Chemische Konjugation eines gereinigten DEC-205-gerichteten Antikörpers mit Protein in voller Länge für das Targeting von dendritischen Zellen der Maus in vitro und in vivo

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die chemische Konjugation des Modellantigens Ovalbumin zu einem endozytoserezeptorspezifischen Antikörper für das in vivo dendritische Zell-Targeting. Das Protokoll umfasst die Reinigung des Antikörpers, die chemische Konjugation des Antigens sowie die Reinigung des Konjugats und die Überprüfung der effizienten Konjugation.

Zusammenfassung

Die gezielte Antigenabgabe an kreuzproduzierende dendritische Zellen (DC) in vivo induziert effizient T-Effektorzellantworten und zeigt einen wertvollen Ansatz im Impfstoffdesign. Antigen wird über Antikörper, die spezifisch für Endozytoserezeptoren wie DEC-205 sind, die Aufnahme, Verarbeitung und MHC-Klasse-I- und II-Präsentation induzieren, an DC abgegeben.

Die effiziente und zuverlässige Konjugation des gewünschten Antigens zu einem geeigneten Antikörper ist ein kritischer Schritt im DC-Targeting und hängt unter anderem vom Format des Antigens ab. Die chemische Konjugation von Protein in voller Länge zu gereinigten Antikörpern ist eine mögliche Strategie. In der Vergangenheit haben wir erfolgreich eine Vernetzung des Modellantigens Ovalbumin (OVA) und eines DEC-205-spezifischen IgG2a-Antikörpers (αDEC-205) für In-vivo-DC-Targeting-Studien an Mäusen etabliert. Der erste Schritt des Protokolls ist die Reinigung des Antikörpers aus dem Überstand des NLDC(non-lymphoid dendritic cells)-145 Hybridoms durch Affinitätschromatographie. Der gereinigte Antikörper wird zur chemischen Konjugation durch Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl 4-[N-Maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat) aktiviert, während gleichzeitig die Sulfhydrylgruppen des OVA-Proteins durch Inkubation mit TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) exponiert werden. Überschüssiges TCEP-HCl und Sulfo-SMCC werden entfernt und das Antigen wird mit dem aktivierten Antikörper zur Übernachtkopplung gemischt. Das resultierende αDEC-205/OVA-Konjugat wird konzentriert und von ungebundener OVA befreit. Die erfolgreiche Konjugation von OVA zu αDEC-205 wird durch Western-Blot-Analyse und Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verifiziert.

Wir haben erfolgreich chemisch vernetztes αDEC-205/OVA verwendet, um zytotoxische T-Zell-Reaktionen in der Leber zu induzieren und verschiedene Adjuvantien auf ihr Potenzial bei der Induktion einer humoralen und zellulären Immunität nach in vivo Targeting von DEC-205⁺ DC zu vergleichen. Darüber hinaus bieten solche chemisch gekoppelten Antikörper/Antigen-Konjugate wertvolle Werkzeuge für die effiziente Induktion von Impfantworten auf Tumorantigene und haben sich hinsichtlich der Prävention und Therapie verschiedener Tumorarten als überlegen gegenüber klassischen Immunisierungsansätzen erwiesen.

Einleitung

Dendritische Zellen (DC) sind zentrale Akteure des Immunsystems. Sie sind eine vielfältige Gruppe von Zellen, die auf die Antigenpräsentation spezialisiert sind, und ihre Hauptfunktion besteht darin, angeborene und adaptive Immunität zu überbrücken^1,2. Wichtig ist, dass DC nicht nur eine wichtige Rolle bei effizienten und spezifischen pathogengesteuerten Reaktionen spielt, sondern auch an vielen Aspekten der Antitumorimmunität beteiligt ist^1,3.

Aufgrund ihrer exklusiven Rolle bei der Wirtsimmunität rückte DC als Zielzellen für die Impfung in den Fokus⁴. Ein Ansatz besteht darin, Antigene in vivo auf DC auszurichten, um antigenspezifische Immunantworten zu induzieren, und in den letzten Jahren wurde eine große Anzahl von Studien der Definition geeigneter Rezeptoren und Targeting-Strategien gewidmet^1,4. Ein Beispiel ist der C-Typ-Lektinrezeptor DEC-205, der durch DEC-205-spezifische Antikörper gezielt endozytose induziert werden kann. Wichtig ist, dass DEC-205-Targeting in Kombination mit geeigneten Adjuvantien nachweislich langlebige und schützende CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen sowie Antikörperreaktionen auch gegen die Tumorantigene 3^,5,^6,7,8,9wirksam induziert.

Es gibt eine Reihe von Studien, die zeigen, dass konjugierte Antigene, die auf DC abzielen, dem freien unkonjugierten Antigen^3,5,10^,11,12überlegen sind. Dies macht die Konjugation des Antigens zur jeweiligen DC-Zieleinheit zu einem zentralen Schritt in DC-Targeting-Ansätzen. Im Falle des DC-Targetings über Antikörper oder Antikörperfragmente können Antigene entweder chemisch oder genetisch verknüpft sein, und jede Strategie bietet ihre eigenen (Dis-)Vorteile¹. Auf der einen Seite gibt es in gentechnisch veränderten Antikörper-Antigen-Konstrukten eine Kontrolle über die Antigendosis sowie den Ort, der eine überlegene Vergleichbarkeit zwischen den Losen^{1 ermöglicht.} Gleichzeitig benötigt die chemische Konjugation jedoch weniger Vorbereitung und bietet mehr Flexibilität, insbesondere wenn versucht wird, verschiedene Antigene und / oder Impfstrategien in experimentellen und präklinischen Modellen zu testen und zu vergleichen.

Hier stellen wir ein Protokoll für die effiziente und zuverlässige chemische Konjugation von Ovalbumin (OVA) als Modellproteinantigen zu einem DEC-205-spezifischen IgG2a-Antikörper (αDEC-205) vor, der für das in vivo DC-Targeting in Mäusen geeignet ist. Zunächst wird αDEC-205 aus NLDC-145-Hybridomzellen¹³gereinigt. Zur chemischen Konjugation wird der heterobifunktionelle Vernetzer Sulfosuccinimidyl-4-[N-Maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) verwendet, der NHS (N-Hydroxysuccinimid)-Ester- und Maleimidgruppen enthält, was eine kovalente Konjugation von amin- und Sulfhydryl-haltigen Molekülen ermöglicht. Insbesondere reagieren die primären Amine des Antikörpers zunächst mit Sulfo-SMCC und das resultierende Maleimid-aktivierte αDEC-205 reagiert dann mit dem durch TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) reduzierten Sulfhydryl-haltigen OVA-Protein. Das Endprodukt ist chemisch konjugiert αDEC-205/OVA (Abbildung 1). Über die chemische Konjugation selbst hinaus beschreibt unser Protokoll die Entfernung überschüssiger OVA aus dem Konjugat sowie die Überprüfung der erfolgreichen Konjugation durch Western-Blot-Analyse und einen spezifischen enzymgebundenen Immunosorbent-Assay. Wir haben diesen Ansatz in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt, um OVA und andere Proteine oder immunogene Peptide chemisch an αDEC-205 zu konjugieren. Wir demonstrieren eine effiziente Bindung an CD11c⁺ -Zellen in vitro sowie die effiziente Induktion der zellulären und humoralen Immunität in vivo.

Sicherlich gibt es Nachteile dieser Methode, wie z.B. in der Parierbarkeit von Charge zu Charge und bei der genauen Dosierung des Antigens innerhalb des endgültigen Konjugats. Dennoch bietet die chemische Konjugation experimentelle Flexibilität bei der Wahl des Antikörpers und des Proteinantigens im Vergleich zu gentechnisch veränderten Konstrukten. Daher glauben wir, dass dieser Ansatz besonders wertvoll ist, um verschiedene Antigene auf ihre Effizienz beim DC-Targeting in präklinischen Mausmodellen zu bewerten, vor allem auch im Zusammenhang mit spezifischen Antitumor-Immunantworten.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (Aktenzeichen 33.12-42502-04-10/0108) genehmigt und nach den nationalen und institutionellen Richtlinien durchgeführt.

1. Herstellung von αDEC-205 aus der Hybridom-Zelllinie NLDC-145

1. Für die Antikörperproduktion tauen kryokonservierte NLDC-145-Zellen, die αDEC-205 bei 37 °C produzieren, in einem Wasserbad auf. Erweitern Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO₂. Zwei 75 cm² Flaschen werden benötigt, um mit der Antikörperproduktion fortzufahren. Zellkulturverfahren sollten in einer Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um sichere Arbeitsbedingungen zu gewährleisten und eine Kontamination der Kulturen zu verhindern.
   1. Resuspendieren Sie 1 ml aufgetauter Zellen (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ Zellen/ml) in 9 ml ISF-1 Medium, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C) in einen Zellkulturkolben (25^cm2). Den Kolben horizontal in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, 5 %_{CO2 , stellen}.
   2. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2bis zu 70% Konfluenz. Dies sollte normalerweise nach 24 - 48 h erreicht werden.
   3. Sobald die Zellen zu 70% konfluent sind, wird die komplette NLDC-145-Zellsuspension (10 ml) mit einem Pipettenregler mit einer Pipette in einem Volumenbereich von 1-10 ml in ein konisches 15-ml-Zentrifugenrohr überführt. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
   4. ISF-1-Medium in einem Wasserbad auf 37 °C vorwärmen und das Pellet in 12 ml ISF-1-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin, resuspendieren. Die resuspendierte Zellsuspension wird in einen frischen Zellkulturkolben (75^{cm2) überführt.}
   5. Kultivieren und erweitern Sie die Zellen in ISF-1 Medium, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5%_CO2,bis 70% konfluent und 99% lebensfähig sind. Dies sollte normalerweise nach 48 - 72 h erreicht werden.
   6. Teilen Sie die Zellen in zwei 75 cm^{2 Kolben} auf. Dazu spülen Sie zunächst den Boden des Zellkulturkolbens / die Kulturoberfläche mit der Zellsuspension, um alle NLDC-145-Zellen von der Oberfläche zu entfernen. Geben Sie jeweils 6 ml der NLDC-145 Zellsuspension in eine von zwei frischen 75 cm² Flaschen und geben Sie vorgewärmtes ISF-1 Medium, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin bis zu 12 ml.
      HINWEIS: Erneuern Sie das Zellkulturmedium nicht, da die NLDC-145-Zellen das Medium konditioniert haben. Übertragen Sie die Zellen zusammen mit ihrem Medium und füllen Sie die Kultur bis zum gewünschten Volumen mit frischem Medium. Dies ist entscheidend für die Lebensfähigkeit und maximale Antikörperproduktion der NLDC-145-Zellen.
   7. Die Zellkulturen werden bei 37 °C und 5%_CO2bis zu etwa 70% konfluent, was in der Regel nach 48 - 72 h erreicht wird.
   8. Sobald die Zellen zu 70% konfluent sind, werden 10 ml der expandierten NLDC-145-Zellsuspension aus jeder der 75 cm² Flaschen in eine PETG-Walzenflasche (Polyethylenterephthalatglykol) (1.050^cm2)übertragen. Spülen Sie dazu den Boden/ die Kulturoberfläche des Zellkulturkolbens mit der Zellsuspension, um alle Zellen mit einem Pipettenregler und einer 10-ml-Pipette von der Oberfläche zu entfernen.
   9. 140 ml ISF-1 Medium, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C) direkt aus der mittleren Flasche, in jede der NLDC-145 enthaltenden Walzenflaschen gegeben, die sie bis zur 150-ml-Marke füllen.
      HINWEIS: Siehe Hinweis in Schritt 1.1.6.
   10. Die Walzenflaschen bei 37 °C, 5%_CO2 und 25 Schuss/min drei Tage lang kultivieren.
   11. Zu jeder der NLDC-145 enthaltenden Walzenflaschen werden 150 ml ISF-1 Medium, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C), gegeben und bis zur 300-ml-Marke gefüllt.
   12. Kulturieren Sie die Walzenflaschen mit jeweils 300 ml Kultur bei 37 °C, 5%_CO2 und 25 Schuss/min für weitere drei Tage.
   13. Zu jeder der NLDC-145 enthaltenden Walzenflaschen werden weitere 100 ml ISF-1 Medium, ergänzt mit 1% Penicillin/Streptomycin (vorgewärmt auf 37 °C), gegeben und bis zur 400-ml-Marke gefüllt.
   14. Kulturieren Sie die Walzenflaschen mit jeweils 400 ml Kultur bei 37 °C, 5%_CO2 und 25 Runden/min für weitere sieben Tage.
       HINWEIS: Während dieser Woche wird die Kultur sehr dicht (bis zu 95% Dichte) und die Lebensfähigkeit nimmt ab (bis zu 50%), was eine maximale Antikörperfreisetzung ermöglicht.
2. Zur Reinigung von αDEC-205 aus dem Kulturüberstand gießen Sie die NLDC-145 Zellsuspension (aus beiden Walzenflaschen) direkt in 500 ml autoklavierte Zentrifugationsflaschen.
   HINWEIS: Es sollte ein Gesamtvolumen von 800 ml Kultur gesammelt werden.
   1. Zentrifugieren Sie die Kultur für 30 min bei 8.600 x g und 4 °C, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
   2. Sammeln Sie die Überstände, entsorgen Sie die Pellets und bündeln Sie die Überstände in einer sterilen Reagenzflasche.
      HINWEIS: Die Reinigung von αDEC-205 kann sofort begonnen werden (Schritt 2.) oder der Überstand kann kurzfristig bei 4 °C gelagert werden.

2. Aufreinigung des αDEC-205 Antikörpers aus dem NLDC-145 Zellüberstand

HINWEIS: Aus dem NLDC-145-Zellüberstand wird αDEC-205 mit einer Protein-G-Sepharose-Säule (wiederverwendbar) gereinigt. Die Säulenabmessungen betragen 15 mm x 74 mm und 5 mL Protein G Sepharose werden pro Säule verpackt.

1. Zur Zubereitung und zum Waschen der Protein-G-Sepharose-Säule wird ein luftdichter Gummipfropfen auf die obere Öffnung der Protein-G-Sepharose-Säule aufgebracht. Durchstechen Sie den Gummistopfen mit zwei sterilen Kanülen (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
   1. Verbinden Sie eine 10 mL Spritze mit einer der beiden Kanülen und einem flexiblen Silikonrohr (ca. 100 cm lang, 2,5 - 3 mm Durchmesser) mit einem Schlauchanschluss an die zweite Kanüle.
      HINWEIS: Die Spritzen-/Gummistopfenkonstruktion ist wiederverwendbar und bietet ein Vakuum, was zu einem kontinuierlichen Fluss des großen Volumens des Kulturüberstands zur Proteinsäule G Sepharose führt. Ziehen Sie zu diesem Zweck den Kolben der Spritze leicht zurück, um in den folgenden Schritten einen kontinuierlichen Flüssigkeitsfluss zu gewährleisten.
   2. Waschen Sie die Säule mit 50 ml 0,1 M Eisessig (pH 2), um potenziell verbleibende Antikörper aus einer früheren Antikörperreinigung zu entfernen. Das Ende des Silikonrohrs in die mit 0,1 M Eisessig (pH 2) gefüllte Reagenzflasche geben. Durch das induzierte Vakuum laufen 50 ml der 0,1 M Eisessig (pH 2) tropfenweise durch das Protein G Sepharose-Säule.
      HINWEIS: 0,1 M Eisessig (pH 2) sollten in einer Reagenzflasche oder frisch abgefüllt in einem Becherglas aufbewahrt werden.
   3. Waschen Sie die Säule mit 100-200 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Legen Sie das Ende des Silikonrohrs in eine PBS-gefüllte Reagenzflasche oder einen Becher. Lassen Sie 100-200 ml PBS tropfenweise durch das Protein G Sepharose Säule laufen.
2. Zur Antikörperreinigung aus dem NLDC-145-Überstand werden 800 ml des NLDC-145-Überstands (erhalten aus Schritt 1.2.2.) auf die Säule geladen. Legen Sie das Ende des Silikonrohrs in die mit Überstand gefüllte Reagenzflasche NLDC-145. Lassen Sie 800 ml NLDC-145 Überstand tropfenweise durch die Säule laufen.
   1. Waschen Sie die Säule mit 500 ml PBS. Legen Sie das Ende des Silikonröhrchens in eine PBS-gefüllte Reagenzflasche oder ein Becherglas. Lassen Sie 500 ml PBS dropweise durch die Säule laufen.
   2. Verwenden Sie zur Elution 20 1,5-ml-Röhrchen und pipettieren Sie 100 μL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) in jedes 1,5-ml-Röhrchen. Entfernen Sie den Gummipfropfen aus der Säule und pipettieren Sie 1 ml 0,1 M Glycin (pH 3) in die obere Kammer der Säule des Proteins G Sepharose, um den Antikörper aus der Säule zu eluieren. Sammeln Sie den Durchfluss direkt als Eluat in einem der vorbereiteten 1,5 ml Rohre.
   3. Wiederholen Sie den Elutionsschritt (2.2.2.) für alle 20 Röhrchen (1,5 ml).
   4. Bestimmen Sie die optische Dichte aller Elutionsfraktionen bei 280 nm (OD₂₈₀) mit einem Spektralphotometer, um die antikörperhaltigen Fraktionen zu identifizieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie die erste Elutionsfraktion als Leerwert.
   5. Alle Fraktionen mit_{einem OD 280} größer als 0,5 (ca. 10 Fraktionen) bündeln.
   6. Lagern Sie das Protein G Sepharose Säule gefüllt mit 20% Ethanol bei 4 °C.
3. Dialysieren Sie die gepoolten Elutionen gegen 1000 ml PBS (in einem 2000 ml Becherglas) bei 4 °C über Nacht mit einem Dialyseschlauch mit einem Molekulargewichtsschnitt (MWCO) von 12 - 14 kDa.
   1. Schneiden Sie den Dialyseschlauch in Stücke von 20 cm. Kochen Sie den Dialyseschlauch in 500-800 ml 10 mM EDTA (pH 7,5) für 30 min in einem Becherglas mit einer Heizplatte, um Verunreinigungen zu entfernen. Entsorgen Sie die 10 mM EDTA (pH 7,5) Lösung und kochen Sie den Dialyseschlauch in entionisiertem Wasser für 10 min.
      HINWEIS: Der Dialyseschlauch kann direkt verwendet oder in 0,01% iger Natriumazid_{(NaN3)/H2O-Lösung}bei 4 °C bis zur nächsten Anwendung gelagert werden.
   2. Schließen Sie den Boden des Dialyseschlauches mit einem geeigneten Dialyseschlauchverschluss/einteiligen Klappklemme und pipettieren Sie die Antikörperelution vorsichtig in den Dialyseschlauch. Schließen Sie die Oberseite des Dialyseschlauchs mit einer zweiten Klemme.
   3. Befestigen Sie die obere Klemme des Dialyseschlauches an einem schwimmenden Ständer, stecken Sie ihn zusammen mit einem Magnetrührstab in das PBS-gefüllte Becherglas und legen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer.
   4. Dialysieren Sie über Nacht unter Rühren bei 4 °C.
4. Um die Konzentration von αDEC-205 zu erhöhen, laden Sie das komplette Dialysat auf einen Zentrifugalkonzentrator mit 10 kDa MWCO. Öffnen Sie eine Klemme des Schlauches und pipettieren Sie vorsichtig das komplette Dialysat aus dem Dialyseschlauch in den Zentrifugalkonzentrator (10 kDa MWCO).
   HINWEIS: Berühren Sie nicht den Konzentratorboden mit der Pipettenspitze.
   1. Zentrifuge für 30 min bei 693 x g (2.000 U/min) und 4 °C.
   2. Bestücken Sie den Zentrifugalkonzentrator mit 10 ml PBS und zentrifugieren Sie ihn bei 693 x g (2.000 U/min) und 4 °C, bis das endgültige Volumen der verbleibenden Antikörperlösung 1-1,5 ml beträgt.
      ANMERKUNG: Wiederholen Sie erforderlichenfalls den Zentrifugationsschritt von 2.4.1. , um sich auf die gewünschte Menge einzustellen.
   3. Mit einem Spektralphotometer wird die optische Dichte der konzentrierten αDEC-205-Lösung bei 280 nm (OD₂₈₀₎bestimmt. Verwenden Sie PBS als Leerzeichen.
   4. Berechnen Sie die Konzentration von αDEC-205 mit der folgenden Formel:
      Konzentration [mg/ml] = OD₂₈₀/1,4.
   5. Filtern Sie die αDEC-205-Lösung mit einer 0,22 μm Spritzenfiltereinheit.
      HINWEIS: Die Aufreinigung von αDEC-205 aus dem NLDC-145 Hybridom-Zellüberstand kann auch durch FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) erreicht werden. Gereinigtes αDEC-205 kann bei 4 °C oder bei -18 °C zur Langzeitlagerung gelagert werden.

3. Chemische Konjugation von OVA zu αDEC-205

ANMERKUNG: Für eine optimale chemische Konjugation ist ein Verhältnis von 0,5 mg OVA-Protein zu 2,5 mg αDEC-205 (1:5) erforderlich. Dieses Verhältnis kann jedoch für andere Proteine und Antikörper variieren und muss für alternative Konjugate optimiert werden. Die Reduktion der Disulfidbindungen des OVA-Proteins erfolgt durch Inkubation mit 30 mM TCEP-HCl, wodurch die Sulfhydryl-Gruppen für die chemische Konjugation αDEC-205 und 240 μl TCEP-HCl in Schritt 3.2 ausgesetzt werden. Beide Schritte, TCEP-induzierte Reduktion der OVA (Schritt 3.1.) und Sulfo-SMCC-Aktivierung von αDEC-205 (Schritt 3.2.), sollten vorzugsweise parallel durchgeführt werden.

1. Eine 125 mM TCEP-HCl Lösung (pH 7,0) frisch zubereiten. Die gewünschte Menge TCEP-HCl abwengen und das TCEP-HCl in 0,9 M Tris Base (pH 8,8) auflösen. Verwenden Sie pH-Indikatorstreifen, um den pH-Wert der 125 mM TCEP-HCl-Lösung (die neutral sein sollte) zu testen und den pH-Wert mit Tris-Basis (pH 8,8) einzustellen.
   1. 200 μL OVA Proteinlösung (mit 0,5 mg OVA) in ein 1,5 ml steriles Röhrchen pipettieren. Dem OVA-Protein werden 240 μl 125 mM TCEP-HCl und 560 μL steriles Reinstwasser mit einer Pipette auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml OVA-Protein und 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl) gegeben.
      HINWEIS: 2,5 mg EndoGrade OVA (lyophilisiert) werden in 1 ml PBS gelöst, was zu einer 2,5 mg/ml OVA-Lösung führt.
   2. Inkubieren Sie die resultierende OVA/TCEP-HCl bei Raumtemperatur für 1,5 h.
      HINWEIS: Verlängern Sie diesen Inkubationsschritt nicht.
2. Um αDEC-205 für die Konjugation zu aktivieren, lösen Sie 2 mg Sulfo-SMCC in 100 μL Reinstwasser auf.
   HINWEIS: Sulfo-SMCC ist anfällig für Hydrolyse. Daher sollten größere Mengen ungelöster Sulfo-SMCC schnell behandelt oder verfügbare 2 mg Aliquots verwendet werden.
   1. Verdünnen Sie αDEC-205 in PBS, so dass 2,5 mg in 900 μL enthalten sind.
   2. Mischen Sie 2,5 mg αDEC-205 (900 μL Volumen; erhalten aus Schritt 3.2.1.) und 100 μL Sulfo-SMCC (erhalten aus Schritt 3.2.) in einem 1,5 ml Röhrchen, was zu einem Gesamtvolumen von 1 ml führt.
   3. Die αDEC-205/sulfo-SMCC-Lösung für 30 min bei 37 °C und 550 U/min in einem Heizblock inkubieren.
3. Nach diesen Inkubationen werden überschüssige Sulfo-SMCC und TCEP-HCl mittels Entsalzungskolonnen (MWCO 7 kDa; 5 ml Säulenvolumen) sofort aus den Lösungen entfernt.
   1. Drehen Sie den Bodenverschluss der Säulen (MWCO 7 kDa) ab, lösen Sie die Kappe und legen Sie die Säule in ein konisches 15-ml-Rohr.
   2. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g bei Raumtemperatur, um die Flüssigkeit zu entfernen.
   3. Legen Sie die Säule in ein frisches Röhrchen und entfernen Sie die Kappe. Laden Sie langsam den Antikörper/Sulfo-SMCC bzw. die OVA/TCEP-HCl in die Mitte des kompakten Harzbettes von jeweils einer Säule.
   4. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g bei Raumtemperatur.
   5. Verwerfen Sie die Spalten nach der Verwendung. Die für die Konjugation vorbereiteten Lösungen, die Antikörper und OVA enthalten, befinden sich in den Röhrchen.
   6. Mischen Sie sofort beide Lösungen durch Pipettieren zur Konjugation von αDEC-205 und OVA.
   7. Die resultierende αDEC-205- und OVA-Mischung über Nacht bei 4°C inkubieren.
4. Nach der Konjugation wird überschüssige ungebundene OVA aus der Lösung entfernt und die gekoppelte αDEC-205/OVA mit einem zentrifugalen Proteinkonzentrator (MWCO 150 kDa) konzentriert.
   1. Spülen Sie den zentrifugalen Proteinkonzentrator (MWCO 150 kDa) vor, indem Sie 12 ml PBS auf die Säule pipettieren und 2 min bei 2.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
      ANMERKUNG: Falls erforderlich, wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt (3.4.1.), bis ein Volumen von etwa 5 ml die Säule passiert hat.
   2. Bevor Sie die αDEC-205/OVA auf den Zentrifugalproteinkonzentrator laden, bewahren Sie eine 20-μL-Probe des unkonzentrierten αDEC-205/OVA für die Western-Blot-Analyse auf. Dieses Aliquot bis zur Analyse bei 4 °C lagern.
   3. Laden Sie die αDEC-205/OVA durch Pipettieren auf den zentrifugalen Proteinkonzentrator.
      HINWEIS: Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit dem Bett der oberen Kammer des Zentrifugalkonzentrators.
   4. Füllen Sie den Konzentrator auf 15 ml mit PBS und zentrifugieren Sie den Konzentrator für 5 min bei 2.000 x g bei Raumtemperatur.
   5. Speichern Sie eine Probe des Durchflusses (Durchfluss I) für die Western-Blot-Analyse und verwerfen Sie den verbleibenden Durchfluss.
   6. Füllen Sie den Konzentrator auf 10 ml mit PBS und zentrifugieren Sie den Konzentrator für mindestens 8 min bei 2.000 x g bei Raumtemperatur.
   7. Speichern Sie eine Probe für den zweiten Durchfluss (Durchfluss II) für die Western-Blot-Analyse und verwerfen Sie den verbleibenden Durchfluss.
   8. Sobald die gewünschte Anreicherung erreicht ist (etwa 1,5 ml der αDEC-205/OVA-Lösung sollten in der oberen Kammer belassen werden), saugen Sie die konzentrierte Probe vorsichtig ab.
      HINWEIS: Wenn zu viel Flüssigkeit in der oberen Kammer verbleibt, kann die Zentrifugation wiederholt werden, sollte aber so kurz wie möglich gehalten werden.
5. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des resultierenden αDEC-205/OVA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer. Verwenden Sie PBS als Leerzeichen.
6. Filtern Sie die αDEC-205/OVA mit einer 0,22 μm Spritzenfiltereinheit.
   HINWEIS: Für spätere Analysen und In-vivo-Experimente kann αDEC-205/OVA bei 4 °C oder -18 °C gelagert werden.

4. Überprüfung der chemischen Konjugation durch Western Blot

HINWEIS: Zur Überprüfung der erfolgreichen chemischen Konjugation wird eine Western-Blot-Analyse zum Nachweis von OVA (4.2) oder αDEC-205 (4.10) durchgeführt. Der Nachweis von OVA (4.2.) oder αDEC-205 (4.10.) sollte parallel durchgeführt werden. Ein Orbitalplattform-Shaker sollte vorzugsweise für alle Inkubationsschritte der Western-Blot-Membranen verwendet werden, um eine gleichmäßige Verteilung der jeweiligen Lösungen zu ermöglichen.

1. Bereiten Sie Standard-10% SDS-Gele (Natriumdodecylsulfat) für SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) vor.
2. Bereiten Sie die Proben für SDS-PAGE vor, um konjugierte und unkonjugierte OVA zu erkennen und eine Gelelektrophorese durchzuführen.
   1. Verdünnen Sie verschiedene Mengen gekoppelter αDEC-205/OVA (z. B. 200, 100 und 50 ng), reiner OVA (z. B. 80, 70, 60, 50, 40 und 30 ng), eines Aliquots aus unkonjugiertem αDEC-205 (z. B. 100 und 50 ng), einer Probe von unkonzentriertem αDEC-205/OVA-Konjugat aus Schritt 3.4.2. (z. B. 125 ng) und ein Aliquot des Durchflusses I und II (Schritte 3.4.5 bzw. 3.4.7.; fakultativ) in 4 x nicht reduzierendem SDB-Probenpuffer.
      HINWEIS: Es werden unterschiedliche Konzentrationen von Konjugat und Protein geladen, um sicherzustellen, dass sowohl freie OVA als auch das Konjugat auf demselben Blot nachgewiesen werden können.
   2. Denaturieren Sie die Proben bei 65 °C für 10 min und 550 U / min in einem Heizblock.
3. Laden Sie die Proben und einen Proteinstandard in ein SDS-Gel und führen Sie SDS-PAGE aus.
4. Führen Sie ein Standard-Blotting der Proteine aus dem SDS-Gel zu einer Methanol-aktivierten PVDF-Membran (Polyvinylidendifluorid) durch (75 min, 125 mA).
5. Nach dem Blottieren die Membran in eine geeignete Schale geben und die Membran blockieren, indem Sie 25 ml 4% iges Mahlzeitenersatz-Shake-Pulver / TBS-T (Tris-gepufferte Kochsalzlösung / 0,1% Tween 20) -Blockierpuffer in die Schüssel pipettieren, die die Membran enthält.
   1. Inkubieren Sie die Membran in der Blocklösung für 60 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
6. Verwerfen Sie die Blocklösung und färben Sie die Membran mit dem primären Kaninchen-αOVA-Antikörper in 2% Mahlzeitenersatz-Shake-Pulver/TBS-T-Antikörperpuffer (Verdünnung 1:3.000) ein, indem Sie 15 ml primäre Antikörperlösung in die Membran in der Schale pipettieren.
   1. Inkubieren Sie die Membran für 45 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (verwenden Sie den Plattformschüttler).
7. Entsorgen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Membran in der Schale (verwenden Sie den Plattformschüttler).
   1. 25 ml TBS-T in die Membran geben und 5 min inkubieren. Verwerfen Sie die Lösung.
   2. 25 ml TBS-T/0,5 M NaCl in die Membran geben und 5 min inkubieren. Verwerfen Sie die Lösung.
   3. 25 ml TBS-T/0,5 % Triton X-100 in die Membran geben und 5 min inkubieren. Verwerfen Sie die Lösung.
   4. 25 ml TBS-T in die Membran geben und 5 min inkubieren. Verwerfen Sie die Lösung.
8. Färben Sie die Membran mit dem sekundären Ziegenantikörper αrabbit-IgG-HRPO (Meerrettichperoxidase) in 2% Mahlzeitenersatz-Shake-Pulver /TBS-T-Antikörperpuffer (Verdünnung 1:2.000), indem Sie 15 ml sekundäre Antikörperlösung auf die Membran in der Schale pipettieren.
   1. Inkubieren Sie die Membran für 45 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (auf dem Plattformschüttler).
9. Die Membran wird wie in Schritt 4.7.1.- 4.7.4 beschrieben erneut gewaschen. mit dem Plattform-Shaker. Für diese Membran fahren Sie als nächstes mit Schritt 4.16 fort. (die folgenden Schritte 4.10.- 4.15. (Detektion von αDEC-205) kann parallel zu den Schritten 4.2.- 4.9.) durchgeführt werden.
10. Bereiten Sie die Proben für den Nachweis von αDEC-205 für SDS-PAGE vor und führen Sie die Gelelektrophorese durch.
    1. Verdünnen Sie verschiedene Mengen αDEC-205/OVA (z. B. 200, 100 und 50 ng), des nicht konjugierten αDEC-205 (z. B. 250, 125, 62,5 ng), der reinen OVA (z. B. 80 und 70 ng), einer Probe von unkonzentriertem αDEC-205/OVA aus Schritt 3.4.2. (z. B. 125 ng) und ein Aliquot des Durchflusses I und II (Schritte 3.4.5 bzw. 3.4.7.; fakultativ) in 4 x nicht reduzierendem SDB-Probenpuffer.
    2. Denaturieren Sie die Proben bei 65 °C für 10 min und 550 U / min in einem Heizblock.
11. Laden Sie die Proben und einen Proteinstandard in ein SDS-Gel und führen Sie eine Gelelektrophorese durch.
12. Führen Sie ein Standard-Blotting der Proteine aus dem SDS-Gel zu einer Methanol-aktivierten PVDF-Membran (Polyvinylidendifluorid) durch (75 min, 125 mA).
13. Nach dem Blottieren die Membran in eine geeignete Schale geben und die Membran blockieren, indem 25 ml 10% blockierender Puffer (Milchpulver / TBS-T) in die Schale, die die Membran enthält, pipettiert werden.
    HINWEIS: Die Blockierungslösungen unterscheiden sich zwischen αDEC-205 und OVA-Erkennung (Schritt 4.5.).
    1. Inkubieren Sie die Membran in der Blockierlösung für 60 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (mit dem Plattformschüttler).
14. Verwerfen Sie die Blocklösung und färben Sie die Membran mit dem Ziegen-αrat-IgG(H+L)-HRPO-Antikörper in 5% Milchpulver/TBS-T-Antikörperpuffer (Verdünnung 1:5.000) ein, indem 15 ml Antikörperlösung in der Schale pipettiert werden.
    HINWEIS: Die Antikörperpuffer unterscheiden sich zwischen αDEC-205-Nachweis und OVA-Nachweis (Schritte 4.6./ 4.8.).
    1. Inkubieren Sie die Membran für 45 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (mit dem Plattformschüttler).
15. Waschen Sie die Membran gründlich in der Schale, wie in den Schritten 4.7.1.- 4.7.4 beschrieben. (verwenden Sie den Plattform-Shaker).
16. Verwenden Sie ein geeignetes Detektionsreagenz, um das HRP-Signal zu entwickeln und die Chemilumineszenz in einem dunklen Raum mit Röntgenfilm oder über ein Bildgebungssystem zu detektieren.

5. Überprüfung der chemischen Konjugation mittels ELISA

1. Führen Sie einen ELISA zur weiteren Überprüfung der erfolgreichen chemischen Konjugation durch, die zu αDEC-205/OVA führt.
2. Beschichten Sie eine geeignete 96-Well-ELISA-Platte mit 100 μL/Well eines 3 ng/μL Kaninchen-αOVA-Antikörpers in einem Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumbicarbonat (NaHCO₃₎pH 9,6 verdünnt in_H2O).
   1. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Nach der Beschichtung waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, z.B. mit einer ELISA-Unterlegscheibe.
4. Blockieren Sie die Platte durch Pipettieren von 200 μL Blockierungspuffer (10% FCS in PBS) in jeder Vertiefung der Platte und inkubieren Sie die Platte für 30 min bei Raumtemperatur.
5. αDEC-205/OVA (erhalten aus Schritt 3.6.) 1:2 in Blocking-Puffer (10% FCS in PBS) seriell verdünnen, um Verdünnungen von 6 μg/ml bis hinunter zu 93,8 ng/ml αDEC-205/OVA zu erhalten, und 100 μL/Well dieser abnehmenden Mengen an αDEC-205/OVA in die Bohrlöcher geben.
   1. Die Platte für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, z.B. mit einer ELISA-Waschmaschine.
7. 100 μL des Ziegen-αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO-Antikörpers (verdünnt auf 1:2.000 in Blocking-Puffer (10% FCS in PBS)) zu jeder Vertiefung der Platte geben.
   1. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, z.B. mit einer ELISA-Waschmaschine.
9. Geben Sie 50 μL HRPO-Substrat in die Vertiefungen. Wenn Sie eine klare Farbreaktion beobachten, stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 150 μl Stopplösung (1M_H2SO4) pro Vertiefung.
10. Nach 5 min wird die Absorption bei 450 nm mit einem ELISA-Lesegerät abgelesen.

Ergebnisse

Die chemische Konjugation von αDEC-205 zu OVA-Protein unter Verwendung dieses Protokolls ermöglicht typischerweise die effiziente Erzeugung von αDEC-205/OVA für In-vivo-DC-Targeting-Ansätze. Es gibt verschiedene Strategien, um die Technik selbst zu verifizieren und die Funktionalität des erhaltenen Konjugats zu testen. Western-Blot-Analyse und ELISA werden verwendet, um eine erfolgreiche Konjugation zu verifizieren und gleichzeitig potenziell freie OVA zu erkennen (

Diskussion

Die chemische Konjugation eines endozytoserezeptorspezifischen Antikörpers und eines Proteinantigens bietet einen effizienten und vor allem flexiblen Ansatz für das In-vivo-DC-Targeting in präklinischen Mausmodellen. Mit unserem Protokoll bieten wir einen effizienten Ansatz für die erfolgreiche Konjugation des Modellantigens OVA zu einem DEC-205-spezifischen IgG-Antikörper.

In unserem Protokoll wird αDEC-205 aus einer Hybridom-Zelllinie gereinigt und in der Vergangenheit haben w...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
antibody buffer 2 %			2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %			5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)			10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %			4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %			10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25	Greiner Bio-One	690175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75	Greiner Bio-One	658175	we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)
cell culture flask T175	Greiner Bio-One	661175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	88532	Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available
centrifuge bottles	Nalgene	525-2314	PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)			0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	89891	Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)	Roche/Merck	12 015 200 01	Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa	SERVA Electrophoresis	44110	Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate	Thermo Fisher Scientific	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Good forte
ISF-1 medium	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
milk powder	Carl Roth	T145.2	powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma	ATCC	HB-290	if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x			for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin	Hyglos (via BioVendor)	321000	EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles	Nunc In Vitro	734-2394	standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany
pH indicator strips	Merck	109535	pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	112-035-062	obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	111-035-045	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)	Abcam	ab181688	used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)	OriGene	R1101	used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column	Merck/Millipore	P3296	5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane	Merck/Millipore	IPVH00010	immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug	Omnilab	5230217	DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast			we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)			1M H2SO4
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
syringe 10 ml	Omnilab		Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T			Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	A35349
tubing connector	Omnilab		Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube