纯化的DEC-205定向抗体与全长蛋白的化学偶联，用于在体外和体内靶向小鼠树突状细胞

摘要

我们描述了一种将模型抗原卵清蛋白化学偶联到内吞作用受体特异性抗体的方案，用于体内树突状细胞靶向。该协议包括抗体的纯化，抗原的化学偶联，以及偶联物的纯化和有效偶联的验证。

摘要

靶向抗原递送到 体内 交叉呈递树突状细胞（DC）可有效诱导T效应细胞反应，并在疫苗设计中显示出一种有价值的方法。抗原通过内吞作用受体（如 DEC-205）特异性抗体递送到 DC，这些受体可诱导摄取、加工和 MHC I 类和 II 类表现。

将所需抗原高效可靠地偶联到合适的抗体是DC靶向的关键步骤，除其他因素外，还取决于抗原的格式。全长蛋白质与纯化抗体的化学偶联是一种可能的策略。过去，我们已经成功地建立了模型抗原卵清蛋白（OVA）和DEC-205特异性IgG2a抗体（αDEC-205）的交联，用于小鼠 体内 DC靶向研究。该协议的第一步是通过亲和色谱法从NLDC（非淋巴树突状细胞）-145杂交瘤的上清液中纯化抗体。纯化的抗体通过磺基-SMCC（磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来亚胺基]环己烷-1-羧酸盐）激活以进行化学偶联，同时通过与TCEP-HCl（三（2-羧乙基）盐酸膦）孵育暴露于OVA蛋白的巩基。除去过量的TCEP-HCl和磺基-SMCC，并将抗原与活化的抗体混合过夜偶联。所得的αDEC-205/OVA偶联物被浓缩并从未结合的OVA中释放出来。通过蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证OVA与αDEC-205的成功偶联。

我们已经成功地使用化学交联的αDEC-205 / OVA在肝脏中诱导细胞毒性T细胞反应，并比较了不同的佐剂在 体内 靶向DEC-205⁺ DC后诱导体液和细胞免疫的潜力。除此之外，这种化学偶联的抗体/抗原偶联物为有效诱导疫苗对肿瘤抗原的反应提供了有价值的工具，并且已被证明在预防和治疗各种类型肿瘤方面优于经典免疫方法。

引言

树突状细胞（DC）是免疫系统的核心参与者。它们是一组专门用于抗原呈递的多样化细胞，其主要功能是桥接先天性和适应性免疫^1，2。重要的是，DC不仅在有效和特异性的病原体导向反应中起重要作用，而且还参与抗肿瘤免疫^1，3的许多方面。

由于它们在宿主免疫中的排他性作用，DC成为疫苗接种靶细胞⁴的焦点。一种方法是在体内将抗原靶向DC以诱导抗原特异性免疫反应，并且在过去几年中，大量研究致力于确定合适的受体和靶向策略^1，4。一个例子是C型凝集素受体DEC-205，其可以通过DEC-205特异性抗体靶向诱导内吞作用。重要的是，DEC-205靶向与合适的佐剂组合已被证明可以有效地诱导长寿命和保护性的CD4⁺和CD8⁺ T细胞，以及抗体反应，也针对肿瘤抗原3，5，6，7，8，9。

有许多研究表明，靶向DC的偶联抗原优于游离的未偶联抗原^{3，5，10，11，12。}这使得抗原与相应的DC靶向部分的共轭成为DC靶向方法的核心步骤。在通过抗体或抗体片段靶向DC的情况下，抗原可以是化学或遗传连接的，并且任何一种策略都提供了自己的（dis）优势^1。一方面，在基因工程抗体 - 抗原构建体中，抗原剂量以及位置的控制在批次¹之间提供卓越的可比性。然而，与此同时，化学偶联需要较少的准备工作，并提供更大的灵活性，特别是在尝试在实验和临床前模型中测试和比较不同的抗原和/或疫苗接种策略时。

在这里，我们提出了一种方案，用于将卵清蛋白（OVA）作为模型蛋白抗原与适合小鼠体内DC靶向的DEC-205特异性IgG2a抗体（αDEC-205）进行有效和可靠的化学偶联。首先，从NLDC-145杂交瘤细胞13中纯化^αDEC-205。对于化学偶联，使用含有NHS（N-羟基琥珀酰亚胺基）和马来酰亚胺基的异双功能交联剂4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯（磺基-SMCC），允许含胺和巯基分子的共价共轭。具体而言，抗体的伯胺最初与磺基-SMCC反应，所得的马来酰亚胺活化的αDEC-205随后与通过TCEP-HCl（三（2-羧乙基）膦盐酸盐）还原的含巯基OVA蛋白反应。最终产物是化学偶联的αDEC-205 / OVA（图1）。除了化学偶联本身之外，我们的方案还描述了从偶联物中去除过量的OVA，以及通过蛋白质印迹分析和特定的酶联免疫吸附测定来验证成功偶联。我们过去曾成功采用这种方法将OVA和其他蛋白质或免疫原性肽化学偶联至αDEC-205。我们证明了在体外与CD11c⁺细胞的有效结合以及体内细胞和体液免疫的有效诱导 。

当然，这种方法存在缺点，例如批次间可比性以及最终偶联物中抗原的精确剂量。然而，与基因工程构建体相比，化学偶联在选择抗体和蛋白质抗原方面提供了实验灵活性。因此，我们认为这种方法在评估临床前小鼠模型中不同抗原在DC靶向中的效率方面特别有价值，重要的是在特定的抗肿瘤免疫反应的背景下也是如此。

研究方案

所有描述的动物实验都得到了当地政府机构的批准（Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit;文件编号33.12-42502-04-10/0108），并根据国家和机构指南进行。

1. 从杂交瘤细胞系NLDC-145生产αDEC-205

1. 对于抗体生产，在37°C的水浴中解冻冷冻保存的NLDC-145细胞产生αDEC-205。在37°C和5%CO下扩增细胞₂.两个 75 厘米² 需要瓶子才能进行抗体生产。细胞培养程序应在安全柜中进行，以确保安全的工作条件并防止培养物污染。
   1. 将1mL解冻细胞（1 x 10⁶ - 5 x 10⁶个细胞/ mL）重悬于9mL补充有1%青霉素/链霉素（预温至37°C）的ISF-1培养基中，放入细胞培养瓶（25cm^2）中。将烧瓶水平置于37°C，5%CO₂的细胞培养箱中。
   2. 将细胞在37°C和5%CO₂下培养，直到70%汇合。这通常应在24 - 48小时后实现。
   3. 一旦细胞汇合70%，使用移液器控制器将完整的NLDC-145细胞悬浮液（10mL）转移到15 mL锥形离心管中，移液器的体积范围为1-10 mL。通过在室温下以250×g离心10分钟来沉淀细胞。
   4. 在水浴中预热ISF-1培养基至37°C，并将沉淀重悬于12mL补充有1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基中。将重悬的细胞悬浮液转移到新鲜的细胞培养瓶（75cm^2）中。
   5. 在37°C和5%CO₂下在补充有1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基中培养和扩增细胞，直到70%汇合和99%活。这通常应在48 - 72小时后实现。
   6. 将细胞分成两个75 cm² 烧瓶。为此，首先用细胞悬浮液冲洗细胞培养瓶底部/培养表面，以从表面除去所有NLDC-145细胞。将6 mL的NLDC-145细胞悬浮液分别转移到两个新鲜的75 cm² 瓶中的一个中，并加入补充有1%青霉素/链霉素的预热ISF-1培养基，最高可达12mL。
      注意:不要更新细胞培养基，因为NLDC-145细胞将调节培养基。将细胞与其培养基一起转移，并用新鲜培养基将培养物填充至所需体积。这对于NLDC-145细胞的生存能力和最大抗体产生至关重要。
   7. 在37°C和5%CO₂下扩增细胞培养物，直到约70%汇合，通常在48-72小时后达到。
   8. 一旦细胞汇合70%，将10mL的膨胀NLDC-145细胞悬浮液从75 cm² 瓶中的每一个转移到一个PETG（聚对苯二甲酸乙二醇酯）滚筒瓶（1，050cm^2）中。为此，用细胞悬浮液冲洗细胞培养瓶底部/培养表面，使用移液器控制器和10 mL移液器从表面除去所有细胞。
   9. 将140 mL补充有1%青霉素/链霉素（预热至37°C）的ISF-1培养基直接从培养基瓶中加入到每个含有滚筒瓶的NLDC-145中，填充它们至150 mL标记。
      注意:请参阅步骤 1.1.6 中的注释。
   10. 将滚瓶在37°C，5%CO_2和25 轮/分钟下培养三天。
   11. 向每个含有滚筒的NLDC-145中加入150毫升补充有1%青霉素/链霉素（预热至37°C）的ISF-1培养基，灌装至300毫升标记。
   12. 现在，在37°C，5%CO_2和25 轮/分钟下培养含有300 mL培养物的滚瓶再培养三天。
   13. 将另外100毫升补充有1%青霉素/链霉素（预温至37°C）的ISF-1培养基加入每个含有滚筒的NLDC-145中，从而将其填充至400毫升标记。
   14. 现在，在37°C，5%CO_2和25 轮/分钟下培养含有400 mL培养物的滚瓶再培养7天。
       注意:在本周，培养物变得非常密集（密度高达95%）并且存活率降低（低至50%），从而实现最大的抗体释放。
2. 为了从培养物上清液中纯化αDEC-205，将NLDC-145细胞悬浮液（来自两个辊瓶）直接倒入500 mL高压灭菌离心瓶中。
   注意:应收集总体积为800 mL的培养物。
   1. 在8，600×g和4°C下离心培养物30分钟以除去细胞和碎屑。
   2. 收集上清液，丢弃颗粒并将上清液汇集在无菌试剂瓶中。
      注意:αDEC-205的纯化可以立即开始（步骤2）或上清液可以在4°C下短期储存。

2. 从NLDC-145细胞上清液中纯化αDEC-205抗体

注意:从NLDC-145细胞上清液中，使用蛋白质G Sepharose柱（可重复使用）纯化αDEC-205。色谱柱尺寸为 15 mm x 74 mm，每色谱柱填充 5 mL 蛋白 G 琼脂糖。

1. 为了制备和洗涤蛋白质G琼脂糖柱，在蛋白G琼脂糖柱的上开口处放置一个气密的橡胶塞。用两个无菌插管（20 G x 1 1/2"，0.90 x 40 mm）刺穿橡胶塞。
   1. 将 10 mL 注射器连接到两个插管之一，并将一个柔性硅管（长约 100 cm，直径 2.5 - 3 mm）连接到第二个套管。
      注意:注射器/橡胶塞结构可重复使用，并提供真空，导致大量培养物上清液连续流向蛋白G琼脂糖柱。为此，在以下步骤中，稍微拉回注射器的柱塞，以确保连续的流体流动。
   2. 用50 mL的0.1M冰醋酸（pH 2）洗涤色谱柱，以从任何先前的抗体纯化中除去潜在的残留抗体。将硅管的末端放入0.1M冰醋酸（pH 2）填充的试剂瓶中。作为诱导真空的结果，50 mL的0.1M冰醋酸（pH 2）滴落穿过蛋白G Sepharose柱。
      注意:0.1 M冰醋酸（pH 2）应储存在试剂瓶中或新鲜填充在烧杯中。
   3. 用100-200 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤色谱柱。将硅管的末端放入PBS填充的试剂瓶或烧杯中。让 100-200 mL PBS 通过蛋白 G 琼脂糖柱滴动。
2. 为了从NLDC-145上清液中纯化抗体，将800mL的NLDC-145上清液（从步骤1.2.2获得）加载到色谱柱上。将硅管的末端放入NLDC-145上清液填充的试剂瓶中。让 800 mL NLDC-145 上清液通过色谱柱滴流。
   1. 用500 mL PBS洗涤色谱柱。将硅管的末端放入PBS填充的试剂瓶或烧杯中。让 500 mL PBS 在色谱柱中滴动。
   2. 对于洗脱，使用20个1.5mL管和移液器100μL的1.5M Tris-HCl（pH 8.8）到每个1.5mL管中。从色谱柱上取下橡胶塞，将1 mL 0.1 M甘氨酸（pH 3）移液到蛋白G Sepharose柱的上腔室，以从色谱柱中洗脱抗体。将流出物直接收集在制备的1.5 mL管之一中洗脱液。
   3. 对所有20个试管（1.5 mL）重复洗脱步骤（2.2.2.2）。。
   4. 使用分光光度计测定280nm处所有洗脱级分（OD_280）的光密度，以鉴定含抗体的组分。
      注意:使用第一个洗脱部分作为空白。
   5. 汇集 OD_{280 大于 0.5} 的所有馏分（约 10 个馏分）。
   6. 将充满20%乙醇的蛋白质G Sepharose柱储存在4°C。
3. 使用分子量截止值（MWCO）为12 - 14 kDa的透析管在4°C下对1000 mL PBS（在2000 mL烧杯中）透析混合洗脱过夜。
   1. 将透析管切成20厘米的碎片。透析管在500-800 mL的10 mM EDTA（pH 7.5）中煮沸，使用热板在烧杯中煮沸30分钟以除去污染物。弃去10 mM EDTA（pH 7.5）溶液，并将透析管在去离子水中煮沸10分钟。
      注意:透析管可以直接使用，也可以储存在4°C的0.01%叠氮化钠（NaN_3）/H₂O溶液中，直到下次使用。
   2. 用适当的透析管闭合/单件式铰链夹合透析管的底部，并小心地将抗体洗脱液入透析管中。用第二个夹子关闭透析管的顶部。
   3. 将透析管的上部夹具固定在浮动支架上，将其与磁性搅拌棒一起放入PBS填充的烧杯中，然后将烧杯放在磁力搅拌器上。
   4. 透析在4°C下搅拌过夜。
4. 为了增加αDEC-205的浓度，将完整的透析液加载到具有10 kDa MWCO的离心浓缩器中。打开管道的一个夹子，小心地将整个透析液从透析管中移出到离心浓缩器（10 kDa MWCO）中。
   注:请勿用移液器吸头触摸浓缩器底部。
   1. 在693×g（2，000rpm）和4°C下离心30分钟。
   2. 将离心浓缩器与10mLPBS中充入，并在693×g（2，000rpm）和4°C下离心，直到剩余的抗体溶液的最终体积为1-1.5mL。
      注意:如有必要，请重复2.4.1的离心步骤。以调整到所需的量。
   3. 使用分光光度计，测定浓缩的αDEC-205溶液在280nm（OD_280）处的光密度。使用 PBS 作为空白。
   4. 使用以下公式计算αDEC-205的浓度:
      浓度 [毫克/毫升] = OD₂₈₀/1.4。
   5. 使用0.22μm注射器过滤装置过滤αDEC-205溶液。
      注意:从NLDC-145杂交瘤细胞上清液中纯化αDEC-205也可以通过FPLC（快速蛋白质液相色谱法）实现。纯化的αDEC-205可以在4°C或-18°C下储存以长期储存。

3. OVA与αDEC-205的化学偶联

注意:最佳化学偶联需要0.5mg OVA蛋白与2.5mg αDEC-205（1:5）的比例。然而，该比例可能因其他蛋白质和抗体而异，需要针对替代偶联物进行优化。通过与30mM TCEP-HCl孵育来还原OVA蛋白的二硫键，其暴露在步骤3.2中需要将巯基暴露于化学偶联到αDEC-205和240μlTCEP-HCl。两个步骤，TCEP诱导的OVA减少（步骤3.1.）和αDEC-205的磺基-SMCC活化（步骤3.2.），最好同时进行。

1. 新鲜制备125 mM TCEP-HCl溶液（pH 7.0）。称出所需量的TCEP-HCl，并将TCEP-HCl溶解在0.9 M Tris碱（pH 8.8）中。使用pH指示条测试125 mM TCEP-HCl溶液的pH值（应为中性），并用Tris碱（pH 8.8）调节pH值。
   1. 将200μL OVA蛋白溶液（含有0.5mg OVA）移入1.5mL无菌管中。使用移液管将240μl125mM TCEP-HCl和560μL无菌超纯水加入OVA蛋白中，最终浓度为0.5mg / mL OVA蛋白和30mM TCEP-HCl（OVA / TCEP-HCl）。
      注意:将2.5mg EndoGrade OVA（冻干）溶解在1mL PBS中，产生2.5mg / mL OVA溶液。
   2. 将得到的OVA/TCEP-HCl在室温下孵育1.5小时。
      注意:请勿延长此孵育步骤。
2. 为了激活αDEC-205进行缀合，将2mg磺基-SMCC溶解在100μL超纯水中。
   注:Sulfo-SMCC易受水解影响。因此，应迅速处理大量未溶解的磺酸-SMCC，或使用可用的2mg等分试样。
   1. 在PBS中稀释αDEC-205，使2.5mg包含在900μL中。
   2. 将2.5mg的αDEC-205（900μL体积;从步骤3.2.1获得）和100μL磺基-SMCC（从步骤3.2中获得）混合在1.5mL管中，得到总体积为1mL。
   3. 将αDEC-205 / sulfo-SMCC溶液在37°C和550rpm的加热块中孵育30分钟。
3. 在这些孵育之后，使用脱盐柱（MWCO 7 kDa;5 mL柱体积）立即从溶液中除去过量的磺基-SMCC和TCEP-HCl。
   1. 拧开色谱柱 （MWCO 7 kDa） 底部封口，松开瓶盖，将色谱柱放入 15 mL 锥形管中。
   2. 在室温下以1，000×g离心2分钟以除去液体。
   3. 将色谱柱放入新管中，取下盖子。将抗体/磺基-SMCC和OVA/TCEP-HCl分别缓慢上样到一个色谱柱的致密树脂床的中心。
   4. 在室温下以1，000×g离心2分钟。
   5. 使用后丢弃列。含有抗体和OVA的溶液在管中，这些溶液为偶联而准备。
   6. 通过移液立即混合两种溶液以偶联αDEC-205和OVA。
   7. 将所得的αDEC-205和OVA混合物在4°C下孵育过夜。
4. 偶联后，从溶液中除去多余的未结合OVA，并使用离心蛋白浓缩器（MWCO 150 kDa）浓缩偶联的αDEC-205 / OVA。
   1. 通过在色谱柱上移液12mL PBS并在室温下以2，000×g离心2分钟来预冲洗离心蛋白质浓缩器（MWCO 150 kDa）。
      注意:如有必要，重复离心步骤（3.4.1.），直到约5mL的体积通过色谱柱。
   2. 在将αDEC-205 / OVA上样到离心蛋白浓缩器之前，保存20μL未浓缩的αDEC-205 / OVA样品以进行蛋白质印迹分析。将此等分试样储存在4°C直至分析。
   3. 通过移液将αDEC-205 / OVA加载到离心蛋白质浓缩器上。
      注:避免与离心浓缩器上腔室的床层接触。
   4. 用PBS填充浓缩器至15 mL，并在室温下以2，000×g离心浓缩器5分钟。
   5. 保存流出（流出I）样品以进行蛋白质印迹分析，并丢弃剩余的流出物。
   6. 用PBS填充浓缩器至10 mL，并在室温下以2，000×g离心浓缩器至少8分钟。
   7. 保存样品用于第二次流出（流出II）以进行蛋白质印迹分析，并丢弃剩余的流出物。
   8. 一旦达到所需的富集（应将约1.5mL的αDEC-205 / OVA溶液留在上腔室中），轻轻地吸出浓缩样品。
      注意:如果上腔室中残留过多的液体，可以重复离心，但应尽可能短地保持离心。
5. 使用微量分光光度计测定所得αDEC-205/OVA的蛋白质浓度。使用 PBS 作为空白。
6. 使用 0.22 μm 注射器过滤装置过滤 αDEC-205/OVA。
   注意:对于以后的分析和 体内 实验，αDEC-205 / OVA可以储存在4°C或-18°C。

4. 通过蛋白质印迹验证化学偶联

注:为了验证成功的化学偶联，进行蛋白质印迹分析，检测OVA（4.2）或αDEC-205（4.10）。OVA （4.2.） 或 αDEC-205 （4.10.） 的检测应并行进行。轨道平台振荡器最好用于蛋白质印迹膜的所有孵育步骤，以允许相应溶液的均匀分布。

1. 为SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠凝胶电泳）制备标准的10%SDS（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳） 凝胶。
2. 为SDS-PAGE准备样品以检测偶联和非共轭OVA并进行凝胶电泳。
   1. 稀释不同量的偶联αDEC-205/OVA（例如，200、100和50ng）、纯OVA（例如，80、70、60、50、40和30 ng）、一等分试样一等试样（例如，100和50 ng）、步骤3.4.2中的未浓缩αDEC-205/OVA偶联物样品。（例如，125 ng）和等分试样流经I和II（步骤3.4.5.和3.4.7.，分别;可选）在4 x非还原性SDS样品缓冲液中。
      注意:加载不同浓度的偶联物和蛋白质，以确保在同一印迹上可以检测到游离OVA和偶联物。
   2. 在加热块中，样品在65°C下变性10分钟和550rpm。
3. 将样品和蛋白质标准品上样到SDS凝胶中并运行SDS-PAGE。
4. 将蛋白质从SDS凝胶到甲醇活化PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（75分钟，125mA）进行标准印迹。
5. 转印后，将膜放入适当的培养皿中，并通过将25mL4%代餐奶昔粉/ TBS-T（Tris缓冲盐水/ 0.1%吐温20）封闭缓冲液移入含有膜的培养皿中来阻断膜。
   1. 将膜在室温下在封闭溶液中孵育60分钟或在4°C下过夜。
6. 丢弃封闭溶液，通过将15mL一抗溶液移液到培养皿中的膜中，在2%代餐奶昔粉/ TBS-T抗体缓冲液（稀释1:3，000）中用兔αOVA一抗染色膜。
   1. 在室温下孵育膜45分钟或在4°C下过夜（使用平台振荡器）。
7. 丢弃抗体溶液并在培养皿中洗涤膜（使用平台振荡器）。
   1. 向膜中加入25 mL TBS-T，孵育5分钟。丢弃解决方案。
   2. 向膜中加入25 mL TBS-T/0.5 M NaCl，孵育5分钟。丢弃解决方案。
   3. 向膜中加入25 mL TBS-T / 0.5%Triton X-100，孵育5分钟。丢弃解决方案。
   4. 向膜中加入25 mL TBS-T，孵育5分钟。丢弃解决方案。
8. 将15mL二抗溶液移液到培养皿中的膜上，在2%代餐奶昔粉/ TBS-T抗体缓冲液（稀释1:2，000）中用山羊αrabbit-IgG-HRPO（马萝卜过氧化物酶）二抗染色膜。
   1. 在室温下孵育膜45分钟或在4°C（在平台振荡器上）过夜。
9. 再次按照步骤4.7.1.- 4.7.4中所述洗涤膜。使用平台振动器。对于该膜，接下来继续执行步骤4.16。（以下步骤 4.10.- 4.15。（αDEC-205的检测）可以与步骤4.2.- 4.9并行执行）。
10. 准备用于检测SDS-PAGE的αDEC-205的样品并运行凝胶电泳。
    1. 稀释不同量的αDEC-205/OVA（例如，200、100和50 ng）、未共轭的αDEC-205（例如，250，125，62.5 ng）、纯OVA（例如，80和70ng）、步骤3.4.2中的未浓缩αDEC-205/OVA样品。（例如，125 ng）和等分试样流经I和II（步骤3.4.5.和3.4.7.，分别;可选）在4 x非还原性SDS样品缓冲液中。
    2. 在加热块中，样品在65°C下变性10分钟和550rpm。
11. 将样品和蛋白质标准品上样到SDS凝胶中并进行凝胶电泳。
12. 将蛋白质从SDS凝胶到甲醇活化PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（75分钟，125mA）进行标准印迹。
13. 转印后，将膜放入适当的培养皿中，通过将25mL的10%封闭缓冲液（奶粉/ TBS-T）移液到含有膜的培养皿中来阻断膜。
    注意:阻断溶液在 αDEC-205 和 OVA 检测之间有所不同（步骤 4.5）。
    1. 将膜在室温下在封闭溶液中孵育60分钟或在4°C下过夜（使用平台振荡器）。
14. 弃去封闭溶液，通过将15mL抗体溶液移液至培养皿中的膜，在5%奶粉/ TBS-T抗体缓冲液（稀释1:5，000）中用山羊αrat-IgG（H + L）-HRPO抗体染色膜。
    注意:αDEC-205检测和OVA检测之间的抗体缓冲液不同（步骤4.6./ 4.8.）。
    1. 在室温下孵育膜45分钟或在4°C下过夜（使用平台振荡器）。
15. 按照步骤4.7.1.- 4.7.4中所述在培养皿中彻底清洗膜。（使用平台摇床）。
16. 使用适当的检测试剂来产生HRP信号，并使用X射线胶片或通过成像系统在黑暗的房间中检测化学发光。

5. 通过酶联免疫吸附法验证化学偶联

1. 执行 ELISA 以进一步验证成功导致 αDEC-205/OVA 的化学偶联。
2. 在包衣缓冲液中用100μL/孔3 ng/μL兔αOVA抗体包衣适当的96孔ELISA板（0.1M碳酸氢钠（NaHCO_3）pH9.6稀释在H₂O中）。
   1. 将板在4°C孵育过夜。
3. 涂覆后，用PBS洗涤板三次，例如，使用ELISA垫圈。
4. 通过在板的每个孔中移液200μL封闭缓冲液（PBS中的10%FCS）来阻断板，并在室温下孵育板30分钟。
5. 在封闭缓冲液中以1:2（PBS中的10%食品接触物质）连续稀释αDEC-205 / OVA（从步骤3.6获得），以获得从6μg/ mL到93.8ng / mL αDEC-205 / OVA的稀释度，并将这些减少量的αDEC-205 / OVA中的100μL /孔加入孔中。
   1. 在室温下孵育板1小时。
6. 用PBS清洗板三次，例如，使用ELISA清洗机。
7. 向板的每个孔中加入100μL山羊αrat-IgG + IgM（H + L）-HRPO抗体（在封闭缓冲液中稀释至1:2，000（PBS中为10%FCS））。
   1. 在室温下孵育1小时。
8. 使用PBS洗涤板三次，例如使用ELISA垫圈。
9. 向孔中加入50μLHRPO底物。当观察到清晰的颜色反应时，通过每孔加入150μl停止溶液（1M H₂SO_4）来停止反应。
10. 5分钟后，使用ELISA读数器读取450nm处的吸收。

结果

使用该协议将αDEC-205与OVA蛋白的化学偶联通常允许有效地生成αDEC-205 / OVA用于体内DC靶向方法。有不同的策略来验证技术本身并测试所产生共轭物的功能。蛋白质印迹分析和ELISA用于验证成功的偶联，同时检测可能留下的游离OVA（图2）。体外结合研究（图3）和体内免疫（图4）证实了偶...

讨论

内吞作用受体特异性抗体和蛋白质抗原的化学偶联为临床前小鼠模型 中的体内 DC靶向提供了一种有效且重要的灵活方法。通过我们的方案，我们为模型抗原OVA与DEC-205特异性IgG抗体的成功偶联提供了一种有效的方法。

在我们的方案中，αDEC-205是从杂交瘤细胞系中纯化的，过去，我们已经使用如上所述的蛋白G琼脂糖纯化了抗体。值得注意的是，在后来的研究中，我们还?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
antibody buffer 2 %			2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %			5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)			10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %			4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %			10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25	Greiner Bio-One	690175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75	Greiner Bio-One	658175	we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)
cell culture flask T175	Greiner Bio-One	661175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	88532	Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available
centrifuge bottles	Nalgene	525-2314	PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)			0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	89891	Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)	Roche/Merck	12 015 200 01	Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa	SERVA Electrophoresis	44110	Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate	Thermo Fisher Scientific	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Good forte
ISF-1 medium	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
milk powder	Carl Roth	T145.2	powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma	ATCC	HB-290	if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x			for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin	Hyglos (via BioVendor)	321000	EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles	Nunc In Vitro	734-2394	standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany
pH indicator strips	Merck	109535	pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	112-035-062	obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	111-035-045	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)	Abcam	ab181688	used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)	OriGene	R1101	used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column	Merck/Millipore	P3296	5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane	Merck/Millipore	IPVH00010	immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug	Omnilab	5230217	DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast			we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)			1M H2SO4
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
syringe 10 ml	Omnilab		Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T			Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	A35349
tubing connector	Omnilab		Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube