المختلفين لإمكاناتهم في تحفيز المناعة الفكاهية والخلوية التالية في استهداف الجسم الحي ل DEC-205+ DC. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأجسام المضادة/المستضدات المقترنة كيميائيا توفر أدوات قيمة لتحريض استجابات اللقاح الفعالة على مستضدات الأورام، وقد ثبت أنها متفوقة على نهج التحصين الكلاسيكية فيما يتعلق بالوقاية والعلاج من مختلف أنواع الأورام.

Introduction

الخلايا التشجرية (DC) هي لاعبين مركزيين في الجهاز المناعي. فهي مجموعة متنوعة من الخلايا المتخصصة في عرض المستضد ووظيفتها الرئيسية هي جسر المناعة الفطرية والتكيفية1،2. الأهم من ذلك، العاصمة لا تلعب دورا هاما في الاستجابات الموجهة مسببات الأمراض كفاءة ومحددة ولكن تشارك أيضا في العديد من جوانب مناعة مضادة للورم1،3.

نظرا لدورها الحصري في مناعة المضيف ، ظهرت DC في التركيز كخلايا مستهدفة للتطعيم4. نهج واحد هو استهداف المستضدات إلى العاصمة في الجسم الحي للحث على الاستجابات المناعية الخاصة بالمستضد وعلى مدى السنوات الماضية ، تم تخصيص عدد كبير من الدراسات لتحديد المستقبلات المناسبة واستراتيجيات الاستهداف1،4. مثال واحد هو مستقبلات الليكتين من النوع C DEC-205 ، والتي يمكن استهدافها من قبل الأجسام المضادة الخاصة ب DEC-205 للحث على الإصابة بداء الغدد الصماء. الأهم من ذلك، DEC-205 استهداف في تركيبة مع المساعدين مناسبة وقد ثبت أن تحفز بكفاءة CD4 طويلة الأمد وحامية+ وCD8+ الخلايا التائية، فضلا عن استجابات الأجسام المضادة، وأيضا ضد مستضدات الورم3،5،6،7،8،9.

هناك عدد من الدراسات التي تبين مستضدات مترافقة تستهدف العاصمة لتكون متفوقة على مستضد غير مترافق الحرة3،5،10،11،12. وهذا يجعل من اقتران مستضد العاصمة المعنية استهداف moiety خطوة مركزية في العاصمة نهج الاستهداف. في حالة استهداف DC عن طريق الأجسام المضادة أو شظايا الأجسام المضادة ، يمكن ربط المستضدات إما كيميائيا أو وراثيا ، وتوفر أي من الاستراتيجيتين مزاياها الخاصة (dis)1. من ناحية، في الأجسام المضادة المعدلة وراثيا-مستضد يبني هناك سيطرة على جرعة مستضد، فضلا عن موقع توفير مقارنة متفوقة بين الكثير1. ومع ذلك، في الوقت نفسه، يحتاج التقارن الكيميائي إلى إعداد أقل ويوفر مرونة أكبر خاصة عند محاولة اختبار ومقارنة المستضدات المختلفة و/ أو استراتيجيات التطعيم في النماذج التجريبية وما قبل السريرية.

هنا، نقدم بروتوكولا للتاؤم الكيميائي الفعال والموثوق به لل ovalbumin (OVA) كمضاد بروتين نموذجي لأجسام IgG2a المضادة الخاصة ب DEC-205 (αDEC-205) المناسبة لاستهداف في الجسم الحي DC في الفئران. أولا، يتم تنقية αDEC-205 من NLDC-145 خلايا الورم الهجين13. بالنسبة للترابط الكيميائي، يتم استخدام السيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات (sulfo-SMCC)، الذي يحتوي على مجموعات إستر وماليميد (N-hydroxysuccinimide) NHS (N-hydroxysuccinimide)، مما يسمح بالارتقاق التساهمي للجزيئات المحتوية على الأمين والسولفيدريل. على وجه التحديد ، فإن الأمينات الأولية للأجسام المضادة تتفاعل في البداية مع sulfo-SMCC وما ينتج عن ذلك من ماليميد تنشيط αDEC-205 ثم يتفاعل مع بروتين OVA المحتوي على سلفدريل خفضت من خلال TCEP-HCl (تريس (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). المنتج النهائي هو αDEC-205/OVA(الشكل 1). وإلى جانب التضمين الكيميائي نفسه، يصف بروتوكولنا إزالة OVA الزائدة من المترافقة وكذلك التحقق من التوازج الناجح من خلال تحليل البقع الغربية واختبار معين للمناعة مرتبط بالإنزيم. لقد نجحنا في استخدام هذا النهج في الماضي لإقتران OVA كيميائيا والبروتينات الأخرى أو الببتيدات المناعية إلى αDEC-205. نحن نظهر كفاءة ملزمة لCD11c+ الخلايا في المختبر، فضلا عن التعريفي كفاءة المناعة الخلوية والفكاهية في الجسم الحي.

بالتأكيد ، هناك عيوب في هذه الطريقة مثل قابلية المقارنة بين الكثير والكثير وفي ال دوسينج الدقيق للمضاد داخل المترافق النهائي. ومع ذلك ، يوفر التقارن الكيميائي مرونة تجريبية في اختيار الجسم المضاد واستضاد البروتين بالمقارنة مع البنى المعدلة وراثيا. لذلك ، نعتقد أن هذا النهج ذو قيمة خاصة في تقييم المستضدات المختلفة لكفاءتها في استهداف DC في نماذج الماوس قبل السريرية ، والأهم من ذلك أيضا في سياق استجابات مناعية محددة مضادة للورم.

Protocol

وقد وافقت وكالة الحكم المحلي على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit؛ الملف رقم 33.12-42502-04-10/0108) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية.

1. إنتاج αDEC-205 من خط الخلية الهجين NLDC-145

  1. لإنتاج الأجسام المضادة، إذابة cryopreserved NLDC-145 الخلايا المنتجة αDEC-205 في 37 درجة مئوية في حمام مائي. توسيع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. اثنان 75 سم2 وسوف تكون هناك حاجة زجاجات للمضي قدما في إنتاج الأجسام المضادة. وينبغي تنفيذ إجراءات زراعة الخلايا في خزانة أمان لضمان ظروف عمل آمنة ومنع تلوث الثقافات.
    1. Resuspend 1 مل من الخلايا المذابة (1 × 106 - 5 ×10 6 خلايا / مل) في 9 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1 ٪ البنسلين / العقدية (قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) في قارورة ثقافة الخلية (25 سم2). ضع القارورة أفقيا في حاضنة ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    2. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2، حتى التقاء 70٪. وينبغي أن يتحقق ذلك عادة بعد 24 -48 ساعة.
    3. مرة واحدة الخلايا هي التقاء 70٪، نقل تعليق كامل NLDC-145 الخلية (10 مل) في أنبوب الطرد المركزي مخروطية 15 مل باستخدام وحدة تحكم ماصة مع ماصة في نطاق حجم من 1-10 مل. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. ما قبل الدافئة ISF-1 المتوسطة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وإعادة إنفاق بيليه في 12 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / العقدية. نقل تعليق الخلية resuspended في قارورة ثقافة الخلية الطازجة (75 سم2).
    5. الثقافة وتوسيع الخلايا في ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / الستربتوميسين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،حتى التقاء 70٪ و 99٪ قابلة للحياة. وينبغي تحقيق ذلك عادة بعد 48 -72 ساعة.
    6. تقسيم الخلايا إلى اثنين من 75 سم2 قوارير. للقيام بذلك أولا تدفق قارورة ثقافة الخلية أسفل / سطح الثقافة مع تعليق الخلية لإزالة جميع NLDC-145 الخلايا من السطح. نقل 6 مل من تعليق خلية NLDC-145 كل في واحدة من اثنين من زجاجات جديدة 75 سم2 وإضافة ما قبل الدافئة ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / streptomycin تصل إلى 12 مل.
      ملاحظة: لا تجدد الوسط ثقافة الخلية كما سيتم تكييف الخلايا NLDC-145 الوسط. نقل الخلايا جنبا إلى جنب مع المتوسطة وملء الثقافة تصل إلى الحجم المطلوب مع المتوسطة الطازجة. وهذا أمر بالغ الأهمية من أجل البقاء والحد الأقصى لإنتاج الأجسام المضادة من قبل خلايا NLDC-145.
    7. توسيع ثقافات الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،حتى حوالي 70٪ التقاء الذي يتحقق عموما بعد 48-72 ساعة.
    8. مرة واحدة في الخلايا هي التقاء 70٪، نقل 10 مل من تعليق NLDC-145 خلية موسعة من كل من زجاجات2 75 سم في واحدة PETG (البولي ايثيلين تيريفثالات غليكول) زجاجة الأسطوانة (1050 سم2). لهذا، دافق قارورة ثقافة الخلية أسفل / سطح الثقافة مع تعليق الخلية لإزالة جميع الخلايا من السطح باستخدام وحدة تحكم ماصة وماصة 10 مل.
    9. إضافة 140 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / العقدية (مسبقا إلى 37 درجة مئوية) مباشرة من زجاجة متوسطة إلى كل من NLDC-145 تحتوي على زجاجات الأسطوانة ملء لهم حتى علامة 150 مل.
      ملاحظة: راجع الملاحظة في الخطوة 1.1.6.
    10. ثقافة زجاجات الأسطوانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 25 جولات / دقيقة لمدة ثلاثة أيام.
    11. إضافة 150 مل من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / العقدية (قبل الحارة إلى 37 درجة مئوية) إلى كل من NLDC-145 تحتوي على زجاجات الأسطوانة ملء لهم حتى علامة 300 مل.
    12. ثقافة زجاجات الأسطوانة التي تحتوي الآن على ثقافة 300 مل لكل منها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 25 جولات / دقيقة لمدة ثلاثة أيام أخرى.
    13. إضافة 100 مل أخرى من ISF-1 المتوسطة تكملها 1٪ البنسلين / streptomycin (قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) إلى كل من NLDC-145 تحتوي على زجاجات الأسطوانة، وبالتالي ملء لهم ما يصل إلى علامة 400 مل.
    14. ثقافة زجاجات الأسطوانة التي تحتوي الآن على ثقافة 400 مل لكل منها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 25 جولات / دقيقة لمدة سبعة أيام أخرى.
      ملاحظة: خلال هذا الأسبوع، تصبح الثقافة كثيفة جدا (تصل إلى كثافة 95٪) وتنخفض الجدوى (إلى أقل من 50٪)، مما يتيح إطلاق أقصى قدر من الأجسام المضادة.
  2. لتنقية αDEC-205 من الثقافة الفائقة صب تعليق الخلية NLDC-145 (من كل من زجاجات الأسطوانة) مباشرة إلى زجاجات الطرد المركزي 500 مل autoclaved.
    ملاحظة: يجب جمع إجمالي حجم الثقافة 800 مل.
    1. الطرد المركزي الثقافة لمدة 30 دقيقة في 8600 × ز و 4 درجة مئوية لإزالة الخلايا والحطام.
    2. جمع supernatants، والتخلص من الكريات وتجميع المضادات في زجاجة كاشف معقمة.
      ملاحظة: يمكن البدء في تنقية αDEC-205 على الفور (الخطوة 2.) أو يمكن تخزين الناسخة الفائقة على المدى القصير عند 4 درجة مئوية.

2. تنقية الجسم المضاد αDEC-205 من خلية NLDC-145 الفائقة

ملاحظة: من خلية NLDC-145 الفائقة، يتم تنقية αDEC-205 باستخدام عمود G Sepharose البروتين (قابل لإعادة الاستخدام). أبعاد العمود هي 15 ملم × 74 ملم و 5 مل البروتين G Sepharose معبأة في العمود.

  1. لإعداد وغسل البروتين G Sepharose العمود، ووضع سد العجز المطاط محكم على الفتح العلوي من البروتين G Sepharose العمود. ثقب المكونات المطاطية مع اثنين من القنية العقيمة (20 G × 1 1/2" ، 0.90 × 40 ملم).
    1. قم بتوصيل حقنة سعة 10 مل بواحدة من القنيتين وأنبوب سيليكون مرن (طوله حوالي 100 سم وقطره 2.5 - 3 مم) مع موصل أنابيب إلى القنية الثانية.
      ملاحظة: بناء المكونات حقنة / المطاط قابلة لإعادة الاستخدام ويوفر فراغ مما أدى إلى تدفق مستمر من حجم كبير من الثقافة supernatant إلى العمود البروتين G Sepharose. وتحقيقا لهذه الغاية، سحب قليلا المكبس من الحقنة لضمان تدفق السوائل المستمر في الخطوات التالية.
    2. اغسل العمود ب 50 مل من حمض الخليك الجليدي 0.1 M (الرقم الحموضة 2) لإزالة الأجسام المضادة المتبقية المحتملة من أي تنقية الأجسام المضادة السابقة. وضع نهاية أنبوب السيليكون في 0.1 M حمض الخليك الجليدي (درجة الحموضة 2) زجاجة كاشف شغلها. نتيجة للفراغ المستحث ، 50 مل من حمض الخليك الجليدي 0.1 M (درجة الحموضة 2) تشغيل دروبوايز من خلال العمود البروتين G Sepharose.
      ملاحظة: 0.1 م حمض الخليك الجليدي (درجة الحموضة 2) ينبغي تخزينها في زجاجة كاشف أو شغلها طازجا في كوب.
    3. اغسل العمود بمحلول ملحي عازل بالفوسفات 100-200 مل (PBS). وضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة كاشف PBS شغلها أو كوب. اسمحوا 100-200 مل برنامج تلفزيوني تشغيل دروبيا من خلال البروتين G Sepharose العمود.
  2. لتنقية الأجسام المضادة من الرابطة الوطنية من أجل الديمقراطية - 145 supernatant ، تحميل 800 مل من الرابطة الوطنية من أجل الديمقراطية - 145 supernatant (التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.2.2.) على العمود. وضع نهاية أنبوب السيليكون في الرابطة الوطنية من أجل الديمقراطية -145 supernatant زجاجة كاشف شغلها. اسمحوا 800 مل NLDC-145 supernatant تشغيل دروبوايز من خلال العمود.
    1. غسل العمود مع 500 مل من برنامج تلفزيوني. وضع نهاية أنبوب السيليكون في زجاجة كاشف PBS شغلها أو كوب. السماح 500 مل برنامج تلفزيوني تشغيل دروبوايز من خلال العمود.
    2. ل elution، استخدم 20 1.5 مل أنابيب وماصة 100 ميكرولتر من 1.5 M تريس-HCl (درجة الحموضة 8.8) في كل أنبوب 1.5 مل. إزالة المكونات المطاطية من العمود وماصة 1 مل من 0.1 M الجليسين (درجة الحموضة 3) إلى الغرفة العليا من البروتين G Sepharose العمود لe elute الأجسام المضادة من العمود. جمع تدفق من خلال مباشرة كما eluate في واحدة من أنابيب 1.5 مل المعدة.
    3. كرر خطوة الإلتواء (2.2.2.) لجميع الأنابيب العشرين (1.5 مل).
    4. تحديد الكثافة البصرية لجميع كسور elution في 280 نانومتر (OD280)باستخدام مطياف من أجل تحديد الكسور التي تحتوي على الأجسام المضادة.
      ملاحظة: استخدم الكسر elution الأول ك فارغ.
    5. تجمع كافة الكسور معOD 280 أكبر من 0.5 (تقريبا 10 كسور).
    6. تخزين البروتين G Sepharose العمود مليئة 20٪ الإيثانول في 4 °C.
  3. Dialyze elutions تجمع ضد برنامج تلفزيوني 1000 مل (في كوب 2000 مل) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها باستخدام أنابيب غسيل الكلى مع خفض الوزن الجزيئي (MWCO) من 12 -14 كيلودا.
    1. قطع أنابيب غسيل الكلى إلى قطع من 20 سم. غلي أنابيب غسيل الكلى في 500-800 مل من 10 M EDTA (درجة الحموضة 7.5) لمدة 30 دقيقة في كوب باستخدام لوحة ساخنة لإزالة التلوث. تجاهل محلول EDTA 10 mM (درجة الحموضة 7.5) وغلي أنابيب غسيل الكلى في الماء deionized لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام أنابيب غسيل الكلى مباشرة أو تخزينها في 0.01٪ من أزيد الصوديوم (NaN3) / H2O الحل في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام التالي.
    2. إغلاق الجزء السفلي من أنابيب غسيل الكلى مع إغلاق أنابيب غسيل الكلى المناسبة / قطعة واحدة، المشبك يتوقف وماصة بعناية اللضوء الأجسام المضادة في أنابيب غسيل الكلى. أغلق الجزء العلوي من أنابيب غسيل الكلى بمشبك ثان.
    3. إصلاح المشبك العلوي من أنابيب غسيل الكلى إلى موقف عائم، ووضعها جنبا إلى جنب مع شريط ضجة المغناطيسي في كوب برنامج تلفزيوني شغل ووضع الكأس على stirrer المغناطيسي.
    4. Dialyze بين عشية وضحاها اثارة في 4 °C.
  4. لزيادة تركيز αDEC-205، قم بتحميل الدياليزات الكاملة إلى مركز طرد مركزي مع 10 كيلودا موكو. فتح المشبك واحد من الأنابيب وماصة بعناية dialysate كاملة للخروج من أنابيب غسيل الكلى في المكثف الطرد المركزي (10 كيلودا MWCO).
    ملاحظة: لا تلمس أسفل المكثف مع تلميح ماصة.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 693 × ز (2000 دورة في الدقيقة) و 4 درجات مئوية.
    2. قم بتحميل المكثف الطردي مع 10 مل من برنامج تلفزيوني و الطرد المركزي في 693 x g (2,000 دورة في الدقيقة) و 4 °C حتى الحجم النهائي للحل الأجسام المضادة اليسار هو 1-1.5 مل.
      ملاحظة: كرر خطوة الطرد المركزي 2.4.1 إذا لزم الأمر. لضبط المبلغ المطلوب.
    3. باستخدام مطياف ضوئي، حدد الكثافة البصرية للمحلول المركز αDEC-205 عند 280 نانومتر (OD280). استخدام برنامج تلفزيوني كما فارغة.
    4. حساب تركيز αDEC-205 باستخدام الصيغة التالية:
      تركيز [ملغم/ مل] = OD280/1.4.
    5. فلتر محلول αDEC-205 باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: تنقية αDEC-205 من NLDC-145 خلية هجينة فائقة يمكن أيضا أن يتحقق من قبل FPLC (بروتين سريع الكروماتوغرافيا السائلة). يمكن تخزين αDEC-205 المنقى عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو عند -18 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

3. اقتران كيميائي من OVA إلى αDEC-205

ملاحظة: نسبة 0.5 ملغ بروتين OVA إلى 2.5 ملغ αDEC-205 (1:5) مطلوبة للتلازم الكيميائي الأمثل. ومع ذلك، يمكن أن تختلف هذه النسبة بالنسبة للبروتينات والأجسام المضادة الأخرى وتحتاج إلى تحسينها للمواجهات البديلة. يتم إجراء تخفيض روابط ثنائي كبريتيد بروتين OVA من خلال الحضانة مع 30 mM TCEP-HCl ، مما يعرض مجموعات الكبريتهيدريل للتلازم الكيميائي إلى αDEC-205 و 240 ميكرولتر من TCEP-HCl مطلوبة في الخطوة 3.2. وينبغي أن تنفذ في نفس الوقت كلا الخطوتين، وهما التخفيض الناجم عن TCEP من OVA (الخطوة 3.1.) وتنشيط sulfo-SMCC ل αDEC-205 (الخطوة 3.2. ).

  1. إعداد حل TCEP-HCl 125 mM (pH 7.0). تزن الكمية المطلوبة من TCEP-HCl وحل TCEP-HCl في قاعدة 0.9 M تريس (pH 8.8). استخدم شرائط مؤشر درجة الحموضة لاختبار درجة الحموضة لمحلول TCEP-HCl 125 mM (الذي يجب أن يكون محايدا) وضبط درجة الحموضة مع قاعدة Tris (درجة الحموضة 8.8).
    1. ماصة 200 ميكرولتر OVA محلول البروتين (تحتوي على 0.5 ملغ OVA) في أنبوب معقم 1.5 مل. إضافة 240 ميكرولتر 125 mM TCEP-HCl و 560 ميكرولتر من المياه فائقة البوري المعقمة إلى بروتين OVA باستخدام ماصة لتركيز نهائي من 0.5 ملغم / مل بروتين OVA و 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      ملاحظة: 2.5 ملغ إندوغراد OVA (lyophilized) يذوب في 1 مل برنامج تلفزيوني مما أدى إلى حل 2.5 ملغم / مل OVA.
    2. احتضان OVA/TCEP-HCl الناتجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة.
      ملاحظة: لا تقم بتمديد خطوة الحضانة هذه.
  2. لتنشيط αDEC-205 للتحضان، حل 2 ملغ sulfo-SMCC في 100 ميكرولتر من المياه فائقة البور.
    ملاحظة: سولفو-SMCC عرضة للتحلل المائي. ولذلك، ينبغي التعامل مع كميات أكبر من السلفو-SMCC غير المفحلة بسرعة أو ينبغي استخدام 2 ملغ aliquots المتاحة.
    1. تمييع αDEC-205 في برنامج تلفزيوني بحيث يتم تضمين 2.5 ملغ في 900 ميكرولتر.
    2. مزيج 2.5 ملغ من αDEC-205 (900 ميكرولتر حجم; تم الحصول عليها من الخطوة 3.2.1.) و 100 ميكرولتر من sulfo-SMCC (تم الحصول عليها من الخطوة 3.2.) في أنبوب 1.5 مل, مما أدى إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.
    3. احتضان الحل αDEC-205/sulfo-SMCC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 550 دورة في الدقيقة في كتلة التدفئة.
  3. وبعد هذه الحضانات، تتم إزالة فائض السلفو-SMCC و TCEP-HCl فورا من المحاليل باستخدام أعمدة تحلية (MWCO 7 kDa؛ 5 مل حجم العمود).
    1. تويست قبالة الأعمدة (MWCO 7 kDa) إغلاق القاع، وتخفيف الغطاء ووضع العمود في أنبوب مخروطي 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لإزالة السائل.
    3. ضع العمود في أنبوب جديد وأزل الغطاء. قم بتحميل الأجسام المضادة/sulfo-SMCC وOVA/TCEP-HCl ببطء، على التوالي، إلى مركز سرير الراتنج المضغوط لعمود واحد لكل منهما.
    4. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1000 × غرام في درجة حرارة الغرفة.
    5. تجاهل الأعمدة بعد الاستخدام. الحلول التي تحتوي على الأجسام المضادة وOVA تستعد للإخوان هي في الأنابيب.
    6. اخلط كلا الحلين فورا عن طريق الأنابيب من أجل اقتران αDEC-205 وOVA.
    7. احتضان الناتج αDEC-205 و OVA خليط بين عشية وضحاها في 4°C.
  4. بعد اقتران, تتم إزالة OVA الزائدة غير منضم من الحل ويتركز αDEC-205/OVA مقرونة باستخدام مكثف البروتين الطرد المركزي (MWCO 150 كيلودا).
    1. شطف مسبق لمكثف البروتين الطرد المركزي (MWCO 150 kDa) عن طريق أنابيب 12 مل من برنامج تلفزيوني على العمود والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، كرر خطوة الطرد المركزي (3.4.1.) حتى يتم تمرير حجم حوالي 5 مل من خلال العمود.
    2. قبل تحميل αDEC-205/OVA على مركز البروتين الطردي، احفظ عينة 20 ميكرولتر من αDEC-205/OVA غير المركزة لتحليل البقع الغربية. تخزين هذا aliquot في 4 درجة مئوية حتى التحليل.
    3. قم بتحميل αDEC-205/OVA على مركز البروتين الطرد المركزي عن طريق الأنابيب.
      ملاحظة: تجنب أي اتصال مع سرير الغرفة العليا من المكثف الطرد المركزي.
    4. ملء المكثف إلى 15 مل مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي المكثف لمدة 5 دقائق في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
    5. حفظ عينة من التدفق من خلال (التدفق من خلال I) لتحليل لطخة الغربية وتجاهل التدفق المتبقية من خلال.
    6. ملء المكثف إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي المكثف لمدة 8 دقائق على الأقل في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
    7. حفظ عينة لتدفق الثاني من خلال (التدفق من خلال الثاني) لتحليل لطخة الغربية وتجاهل تدفق المتبقية من خلال.
    8. وبمجرد تحقيق التخصيب المطلوب (حوالي 1.5 مل من محلول αDEC-205/OVA يجب أن يترك في الغرفة العليا) يستنشق العينة المركزة بلطف.
      ملاحظة: إذا ترك الكثير من السوائل في الغرفة العليا، يمكن تكرار الطرد المركزي ولكن يجب أن يبقى قصيرا قدر الإمكان.
  5. تحديد تركيز البروتين الناتج αDEC-205/OVA باستخدام مطياف ميكروفولوم. استخدام برنامج تلفزيوني كما فارغة.
  6. فلتر وحدة تصفية المحاقن αDEC-205/OVA باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: للتحليل اللاحق وفي تجارب الجسم الحي، يمكن تخزين αDEC-205/OVA عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو -18 درجة مئوية.

4. التحقق من اقتران الكيميائية من قبل لطخة الغربية

ملاحظة: للتحقق من نجاح التواؤم الكيميائي، يتم إجراء تحليل لطخة غربية للكشف عن OVA (4.2) أو αDEC-205 (4.10). يجب أن يتم الكشف عن OVA (4.2.) أو αDEC-205 (4.10.) بالتوازي. ويفضل أن يستخدم شاكر المنصة المدارية لجميع خطوات حضانة الأغشية الغربية للسماح بالتوزيع الموحد للحلول المعنية.

  1. إعداد معيار 10٪ SDS (كبريتات دودسيل الصوديوم) المواد الهلامية لSDS-PAGE (الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis).
  2. إعداد العينات لSDS-PAGE للكشف عن OVA مترافق وغير مترافق وتشغيل الكهربائي هلام.
    1. تمييع كميات مختلفة من αDEC-205/OVA (على سبيل المثال، 200 و 100 و 50 نانوغرام)، من OVA النقية (على سبيل المثال، 80 و70 و60 و50 و40 و30 نانوغرام)، وهو اقتباس من αDEC-205 غير المقترنة (على سبيل المثال، 100 و50 نانوغرام)، وهي عينة من αDEC-205/OVA غير المركزة مقترنة بالخطوة 3.4.2. (على سبيل المثال، 125 نانوغرام) و aliquot من التدفق من خلال الأول والثاني (الخطوتين 3.4.5. و 3.4.7. على التوالي؛ اختياري) في 4 × غير الحد من المخزن المؤقت عينة SDS.
      ملاحظة: يتم تحميل تركيزات مختلفة من البروتين والمترافق لضمان أن كلا من OVA الحرة وكذلك يمكن الكشف عن اقتران على نفس البقعة.
    2. إزالة العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 550 دورة في الدقيقة في كتلة التدفئة.
  3. تحميل العينات ومعيار البروتين إلى هلام SDS وتشغيل SDS-PAGE.
  4. إجراء النشاف القياسية من البروتينات من هلام SDS إلى PVDF المنشط الميثانول (بولي فينيلدين difluoride) غشاء (75 دقيقة، 125 mA).
  5. بعد النشاف، وضع الغشاء في طبق مناسب ومنع الغشاء عن طريق pipetting 25 مل من 4٪ مسحوق اهتزاز استبدال وجبة / TBS-T (تريس العازلة المالحة / 0.1٪ توين 20) حجب العازلة في الطبق الذي يحتوي على الغشاء.
    1. احتضان الغشاء في حل حجب لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C.
  6. تجاهل حل حجب وصمة عار الغشاء مع الأرنب αOVA الأجسام المضادة الأولية في 2٪ وجبة استبدال مسحوق اهتزاز / TBS-T العازلة الأجسام المضادة (تخفيف 1:3،000) عن طريق pipetting 15 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية للغشاء في الطبق.
    1. احتضان الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C (استخدام منصة شاكر).
  7. تجاهل حل الأجسام المضادة وغسل الغشاء في الطبق (استخدام شاكر منصة).
    1. إضافة 25 مل من TBS-T إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
    2. إضافة 25 مل من TBS-T/0.5 M NaCl إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
    3. إضافة 25 مل من TBS-T/0.5٪ تريتون X-100 إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
    4. إضافة 25 مل من TBS-T إلى الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل.
  8. وصمة عار الغشاء مع الماعز αrabbit-IgG-HRPO (حصان الفجل peroxidase) الأجسام المضادة الثانوية في 2٪ وجبة استبدال مسحوق اهتزاز / TBS-T المضادة للأجسام العازلة (تخفيف 1:2،000) عن طريق الأنابيب 15 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية للغشاء في الطبق.
    1. احتضان الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C (على منصة شاكر).
  9. غسل الغشاء مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 4.7.1.- 4.7.4. باستخدام منصة شاكر. لهذا الغشاء، والاستمرار المقبل مع الخطوة 4.16. (الخطوات التالية 4.10.- 4.15. (الكشف عن αDEC-205) يمكن أن يتم بالتوازي مع الخطوات 4.2.- 4.9.).
  10. إعداد العينات للكشف عن αDEC-205 لSDS-PAGE وتشغيل الكهربائي هلام.
    1. تمييع كميات مختلفة من αDEC-205/OVA (على سبيل المثال، 200 و100 و50 نانوغرام) من αDEC-205 غير المترافقة (على سبيل المثال، 250 و125 و62.5 نانوغرام)، من OVA النقية (على سبيل المثال، 80 و 70 نانوغرام)، عينة من αDEC-205/OVA غير المركزة من الخطوة 3.4.2. (على سبيل المثال، 125 نانوغرام) و aliquot من التدفق من خلال الأول والثاني (الخطوتين 3.4.5. و 3.4.7. على التوالي؛ اختياري) في 4 × غير الحد من المخزن المؤقت عينة SDS.
    2. إزالة العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 550 دورة في الدقيقة في كتلة التدفئة.
  11. تحميل العينات ومعيار البروتين إلى هلام SDS وتشغيل الكهربائي هلام.
  12. أداء النشاف القياسية من البروتينات من هلام SDS إلى الميثانول تنشيط PVDF (البولي فينيلدين difluoride) غشاء (75 دقيقة، 125 MA).
  13. بعد النشاف، وضع الغشاء في طبق مناسب ومنع الغشاء عن طريق الأنابيب 25 مل من 10٪ حجب العازلة (مسحوق الحليب / TBS-T) في الطبق الذي يحتوي على الغشاء.
    ملاحظة: تختلف حلول الحظر بين الكشف عن αDEC-205 وOVA (الخطوة 4.5.).
    1. احتضان الغشاء في حل الحجب لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (باستخدام شاكر المنصة).
  14. تجاهل حل الحجب وصمة عار الغشاء مع الماعز αrat-IgG (H +L) -HRPO الأجسام المضادة في 5٪ مسحوق الحليب / TBS-T العازلة الأجسام المضادة (تخفيف 1:5،000) عن طريق الأنابيب 15 مل من محلول الأجسام المضادة للغشاء في الطبق.
    ملاحظة: تختلف المخازن المؤقتة للأجسام المضادة بين الكشف عن αDEC-205 والكشف عن OVA (الخطوات 4.6./ 4.8.).
    1. احتضان الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 °C (باستخدام منصة شاكر).
  15. غسل الغشاء جيدا في الطبق كما هو موضح في الخطوات 4.7.1.- 4.7.4. (استخدام منصة شاكر).
  16. استخدم كاشف كشف مناسب لتطوير إشارة HRP وكشف الشيميلوميني في غرفة مظلمة باستخدام فيلم الأشعة السينية أو عن طريق نظام التصوير.

5. التحقق من اقتران الكيميائية من قبل ELISA

  1. إجراء ELISA لمزيد من التحقق من نجاح اقتران الكيميائية مما أدى إلى αDEC-205/OVA.
  2. معطف مناسبة 96 جيدا ELISA لوحة مع 100 ميكرولتر / بئر من 3 نانوغرام / μL أرنب αOVA الأجسام المضادة في العازلة طلاء (0.1 M بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) درجة الحموضة 9.6 المخفف في H2O).
    1. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 4 °C.
  3. بعد الطلاء، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال، باستخدام غسالة ELISA.
  4. كتلة لوحة عن طريق pipetting 200 ميكرولتر من العازلة حجب (10٪ FCS في برنامج تلفزيوني) في كل بئر من لوحة واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تخفيف تسلسلي αDEC-205/OVA (التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.6.) 1:2 في حظر العازلة (10٪ FCS في برنامج تلفزيوني) للحصول على تخفيف تتراوح بين 6 ميكروغرام / م انخفاض إلى 93.8 نانوغرام/مل αDEC-205/OVA وإضافة 100 ميكرولتر/بئر من هذه الكميات المتناقصة من αDEC-205/OVA إلى الآبار.
    1. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل لوحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال، وذلك باستخدام غسالة ELISA.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من الماعز αrat-IgG +IgM (H +L) -HRPO الأجسام المضادة (المخفف إلى 1:2,000 في العازلة حجب (10٪ FCS في برنامج تلفزيوني)) إلى كل بئر من لوحة.
    1. حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال باستخدام غسالة ELISA.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة HRPO إلى الآبار. عند مراقبة رد فعل لون واضح، وقف رد الفعل من خلال إضافة 150 ميكرولتر وقف الحل (1M H2SO4) لكل بئر.
  10. بعد 5 دقائق، قراءة امتصاص في 450 نانومتر باستخدام قارئ ELISA.

النتائج

اقتران الكيميائية من البروتين αDEC-205 إلى OVA باستخدام هذا البروتوكول سوف تسمح عادة كفاءة توليد αDEC-205/OVA لنهج استهداف في الجسم الحي DC. هناك استراتيجيات مختلفة للتحقق من هذه التقنية نفسها واختبار وظائف المترافق المسفر عنها. وتستخدم تحليل لطخة الغربية و ELISA للتحقق من اقتر?...

Discussion

يوفر التلازم الكيميائي للأجسام المضادة الخاصة بمستقبلات الغدد الصماء ومستضد البروتين نهجا فعالا ، والأهم من ذلك ، مرنا أيضا لاستهداف vivo DC في نماذج الماوس قبل السريرية. مع بروتوكولنا نقدم نهجا فعالا لنجاح اقتران نموذج مستضد OVA إلى الأجسام المضادة IgG DEC-205 محددة.

في بروتو?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

يشكر المؤلفان س. بريتين على المساعدة التقنية الخبيرة. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من جمعية هيلمهولتز لمراكز البحوث الألمانية (HGF) التي تم توفيرها كجزء من تحالف هيلمهولتز "العلاج المناعي للسرطان" (HCC_WP2b).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody buffer 2 %2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25Greiner Bio-One690175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75Greiner Bio-One658175we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175Greiner Bio-One661175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDaSartoriusVS2001Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 mlThermo Fisher Scientific88532Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottlesNalgene525-2314PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDaThermo Fisher Scientific89891Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)Sigma-Aldrich/MerckT8665-100ML3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)Roche/Merck12 015 200 01Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDaSERVA Electrophoresis44110Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plateThermo Fisher Scientific442404MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serumPAN-BIOtechP40-47500FBS Good forte
ISF-1 mediumBiochrom/bioswisstecF 9061-01
milk powderCarl RothT145.2powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridomaATCCHB-290if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbuminHyglos (via BioVendor)321000EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottlesNunc In Vitro734-2394standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator stripsMerck109535pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 112-035-062obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)Jackson ImmunoResearch 112-035-068obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 111-035-045 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)Abcamab181688used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)OriGeneR1101used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose columnMerck/MilliporeP32965 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standardThermo Fisher Scientific26616PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membraneMerck/MilliporeIPVH00010immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plugOmnilab5230217DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tubeOmnilab5430925DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fastwe have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)1M H2SO4
sulfo-SMCCThermo Fisher Scientific22322Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm Merck/MilliporeSLGV033RSMillex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 mlOmnilabDisposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulasB. BraunSterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-TTris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HClThermo Fisher ScientificA35349
tubing connectorOmnilabKleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

References

  1. Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
  4. Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
  5. Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
  6. Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
  7. Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
  8. Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
  9. Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
  10. Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
  11. Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
  12. Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
  13. Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
  14. Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 DEC 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved