Химическая конъюгация очищенного антитела, направленного на DEC-205, с полноразмерным белком для нацеливания на дендритные клетки мышей in vitro и in vivo

Резюме

Описан протокол химической конъюгации модельного антигена овальбумина к рецептор-специфическому антителу эндоцитоза для нацеливания на дендритные клетки in vivo. Протокол включает очистку антитела, химическую конъюгацию антигена, а также очистку конъюгата и проверку эффективного конъюгации.

Аннотация

Таргетная доставка антигена к перекрестно-презентационным дендритным клеткам (DC) in vivo эффективно индуцирует реакции Т-эффекторных клеток и демонстрирует ценный подход в разработке вакцин. Антиген доставляется в DC через антитела, специфичные для рецепторов эндоцитоза, таких как DEC-205, которые индуцируют поглощение, обработку и презентацию MHC класса I и II.

Эффективная и надежная конъюгация желаемого антигена с подходящим антителом является критическим шагом в нацеливании на DC и среди других факторов зависит от формата антигена. Химическая конъюгация полноразмерного белка с очищенными антителами является одной из возможных стратегий. В прошлом мы успешно установили сшивку модельного антигена овальбумина (OVA) и специфического антитела IgG2a DEC-205 (αDEC-205) для исследований in vivo DC на мышах. Первым этапом протокола является очищение антитела от супернатанта NLDC (нелимфоидных дендритных клеток)-145 гибридомы методом аффинной хроматографии. Очищенное антитело активируют для химической конъюгации сульфо-SMCC (сульфосуцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат), в то время как в то же время сульфгидрильные группы белка OVA подвергают воздействию путем инкубации с TCEP-HCl (трис (2-карбоксиэтил)гидрохлорид фосфина). Избыток TCEP-HCl и сульфо-SMCC удаляют, а антиген смешивают с активированным антителом для ночного соединения. Полученный конъюгат αDEC-205/OVA концентрируется и освобождается от несвязанной OVA. Успешная конъюгация OVA с αDEC-205 подтверждается анализом вестерн-блоттинга и иммуноферментным анализом (ИФА).

Мы успешно использовали химически сшитый αDEC-205/OVA для индуцирования цитотоксических Т-клеточных реакций в печени и сравнения различных адъювантов на предмет их потенциала в индуцировании гуморального и клеточного иммунитета после нацеливания in vivo на DEC-205⁺ DC. Кроме того, такие конъюгаты химически связанных антител / антигенов предлагают ценные инструменты для эффективной индукции ответов вакцины на опухолевые антигены и, как было доказано, превосходят классические подходы к иммунизации в отношении профилактики и терапии различных типов опухолей.

Введение

Дендритные клетки (DC) являются центральными игроками иммунной системы. Они представляют собой разнообразную группу клеток, специализирующихся на антиген-презентации, и их основная функция заключается в установлении врожденного и адаптивного иммунитета^1,2. Важно отметить, что ДК не только играют важную роль в эффективных и специфических патогенных реакциях, но и участвуют во многих аспектах противоопухолевого иммунитета^1,3.

Из-за их исключительной роли в иммунитете хозяина, DC оказался в центре внимания в качестве клеток-мишеней для вакцинации^4. Один из подходов заключается в нацеливании антигенов на DC in vivo для индуцирования антиген-специфических иммунных реакций, и за последние годы большое количество исследований было посвящено определению подходящих рецепторов и стратегиям нацеливания^1,4. Одним из примеров является рецептор лектина С-типа DEC-205, который может быть нацелен на специфические антитела DEC-205, чтобы вызвать эндоцитоз. Важно отметить, что было показано, что нацеливание DEC-205 в комбинации с подходящими адъювантами эффективно индуцирует долгоживущие и защитные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки, а также ответы антител, также против опухолевых антигенов^3,5,6,7,8,9.

Существует ряд исследований, показывающих, что конъюгированные антигены, нацеленные на DC, превосходят свободный неконъюгированный антиген^{3,5,10,11,12.} Это делает конъюгацию антигена с соответствующим фрагментом, нацеленным на постоянный ток, центральным шагом в подходах к нацеливанию на ДК. В случае нацеливания на DC через антитела или фрагменты антител антигены могут быть либо химически, либо генетически связаны, и любая стратегия обеспечивает свои собственные (дис)преимущества^1. С одной стороны, в генно-инженерных конструкциях антитело-антиген существует контроль над дозой антигена, а также местоположением, обеспечивающим превосходную сопоставимость между лотами^1. В то же время, однако, химическая конъюгация требует меньшей подготовки и обеспечивает большую гибкость, особенно при попытке тестирования и сравнения различных антигенов и / или стратегий вакцинации в экспериментальных и доклинических моделях.

Здесь мы представляем протокол эффективной и надежной химической конъюгации овальбумина (OVA) в качестве модельного белкового антигена к DEC-205-специфическому антителу IgG2a (αDEC-205), подходящему для нацеливания in vivo DC на мышей. Во-первых, αDEC-205 очищают от клеток гибридомы NLDC-145^13. Для химической конъюгации используется гетеробифункциональный сшивающий сульфосукцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), который содержит эфир NHS (N-гидроксисукцинимид) и малеимидные группы, позволяющий ковалентную конъюгацию амино- и сульфгидрилсодержащих молекул. В частности, первичные амины антитела первоначально реагируют с сульфо-SMCC и полученный малеимид-активированный αDEC-205 затем реагирует с сульфгидрилсодержащим белком OVA, восстановленным через TCEP-HCl (Tris(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид). Конечный продукт представляет собой химически сопряженный αDEC-205/OVA(рисунок 1). Помимо самой химической конъюгации, наш протокол описывает удаление избытка OVA из конъюгата, а также проверку успешной конъюгации с помощью анализа вестерн-блот и специфического иммуноферментного анализа. Мы успешно использовали этот подход в прошлом для химической конъюгации OVA и других белков или иммуногенных пептидов с αDEC-205. Мы демонстрируем эффективное связывание с CD11c⁺ клетками in vitro, а также эффективную индукцию клеточного и гуморального иммунитета in vivo.

Конечно, у этого метода есть недостатки, такие как сопоставимость партии с партией и точное дозирование антигена в конечном конъюгате. Тем не менее, химическая конъюгация обеспечивает экспериментальную гибкость в выборе антитела и белкового антигена по сравнению с генетически модифицированными конструкциями. Поэтому мы считаем, что этот подход особенно ценен при оценке различных антигенов на предмет их эффективности в нацеливании на DC в доклинических моделях мышей, что важно также в контексте специфических противоопухолевых иммунных реакций.

протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены местным правительственным агентством (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; номер файла 33.12-42502-04-10/0108) и были выполнены в соответствии с национальными и институциональными руководящими принципами.

1. Производство αDEC-205 из гибридной клеточной линии NLDC-145

1. Для производства антител оттаивают криоконсервированные клетки NLDC-145, продуцирующие αDEC-205 при 37 °C на водяной бане. Расширьте ячейки при 37 °C и 5% CO₂. Два 75 см² бутылки понадобятся, чтобы приступить к производству антител. Процедуры культивирования клеток должны выполняться в шкафу безопасности для обеспечения безопасных условий труда и предотвращения загрязнения культур.
   1. Повторно суспендировать 1 мл размороженных клеток (1 х 10⁶ - 5 х 10⁶ клеток/мл) в 9 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллином/стрептомицином (предварительно нагретым до 37 °C) в колбу для культивирования клеток (25^см2). Поместите колбу горизонтально в инкубатор клеточной культуры при 37 °C, 5% CO_2.
   2. Культивируйте клетки при 37 °C и 5% CO_2,до 70% слияния. Обычно это должно быть достигнуто через 24 - 48 ч.
   3. Как только ячейки сольются на 70%, перенесите полную суспензию ячейки NLDC-145 (10 мл) в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл с помощью контроллера пипетки с пипеткой в диапазоне объемов от 1 до 10 мл. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
   4. Предварительно нагрейте среду ISF-1 до 37 °C на водяной бане и повторно суспендируйте гранулу в 12 мл среды ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина. Переложите повторно суспендированную клеточную суспензию в колбу для свежей культуры клеток (75^см2).
   5. Культивируют и расширяют клетки в среде ISF-1, дополненной 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C и 5% CO_2,до 70% сливающегося и 99% жизнеспособного. Обычно это должно быть достигнуто через 48 - 72 ч.
   6. Разделите ячейки на две колбы по^{75 см2.} Для этого сначала промыть нижнюю часть колбы клеточной культуры / поверхность культуры клеточной суспензией, чтобы удалить все клетки NLDC-145 с поверхности. Переложите по 6 мл клеточной суспензии NLDC-145 в один из двух свежих флаконов по^{75 см2} и добавьте предварительно подогретую среду ISF-1, дополненную 1% пенициллином/стрептомицином до 12 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не обновляйте среду культивирования клеток, так как клетки NLDC-145 будут обусловливать среду. Переложите клетки вместе с их средой и заполните культуру до нужного объема свежей средой. Это имеет решающее значение для жизнеспособности и максимальной выработки антител клетками NLDC-145.
   7. Расширяют клеточные культуры при 37 °C и 5%_CO2,до примерно 70% слива, что обычно достигается через 48 - 72 ч.
   8. Как только ячейки станут 70% сливающимися, переместите 10 мл расширенной клеточной суспензии NLDC-145 из каждой из бутылок^{размером 75 см2} в одну бутылку-ролик ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль) (1050^см2). Для этого промыть дно колбы клеточной культуры / поверхность культуры клеточной суспензией, чтобы удалить все клетки с поверхности с помощью контроллера пипетки и пипетки 10 мл.
   9. Добавьте 140 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллином/стрептомицином (предварительно нагретой до 37 °C) непосредственно из средней бутылки, в каждую из бутылок NLDC-145, содержащих роликовые бутылки, заполняющие их до отметки 150 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. примечание на этапе 1.1.6.
   10. Культивируйте роликовые бутылки при 37 °C, 5% CO₂ и 25 раунд/мин в течение трех дней.
   11. Добавьте 150 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллина/стрептомицина (предварительно нагретого до 37 °C), к каждой из NLDC-145, содержащих роликовые бутылки, заполняющие их до отметки 300 мл.
   12. Культивируйте роликовые бутылки, которые теперь содержат культуру по 300 мл каждая при 37 °C, 5% CO₂ и 25 раундов / мин в течение еще трех дней.
   13. Добавьте еще 100 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллином/стрептомицином (предварительно нагретой до 37 °C), к каждой из бутылок, содержащих ролики NLDC-145, тем самым заполняя их до отметки 400 мл.
   14. Культивируйте роликовые бутылки, которые теперь содержат культуру по 400 мл каждая при 37 °C, 5% CO₂ и 25 раунд/мин, в течение еще семи дней.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этой недели культура становится очень плотной (до 95% плотности), а жизнеспособность снижается (всего до 50%), что обеспечивает максимальное высвобождение антител.
2. Для очистки αDEC-205 от супернатанта культуры заливают клеточную суспензию NLDC-145 (из обеих роликовых бутылок) непосредственно в 500 мл автоклавных центрифугированных бутылок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем культуры должен быть собран в 800 мл.
   1. Центрифугируйте культуру в течение 30 мин при 8 600 х г и 4 °C для удаления клеток и мусора.
   2. Соберите супернатанты, выбросив гранулы и объединив супернатанты в стерильную бутылку с реагентами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка αDEC-205 может быть начата немедленно (стадия 2.) или супернатант может храниться кратковременно при 4 °C.

2. Очистка антитела αDEC-205 от супернатанта клеток NLDC-145

ПРИМЕЧАНИЕ: Из клеточного супернатанта NLDC-145 αDEC-205 очищают с использованием белковой колонки G Sepharose (многоразовой). Размеры колонны составляют 15 мм х 74 мм, а 5 мл белка G Sepharose упаковываются на столбец.

1. Для приготовления и промывки белковой колонки G Sepharose поставьте герметичную резиновую пробку на верхнее отверстие белковой колонки G Sepharose. Прокол резиновой заглушки двумя стерильными канюлями (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 мм).
   1. Подключите шприц объемом 10 мл к одной из двух канюль и гибкую силиконовую трубку (длиной около 100 см, диаметром 2,5 - 3 мм) с помощью разъема для трубки ко второй канюле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция шприца/резиновой заглушки является многоразовой и обеспечивает вакуум, что приводит к непрерывному потоку большого объема культивируемого супернатанта к колонке белка G Sepharose. С этой целью слегка оттяните плунжер шприца, чтобы обеспечить непрерывный поток жидкости на следующих этапах.
   2. Промыть столб 50 мл 0,1 мл ледниковой уксусной кислоты (рН 2), чтобы удалить потенциально оставшиеся антитела из любой предыдущей очистки антител. Поместите конец кремниевой трубки в бутылку с реагентом, заполненную ледниковой уксусной кислотой (рН 2). В результате индуцированного вакуума 50 мл 0,1 М ледниковой уксусной кислоты (рН 2) по каплям проходят через столб белка G Sepharose.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,1 М ледниковой уксусной кислоты (рН 2) следует хранить в бутылке с реагентами или свеженаполненной в стакане.
   3. Промыть колонну 100-200 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Поместите конец кремниевой трубки в наполненную PBS бутылку с реагентом или стакан. Пусть 100-200 мл PBS проходят по каплям через белковую колонку G Sepharose.
2. Для очистки антител от супернатанта NLDC-145 загрузите на колонку 800 мл супернатанта NLDC-145 (полученного на стадии 1.2.2.). Поместите конец кремниевой трубки в бутылку реагента, наполненную супернатантом NLDC-145. Пусть 800 мл супернатанта NLDC-145 проходят по каплям через колонну.
   1. Вымойте колонну 500 мл PBS. Поместите конец кремниевой трубки в наполненную PBS бутылку с реагентом или стакан. Пусть 500 мл PBS проходит по каплям через столбец.
   2. Для элюирования используйте 20 пробирок 1,5 мл и пипетку 100 мкл 1,5 М Tris-HCl (рН 8,8) в каждую трубку объемом 1,5 мл. Выньте резиновую пробку из колонки и пипетку 1 мл 0,1 М глицина (рН 3) в верхнюю камеру колонки белка G Sepharose для элюирования антитела из колонки. Соберите проточную трубу непосредственно в виде элюата в одной из подготовленных пробирок объемом 1,5 мл.
   3. Повторите стадию элюирования (2.2.2.) для всех 20 пробирок (1,5 мл).
   4. Определить оптическую плотность всех фракций элюирования при 280 нм (OD₂₈₀₎с помощью спектрофотометра с целью идентификации фракций, содержащих антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте первую фракцию элюирования в качестве пустой.
   5. Объедините все фракции с OD₂₈₀ больше 0,5 (приблизительно 10 фракций).
   6. Храните столбец белка G Sepharose, заполненный 20% этанолом при 4 °C.
3. Диализуйте объединенные элюиты против 1000 мл PBS (в стакане 2000 мл) при 4 °C в течение ночи с использованием диализных трубок с отсеченной молекулярной массой (MWCO) 12 - 14 кДа.
   1. Нарежьте диализную трубку на кусочки по 20 см. Кипятите диализную трубку в 500-800 мл 10 мМ ЭДТА (рН 7,5) в течение 30 мин в стакане, используя конфорку для удаления загрязнений. Откажитесь от раствора 10 мМ ЭДТА (рН 7,5) и кипятите диализную трубку в деионизированной воде в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализную трубку можно использовать непосредственно или хранить в 0,01% растворе азида натрия (NaN 3)/H2O при 4°C до следующего использования.
   2. Закройте нижнюю часть диализной трубки соответствующей диализной трубкой/ цельным, шарнирным зажимом и осторожно вставьте элюирование антител в диализную трубку. Закройте верхнюю часть диализной трубки вторым зажимом.
   3. Закрепите верхний зажим диализной трубки на плавающей подставке, поместите его вместе с магнитным перемешивателем в заполненный PBS стакан и поместите стакан на магнитную мешалку.
   4. Диализ на ночь помешивают при 4 °C.
4. Чтобы увеличить концентрацию αDEC-205, загрузите полный диализат в центробежный концентратор с MWCO 10 кДа. Откройте один зажим трубки и аккуратно выложите весь диализат из диализной трубки в центробежный концентратор (10 кДа MWCO).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к дну концентратора наконечником пипетки.
   1. Центрифуга в течение 30 мин при 693 х г (2 000 об/мин) и 4 °C.
   2. Нагрузите центробежный концентратор 10 мл PBS и центрифугой при 693 x g (2000 об/мин) и 4 °C до тех пор, пока конечный объем оставшегося раствора антител не составит 1-1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости повторите этап центрифугирования, указанный в разделе 2.4.1. подстроиться под нужную сумму.
   3. С помощью спектрофотометра определяют оптическую плотность концентрированного раствора αDEC-205 при 280 нм (OD_280). Используйте PBS в качестве пустого.
   4. Рассчитайте концентрацию αDEC-205 по следующей формуле:
      концентрация [мг/мл] = OD 280/1,4.
   5. Фильтруйте раствор αDEC-205 с помощью шприцевого фильтрующего блока 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка αDEC-205 от супернатанта клеток гибридомы NLDC-145 также может быть достигнута с помощью FPLC (быстрая белковая жидкостная хроматография). Очищенный αDEC-205 можно хранить при 4 °C или при -18 °C для длительного хранения.

3. Химическое сопряжение OVA с αDEC-205

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной химической конъюгации требуется соотношение 0,5 мг белка OVA к 2,5 мг αDEC-205 (1:5). Однако это соотношение может варьироваться для других белков и антител и должно быть оптимизировано для альтернативных конъюгатов. Восстановление дисульфидных связей белка OVA осуществляют путем инкубации с 30 мМ TCEP-HCl, которая подвергает сульфгидрильные группы химической конъюгации с αDEC-205 и 240 мкл TCEP-HCl необходимы на стадии 3.2. Обе стадии, Индуцированное TCEP восстановление OVA (этап 3.1.) и сульфо-SMCC активация αDEC-205 (этап 3.2.), предпочтительно должны выполняться параллельно.

1. Заново приготовить раствор TCEP-HCl 125 мМ (рН 7,0). Взвесьте желаемое количество TCEP-HCl и растворите TCEP-HCl в основе 0,9 М Трис (рН 8,8). Используйте полоски индикатора pH для проверки pH раствора TCEP-HCl 125 мМ (который должен быть нейтральным) и отрегулируйте pH с основанием Tris (pH 8,8).
   1. Пипетка 200 мкл OVA белкового раствора (содержащего 0,5 мг OVA) в стерильную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 240 мкл 125 мМ TCEP-HCl и 560 мкл стерильной сверхчистой воды к белку OVA с использованием пипетки до конечной концентрации 0,5 мг/мл белка OVA и 30 мМ TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2,5 мг EndoGrade OVA (лиофилизированный) растворяют в 1 мл PBS, в результате чего получается 2,5 мг/мл раствора OVA.
   2. Инкубируют полученный OVA/TCEP-HCl при комнатной температуре в течение 1,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не расширяйте этот этап инкубации.
2. Для активации αDEC-205 для конъюгации растворяют 2 мг сульфо-SMCC в 100 мкл сверхчистой воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сульфо-SMCC подвержен гидролизу. Поэтому следует быстро обрабатывать большие количества нерастворенных сульфо-СМАК или использовать доступные аликвоты 2 мг.
   1. Развести αDEC-205 в PBS так, чтобы 2,5 мг содержалось в 900 мкл.
   2. Смешайте 2,5 мг αDEC-205 (объем 900 мкл; полученный из стадии 3.2.1.) и 100 мкл сульфо-SMCC (полученного из стадии 3.2.) в пробирке объемом 1,5 мл, в результате чего общий объем составит 1 мл.
   3. Инкубировать раствор αDEC-205/sulfo-SMCC в течение 30 мин при 37 °C и 550 об/мин в нагревательном блоке.
3. После этих инкубаций избыток сульфо-SMCC и TCEP-HCl немедленно удаляется из растворов с помощью обессоливающих колонн (MWCO 7 кДа; объем колонки 5 мл).
   1. Открутите нижнюю крышку колонн (MWCO 7 кДа), ослабьте крышку и поместите колонну в коническую трубку объемом 15 мл.
   2. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при комнатной температуре для удаления жидкости.
   3. Поместите колонку в свежую трубку и снимите колпачок. Медленно нагружайте антитела/сульфо-SMCC и OVA/TCEP-HCl, соответственно, в центр компактного смоляного слоя по одной колонке каждый.
   4. Центрифуга в течение 2 мин при 1 000 х г при комнатной температуре.
   5. Удалите столбцы после использования. Растворы, содержащие антитела и OVA, загрунтованные для конъюгации, находятся в пробирках.
   6. Немедленно перемешайте оба раствора путем пипетки для сопряжения αDEC-205 и OVA.
   7. Инкубировать полученную смесь αDEC-205 и OVA в течение ночи при 4°C.
4. После конъюгации избыток несвязанной OVA удаляют из раствора и связывают αDEC-205/OVA концентрируют с использованием центробежного концентратора белка (MWCO 150 кДа).
   1. Предварительно промыть концентратор центробежного белка (MWCO 150 кДа) путем пипетирования 12 мл PBS на колонке и центрифугирования в течение 2 мин при 2000 х г при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости повторяйте стадию центрифугирования (3.4.1.) до тех пор, пока через колонну не пройдет объем около 5 мл.
   2. Перед загрузкой αDEC-205/OVA на концентратор центробежного белка сохраните образец неконцентрированного αDEC-205/OVA объемом 20 мкл для анализа вестерн-блоттинга. Храните эту аликвоту при 4 °C до анализа.
   3. Загрузите αDEC-205/OVA на концентратор центробежного белка путем пипетирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте любого контакта с слоем верхней камеры центробежного концентратора.
   4. Заполните концентратор до 15 мл PBS и центрифугируйте концентратор в течение 5 мин при 2000 х г при комнатной температуре.
   5. Сохраните образец проточного (flow-through I) для анализа вестерн-блоттинга и отбрасывайте оставшийся поток.
   6. Заполните концентратор до 10 мл PBS и центрифугируйте концентратор не менее 8 мин при 2000 х г при комнатной температуре.
   7. Сохраните образец для второго проточного (flow-through II) для анализа вестерн-блоттинга и отбросьте оставшийся поток.
   8. Как только желаемое обогащение достигнуто (около 1,5 мл раствора αDEC-205/OVA следует оставить в верхней камере), осторожно аспирируйте концентрированный образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в верхней камере остается слишком много жидкости, центрифугирование может быть повторено, но должно быть как можно короче.
5. Определите концентрацию белка в полученном αDEC-205/OVA с помощью микрообъемного спектрофотометра. Используйте PBS в качестве пустого.
6. Фильтруйте αDEC-205/OVA с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего анализа и экспериментов in vivo αDEC-205/OVA можно хранить при температуре 4 °C или -18 °C.

4. Проверка химического спряжения вестерн-блотом

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки успешной химической конъюгации проводится анализ вестерн-блоттинга, обнаруживающий либо OVA (4.2), либо αDEC-205 (4.10). Обнаружение OVA (4.2.) или αDEC-205 (4.10.) должно выполняться параллельно. Орбитальный платформенный шейкер предпочтительно следует использовать для всех стадий инкубации мембран западного пятна, чтобы обеспечить равномерное распределение соответствующих растворов.

1. Приготовьте стандартные 10% Гели SDS (додецилсульфат натрия) для SDS-PAGE (электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия).
2. Подготовьте образцы для SDS-PAGE для обнаружения сопряженных и неконъюгированных OVA и запуска гелевого электрофореза.
   1. Разбавить различные количества связанных αDEC-205/OVA (например, 200, 100 и 50 нг), чистой OVA (например, 80, 70, 60, 50, 40 и 30 нг), аликвоты несопряженного αDEC-205 (например, 100 и 50 нг), образца неконцентрированного αDEC-205/OVA, сопряженного со стадии 3.4.2. (например, 125 нг) и аликвота проточных I и II (этапы 3.4.5 и 3.4.7, соответственно; факультативно) в 4 x невосстанавливающемся буфере образцов SDS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные концентрации конъюгата и белка загружаются, чтобы гарантировать, что как свободная OVA, так и конъюгат могут быть обнаружены на одном и том же пятне.
   2. Денатурируйте образцы при 65 °C в течение 10 мин и 550 об/мин в нагревательном блоке.
3. Загрузите образцы и стандарт белка в гель SDS и запустите SDS-PAGE.
4. Выполняют стандартное промокание белков из геля SDS на активированную метанолом PVDF (поливинилидендифторидную) мембрану (75 мин, 125 мА).
5. После продувания поместите мембрану в соответствующую чашку и блокируйте мембрану, пипетируя 25 мл 4% порошка для замены пищи / TBS-T (tris-буферный физиологический раствор / 0,1% Tween 20) блокирующего буфера в чашку, содержащую мембрану.
   1. Инкубируют мембрану в блокирующем растворе в течение 60 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.
6. Откажитесь от блокирующего раствора и окрашивайте мембрану первичным антителом αOVA кролика в 2% порошке для замены пищи /буфере антител TBS-T (разведение 1:3000) путем пипетирования 15 мл раствора первичного антитела на мембрану в чашке.
   1. Инкубировать мембрану в течение 45 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C (используйте платформенный шейкер).
7. Выбросьте раствор антител и промойте мембрану в посуде (используйте платформенный шейкер).
   1. Добавьте 25 мл TBS-T к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
   2. Добавьте 25 мл TBS-T/0,5 M NaCl к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
   3. Добавьте 25 мл TBS-T/0,5% Triton X-100 к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
   4. Добавьте 25 мл TBS-T к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
8. Окрашивают мембрану вторичным антителом козьего αrabbit-IgG-HRPO (пероксидаза хрена) в 2% порошок для замены пищи / буфер антител TBS-T (разведение 1:2000) путем пипетирования 15 мл раствора вторичного антитела к мембране в чашке.
   1. Инкубировать мембрану в течение 45 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C (на платформе шейкера).
9. Снова промыть мембрану, как описано на этапе 4.7.1.- 4.7.4. с помощью платформенного шейкера. Для этой мембраны продолжайте с шагом 4.16. (следующие шаги 4.10.- 4.15. (обнаружение αDEC-205) может быть выполнено параллельно шагам 4.2.- 4.9.).
10. Подготовьте образцы для обнаружения αDEC-205 для SDS-PAGE и запустите гель-электрофорез.
    1. Разбавляют различные количества αDEC-205/OVA (например, 200, 100 и 50 нг), несопряженного αDEC-205 (например, 250, 125, 62,5 нг), чистой OVA (например, 80 и 70 нг), образец неконцентрированного αDEC-205/OVA из этапа 3.4.2. (например, 125 нг) и аликвота проточных I и II (этапы 3.4.5 и 3.4.7, соответственно; факультативно) в 4 x невосстанавливающемся буфере образцов SDS.
    2. Денатурируйте образцы при 65 °C в течение 10 мин и 550 об/мин в нагревательном блоке.
11. Загрузите образцы и стандарт белка в гель SDS и запустите гель-электрофорез.
12. Выполняют стандартное промокание белков из геля SDS на метанол активированную PVDF (поливинилидендифторидную) мембрану (75 мин, 125 мА).
13. После блоттинга поместите мембрану в соответствующую чашку и заблокируйте мембрану, пипетировав 25 мл 10% блокирующего буфера (сухое молоко / TBS-T) в чашку, содержащую мембрану.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующие решения различаются между обнаружением αDEC-205 и OVA (шаг 4.5.).
    1. Инкубируют мембрану в блокирующем растворе в течение 60 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °С (с помощью платформенного шейкера).
14. Откажитесь от блокирующего раствора и окрашивайте мембрану козьим антителом αrat-IgG(H+L)-HRPO в буфере 5% сухого молока/TBS-T антител (разведение 1:5000) путем пипетирования 15 мл раствора антител к мембране в посуде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы антител различаются между обнаружением αDEC-205 и обнаружением OVA (шаги 4.6./ 4.8.).
    1. Инкубировать мембрану в течение 45 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C (с помощью платформенного шейкера).
15. Тщательно вымойте мембрану в посуде, как описано в шагах 4.7.1.- 4.7.4. (используйте шейкер платформы).
16. Используйте соответствующий реагент обнаружения для разработки сигнала HRP и обнаружения хемилюминесценции в темной комнате с помощью рентгеновской пленки или с помощью системы визуализации.

5. Проверка химического спряжения с помощью ИФА

1. Выполните ИФА для дальнейшей проверки успешного химического конъюгирования, в результате чего получается αDEC-205/OVA.
2. Покрыть соответствующую 96-луночную ИФА-пластину 100 мкл/лунку 3 нг/мкл антитела αOVA кролика в буфере покрытия (0,1 М бикарбоната натрия (NaHCO₃₎рН 9,6, разбавленного в_Н2O).
   1. Инкубировать пластину в течение ночи при 4 °C.
3. После нанесения покрытия трижды промывайте пластину PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
4. Блокируйте пластину путем пипетирования 200 мкл блокирующего буфера (10% FCS в PBS) в каждой лунке пластины и инкубируйте пластину в течение 30 мин при комнатной температуре.
5. Последовательно разбавляйте αDEC-205/OVA (полученное на стадии 3.6.) 1:2 в блокирующем буфере (10% FCS в PBS) для получения разрежений в диапазоне от 6 мкг/мл до 93,8 нг/мл αDEC-205/OVA и добавляйте 100 мкл/лунку этих уменьшающихся количеств αDEC-205/OVA в скважины.
   1. Инкубировать пластину в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. Трижды вымойте пластину с помощью PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
7. Добавьте 100 мкл козьего антитела αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (разбавленного до 1:2000 в блокирующем буфере (10% FCS в PBS)) к каждой лунке пластины.
   1. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
8. Трижды вымойте пластину с помощью PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
9. Добавьте в скважины 50 мкл HRPO-субстрата. При наблюдении четкой цветовой реакции останавливают реакцию путем добавления 150 мкл останавливающего раствора (1M H₂SO₄₎на лунку.
10. Через 5 мин считывать абсорбцию при 450 нм с помощью ИФА-считывателя.

Результаты

Химическая конъюгация белка αDEC-205 с белком OVA с использованием этого протокола обычно позволяет эффективно генерировать αDEC-205/OVA для подходов к нацеливанию in vivo DC. Существуют различные стратегии проверки самой техники и проверки функциональности полученного соп?...

Обсуждение

Химическая конъюгация рецептор-специфического антитела эндоцитоза и белкового антигена обеспечивает эффективный и, что важно, также гибкий подход к нацеливанию in vivo DC на доклинических моделях мышей. С помощью нашего протокола мы обеспечиваем эффективный подход для успешной конъ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
antibody buffer 2 %			2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %			5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)			10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %			4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %			10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25	Greiner Bio-One	690175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75	Greiner Bio-One	658175	we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)
cell culture flask T175	Greiner Bio-One	661175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	88532	Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available
centrifuge bottles	Nalgene	525-2314	PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)			0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	89891	Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)	Roche/Merck	12 015 200 01	Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa	SERVA Electrophoresis	44110	Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate	Thermo Fisher Scientific	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Good forte
ISF-1 medium	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
milk powder	Carl Roth	T145.2	powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma	ATCC	HB-290	if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x			for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin	Hyglos (via BioVendor)	321000	EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles	Nunc In Vitro	734-2394	standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany
pH indicator strips	Merck	109535	pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	112-035-062	obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	111-035-045	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)	Abcam	ab181688	used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)	OriGene	R1101	used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column	Merck/Millipore	P3296	5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane	Merck/Millipore	IPVH00010	immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug	Omnilab	5230217	DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast			we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)			1M H2SO4
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
syringe 10 ml	Omnilab		Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T			Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	A35349
tubing connector	Omnilab		Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube