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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per la coniugazione chimica dell'antigene modello ovalbumina ad un anticorpo specifico del recettore dell'endocitosi per il targeting delle cellule dendritiche in vivo. Il protocollo comprende la purificazione dell'anticorpo, la coniugazione chimica dell'antigene, nonché la purificazione del coniugato e la verifica di una coniugazione efficiente.

Abstract

La somministrazione mirata di antigene a cellule dendritiche a presentazione incrociata (DC) in vivo induce in modo efficiente le risposte delle cellule effettrici T e mostra un approccio prezioso nella progettazione del vaccino. L'antigene viene consegnato a DC tramite anticorpi specifici per i recettori dell'endocitosi come DEC-205 che inducono l'assorbimento, l'elaborazione e la presentazione di MHC di classe I e II.

La coniugazione efficiente e affidabile dell'antigene desiderato con un anticorpo adatto è un passo critico nel targeting DC e tra gli altri fattori dipende dal formato dell'antigene. La coniugazione chimica di proteine a lunghezza intera in anticorpi purificati è una possibile strategia. In passato, abbiamo stabilito con successo il cross-linking dell'antigene modello ovalbumina (OVA) e di un anticorpo IgG2a specifico dec-205 (αDEC-205) per studi di targeting DC in vivo nei topi. Il primo passo del protocollo è la purificazione dell'anticorpo dal surnatante dell'ibridoma DENDRITICO NLDC (cellule dendritiche non linfoidi)-145 mediante cromatografia di affinità. L'anticorpo purificato viene attivato per la coniugazione chimica dal sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) mentre allo stesso tempo i gruppi sulfidrilici della proteina OAV sono esposti attraverso l'incubazione con TCEP-HCl (tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato). L'eccesso di TCEP-HCl e sulfo-SMCC viene rimosso e l'antigene viene miscelato con l'anticorpo attivato per l'accoppiamento notturno. Il coniugato αDEC-205/OVA risultante viene concentrato e liberato da OAV non legati. Il successo della coniugazione dell'OAV in αDEC-205 è verificato mediante l'analisi western blot e il saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA).

Abbiamo utilizzato con successo αDEC-205/OVA reticolato chimicamente per indurre risposte citotossiche delle cellule T nel fegato e per confrontare diversi adiuvanti per il loro potenziale nell'indurre l'immunità umorale e cellulare a seguito del targeting in vivo di DEC-205+ DC. Oltre a ciò, tali coniugati anticorpo/antigene accoppiati chimicamente offrono strumenti preziosi per l'induzione efficiente delle risposte vaccinali agli antigeni tumorali e hanno dimostrato di essere superiori agli approcci di immunizzazione classici per quanto riguarda la prevenzione e la terapia di vari tipi di tumori.

Introduzione

Le cellule dendritiche (DC) sono attori centrali del sistema immunitario. Sono un gruppo eterogeneo di cellule specializzate nella presentazione dell'antigene e la loro funzione principale è quella di colmare l'immunità innata e adattativa1,2. È importante sottolineare che i DC non solo svolgono un ruolo importante in risposte efficienti e specifiche dirette ai patogeni, ma sono anche coinvolti in molti aspetti dell'immunità antitumorale1,3.

A causa del loro ruolo esclusivo nell'immunità dell'ospite, dc è venuto a fuoco come cellule bersaglio per la vaccinazione4. Un approccio è quello di indirizzare gli antigeni a DC in vivo per indurre risposte immunitarie antigene-specifiche e negli ultimi anni, un gran numero di studi sono stati dedicati alla definizione di recettori adatti e strategie di targeting1,4. Un esempio è il recettore della lectina di tipo C DEC-205, che può essere preso di mira da anticorpi specifici DEC-205 per indurre l'endocitosi. È importante sottolineare che il targeting DEC-205 in combinazione con adiuvanti adatti ha dimostrato di indurre in modo efficiente cellule T CD4+ e CD8+ di lunga durata e protettive, nonché risposte anticorpali, anche contro gli antigeni tumorali3,5,6,7,8,9.

Ci sono un certo numero di studi che dimostrano che gli antigeni coniugati mirati alla DC sono superiori all'antigene libero non coniugato3,5,10,11,12. Ciò rende la coniugazione dell'antigene alla rispettiva porzione di targeting DC un passo centrale negli approcci di targeting DC. Nel caso del targeting DC tramite anticorpi o frammenti di anticorpi, gli antigeni possono essere collegati chimicamente o geneticamente e entrambe le strategie forniscono i propri (dis)vantaggi1. Da un lato, nei costrutti anticorpo-antigene geneticamente modificati esiste un controllo sulla dose di antigene e sulla posizione che fornisce una comparabilità superiore tra i lotti1. Allo stesso tempo, tuttavia, la coniugazione chimica richiede meno preparazione e fornisce maggiore flessibilità soprattutto quando si tenta di testare e confrontare diversi antigeni e / o strategie di vaccinazione in modelli sperimentali e pre-clinici.

Qui, presentiamo un protocollo per la coniugazione chimica efficiente e affidabile dell'ovalbumina (OVA) come antigene proteico modello a un anticorpo IgG2a specifico dec-205 (αDEC-205) adatto per il targeting DC in vivo nei topi. Innanzitutto, αDEC-205 viene purificato dalle cellule di ibridoma NLDC-14513. Per la coniugazione chimica, viene utilizzato il reticolante eterobifunzionale sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), che contiene estere NHS (N-idrossisuccinimide) e gruppi maleimmidi, consentendo la coniugazione covalente di molecole contenenti ammine e sulfidril. In particolare, le ammine primarie dell'anticorpo reagiscono inizialmente con sulfo-SMCC e il risultante αDEC-205 attivato dalla maleimmide reagisce quindi con la proteina OAV contenente sulfidrile ridotta attraverso TCEP-HCl (Tris(2-carbossietil) fosfina cloridrato). Il prodotto finale è αDEC-205/OVA coniugato chimicamente (Figura 1). Oltre alla coniugazione chimica stessa, il nostro protocollo descrive la rimozione dell'OVA in eccesso dal coniugato e la verifica del successo della coniugazione attraverso l'analisi western blot e uno specifico test immunoassorbente enzimatico. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio in passato per coniugare chimicamente l'OVA e altre proteine o peptidi immunogenici ad αDEC-205. Dimostriamo un legame efficiente alle cellule CD11c+ in vitro e l'induzione efficiente dell'immunità cellulare e umorale in vivo.

Certamente, ci sono degli svantaggi in questo metodo, come nella comparabilità da lotto a lotto e nel dosaggio esatto dell'antigene all'interno del coniugato finale. Tuttavia, la coniugazione chimica fornisce flessibilità sperimentale nella scelta dell'anticorpo e dell'antigene proteico rispetto ai costrutti geneticamente modificati. Pertanto, riteniamo che questo approccio sia particolarmente prezioso nella valutazione di diversi antigeni per la loro efficienza nel targeting DC in modelli murini pre-clinici, soprattutto anche nel contesto di specifiche risposte immunitarie antitumorali.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'agenzia governativa locale (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; numero di file 33.12-42502-04-10/0108) e sono stati eseguiti secondo le linee guida nazionali e istituzionali.

1. Produzione di αDEC-205 dalla linea cellulare di ibridoma NLDC-145

  1. Per la produzione di anticorpi, scongelare le cellule NLDC-145 crioconservate producendo αDEC-205 a 37 °C a bagnomaria. Espandere le celle a 37 °C e 5% di CO2. Due 75 cm2 saranno necessari flaconi per procedere alla produzione di anticorpi. Le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in un armadio di sicurezza per garantire condizioni di lavoro sicure e prevenire la contaminazione delle colture.
    1. Sospendere 1 mL di cellule scongelate (1 x 10 6 -5 x 106 cellule/mL) in 9 mL di isf-1 mezzo integrato con l'1% di penicillina/streptomicina (preriscaldato a 37 °C) in un matraccio di coltura cellulare (25 cm2). Posizionare il matraccio orizzontalmente in un incubatore di colture cellulari a 37 °C, 5% CO2.
    2. Coltivare le cellule a 37 °C e 5% CO2, fino al 70% di confluenza. Questo dovrebbe normalmente essere raggiunto dopo 24 - 48 ore.
    3. Una volta che le celle sono confluenti al 70%, trasferire la sospensione completa della cella NLDC-145 (10 mL) in un tubo centrifugo conico da 15 mL utilizzando un controller pipetta con una pipetta in un intervallo di volume da 1-10 ml. Pellet le celle per centrifugazione a 250 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Preriscaldare ISF-1 medio a 37 °C a bagnomaria e risospesciare il pellet in 12 mL di ISF-1 medium integrato con l'1% di penicillina/streptomicina. Trasferire la sospensione cellulare risospesa in un pallone di coltura cellulare fresco (75 cm2).
    5. Coltura ed espansione delle cellule in mezzo ISF-1 integrato con 1% di penicillina/streptomicina a 37 °C e 5% di CO2,fino al 70% confluente e vitale al 99%. Questo dovrebbe normalmente essere raggiunto dopo 48 - 72 ore.
    6. Dividere le celle in due fiaschi da 75 cm2. Per fare questo prima lavare il fondo / superficie di coltura del pallone di coltura cellulare con la sospensione cellulare per rimuovere tutte le cellule NLDC-145 dalla superficie. Trasferire 6 mL della sospensione cellulare NLDC-145 ciascuna in una delle due bottiglie fresche da 75 cm2 e aggiungere un mezzo ISF-1 preriscaldato integrato con penicillina/streptomicina all'1% fino a 12 ml.
      NOTA: non rinnovare il terreno di coltura cellulare poiché le cellule NLDC-145 avranno condizionato il mezzo. Trasferire le cellule insieme al loro mezzo e riempire la coltura fino al volume desiderato con terreno fresco. Questo è fondamentale per la vitalità e la massima produzione di anticorpi da parte delle cellule NLDC-145.
    7. Espandere le colture cellulari a 37 °C e 5% CO2, fino a circa il 70% di confluente che si ottiene generalmente dopo 48 - 72 h.
    8. Una volta che le cellule sono confluenti al 70%, trasferire 10 mL della sospensione cellulare NLDC-145 espansa da ciascuna delle bottiglie da 75 cm2 in una bottiglia a rullo in PETG (polietilene tereftalato glicole) (1.050 cm2). Per questo, lavare il fondo / superficie di coltura del pallone di coltura cellulare con la sospensione cellulare per rimuovere tutte le celle dalla superficie utilizzando un controller di pipetta e una pipetta da 10 ml.
    9. Aggiungere 140 mL di ISF-1 medium integrato con l'1% di penicillina/streptomicina (preriscaldato a 37 °C) direttamente dal flacone medio a ciascuno dei flaconi a rulli contenenti NLDC-145 riempiendoli fino al segno di 150 mL.
      NOTA: vedere la nota al passaggio 1.1.6.
    10. Coltivare le bottiglie a rulli a 37 °C, 5% CO2 e 25 giri/min per tre giorni.
    11. Aggiungere 150 mL di ISF-1 medium integrato con l'1% di penicillina/streptomicina (preriscaldato a 37 °C) a ciascuno dei flaconi a rulli contenenti NLDC-145 riempiendoli fino al segno di 300 ml.
    12. Coltivate le bottiglie a rulli contenenti ora 300 mL di coltura ciascuna a 37 °C, 5% DI CO2 e 25 giri/min per altri tre giorni.
    13. Aggiungere altri 100 mL di ISF-1 medium integrato con l'1% di penicillina/streptomicina (preriscaldato a 37 °C) a ciascuno dei flaconi a rulli contenenti NLDC-145, riempiendoli così fino al segno di 400 ml.
    14. Coltivare le bottiglie a rulli contenenti ora 400 ml di coltura ciascuna a 37 °C, 5% DI CO2 e 25 giri/min per altri sette giorni.
      NOTA: Durante questa settimana, la coltura diventa molto densa (fino al 95% di densità) e la vitalità diminuisce (fino a un minimo del 50%), consentendo il massimo rilascio di anticorpi.
  2. Per la purificazione di αDEC-205 dal surnatante di coltura versare la sospensione cellulare NLDC-145 (da entrambe le bottiglie a rulli) direttamente a bottiglie di centrifugazione autoclavate da 500 mL.
    NOTA: deve essere raccolto un volume totale di 800 ml di coltura.
    1. Centrifugare la coltura per 30 minuti a 8.600 x g e 4 °C per rimuovere cellule e detriti.
    2. Raccogliere i supernatanti, scartando i pellet e raggruppando i supernatanti in una bottiglia di reagente sterile.
      NOTA: La purificazione di αDEC-205 può essere iniziata immediatamente (fase 2.) oppure il surnatante può essere conservato a breve termine a 4 °C.

2. Purificazione dell'anticorpo αDEC-205 dal surnatante cellulare NLDC-145

NOTA: Dal surnatante cellulare NLDC-145, αDEC-205 viene purificato utilizzando una colonna di sefarosio della proteina G (riutilizzabile). Le dimensioni della colonna sono 15 mm x 74 mm e 5 mL di proteina G Sepharose sono confezionati per colonna.

  1. Per la preparazione e il lavaggio della colonna di sefarosio G della proteina, mettere un tappo di gomma ermetico sull'apertura superiore della colonna di sefarosio G della proteina. Forare il tappo di gomma con due cannule sterili (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
    1. Collegare una siringa da 10 ml a una delle due cannule e un tubo di silicio flessibile (circa 100 cm di lunghezza, 2,5 - 3 mm di diametro) con un connettore per tubi alla seconda cannula.
      NOTA: La costruzione della siringa/tappo di gomma è riutilizzabile e fornisce un vuoto risultante in un flusso continuo del grande volume di coltura surnatante alla colonna di sefarosio della proteina G. A tal fine, tirare leggermente indietro lo stantuffo della siringa per garantire un flusso continuo del fluido nei passaggi seguenti.
    2. Lavare la colonna con 50 mL di acido acetico glaciale 0,1 M (pH 2) per rimuovere l'anticorpo potenzialmente rimanente da qualsiasi precedente purificazione anticorpale. Mettere l'estremità del tubo di silicio nel flacone di reagente riempito di acido acetico glaciale da 0,1 M (pH 2). Come risultato del vuoto indotto, 50 mL dell'acido acetico glaciale 0,1 M (pH 2) scorrono a goccia attraverso la colonna di sefarosio della proteina G.
      NOTA: l'acido acetico glaciale 0,1 M (pH 2) deve essere conservato in un flacone di reagente o appena riempito in un becher.
    3. Lavare la colonna con 100-200 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mettere l'estremità del tubo di silicio in un flacone di reagente riempito pbS o in un becher. Lasciare che 100-200 mL di PBS scorrano a goccia attraverso la colonna di sefarosio della proteina G.
  2. Per la purificazione degli anticorpi dal surnatante NLDC-145, caricare 800 mL del surnatante NLDC-145 (ottenuto dal punto 1.2.2.) sulla colonna. Inserire l'estremità del tubo di silicio nel flacone di reagente riempito con surnatante NLDC-145. Lascia che 800 mL NLDC-145 surnatante scorrano a goccia attraverso la colonna.
    1. Lavare la colonna con 500 ml di PBS. Mettere l'estremità del tubo di silicio in un flacone di reagente riempito pbS o in un becher. Lascia che 500 mL PBS scorrano a goccia attraverso la colonna.
    2. Per l'eluizione, utilizzare 20 tubi da 1,5 mL e una pipetta da 100 μL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) in ciascun tubo da 1,5 mL. Rimuovere il tappo di gomma dalla colonna e dalla pipetta 1 mL di glicina 0,1 M (pH 3) nella camera superiore della colonna di sefarosio della proteina G per eluire l'anticorpo dalla colonna. Raccogliere il flusso passante direttamente come eluato in uno dei tubi da 1,5 ml preparati.
    3. Ripetere la fase di eluizione (2.2.2.) per tutti i 20 tubi (1,5 ml).
    4. Determinare la densità ottica di tutte le frazioni di eluizione a 280 nm (OD280) utilizzando uno spettrofotometro per identificare le frazioni contenenti anticorpi.
      NOTA: utilizzare la prima frazione di eluizione come vuota.
    5. Raggruppare tutte le frazioni con un OD280 maggiore di 0,5 (circa 10 frazioni).
    6. Conservare la colonna di sefarosio della proteina G riempita con etanolo al 20% a 4 °C.
  3. Dializzare le eluizioni raggruppate contro 1000 mL PBS (in un becher da 2000 mL) a 4 °C durante la notte utilizzando tubi di dialisi con un peso molecolare tagliato (MWCO) di 12 - 14 kDa.
    1. Tagliare il tubo di dialisi in pezzi di 20 cm. Far bollire il tubo di dialisi in 500-800 ml di EDTA da 10 mM (pH 7,5) per 30 minuti in un becher usando una piastra calda per rimuovere la contaminazione. Scartare la soluzione di EDTA da 10 mM (pH 7,5) e far bollire il tubo di dialisi in acqua deionizzata per 10 minuti.
      NOTA: Il tubo di dialisi può essere utilizzato direttamente o conservato in soluzione di azide di sodio allo 0,01% (NaN3)/H2O a 4 °C fino al successivo utilizzo.
    2. Chiudere il fondo del tubo di dialisi con un'appropriata chiusura del tubo di dialisi / monopezzo, morsetto incernierato e pipettare con cura l'eluizione anticorpale nel tubo di dialisi. Chiudere la parte superiore del tubo di dialisi con un secondo morsetto.
    3. Fissare il morsetto superiore del tubo di dialisi a un supporto galleggiante, metterlo insieme a una barra di agitazione magnetica nel becher riempito pbS e posizionare il becher su un agitatore magnetico.
    4. Dializzare durante la notte mescolando a 4 °C.
  4. Per aumentare la concentrazione di αDEC-205, caricare il dialisto completo su un concentratore centrifugo con 10 kDa MWCO. Aprire un morsetto del tubo e pipettare con cura il dializzato completo dal tubo di dialisi nel concentratore centrifugo (10 kDa MWCO).
    NOTA: non toccare il fondo del concentratore con la punta della pipetta.
    1. Centrifuga per 30 min a 693 x g (2.000 giri/min) e 4 °C.
    2. Caricare il concentratore centrifugo con 10 mL di PBS e centrifugare a 693 x g (2.000 giri/min) e 4 °C fino a quando il volume finale di soluzione anticorpale rimasta è 1-1,5 ml.
      NOTA: Se necessario, ripetere la fase di centrifugazione di cui al punto 2.4.1. per adattarsi alla quantità desiderata.
    3. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la densità ottica della soluzione concentrata di αDEC-205 a 280 nm (OD280). Utilizzare PBS come vuoto.
    4. Calcolare la concentrazione di αDEC-205 utilizzando la seguente formula:
      concentrazione [mg/mL] = OD280/1.4.
    5. Filtrare la soluzione di αDEC-205 utilizzando un'unità filtrante a siringa da 0,22 μm.
      NOTA: La purificazione di αDEC-205 dal surnatante delle cellule di ibridoma NLDC-145 può essere ottenuta anche mediante FPLC (cromatografia liquida proteica veloce). αDEC-205 purificato può essere conservato a 4 °C o a -18 °C per la conservazione a lungo termine.

3. Coniugazione chimica di OAV a αDEC-205

NOTA: per una coniugazione chimica ottimale è necessario un rapporto tra 0,5 mg di proteina OAV e 2,5 mg di αDEC-205 (1:5). Tuttavia, questo rapporto può variare per altre proteine e anticorpi e deve essere ottimizzato per coniugati alternativi. La riduzione dei legami disolfuro della proteina OAV viene eseguita attraverso l'incubazione con 30 mM TCEP-HCl, che espone i gruppi sulfidrilici per la coniugazione chimica a αDEC-205 e 240 μl di TCEP-HCl sono necessari nella fase 3.2. Entrambe le fasi, la riduzione indotta da TCEP dell'OAV (fase 3.1.) e l'attivazione sulfo-SMCC di αDEC-205 (fase 3.2.), devono preferibilmente essere eseguite in parallelo.

  1. Preparare al momento una soluzione TCEP-HCl da 125 mM (pH 7,0). Pesare la quantità desiderata di TCEP-HCl e sciogliere il TCEP-HCl in 0,9 M Tris base (pH 8,8). Utilizzare strisce indicatori di pH per testare il pH della soluzione TCEP-HCl da 125 mM (che deve essere neutra) e regolare il pH con la base Tris (pH 8,8).
    1. Pipettare una soluzione proteica OAV da 200 μL (contenente 0,5 mg di OAV) in un tubo sterile da 1,5 mL. Aggiungere 240 μl 125 mM TCEP-HCl e 560 μL di acqua ultrapura sterile alla proteina OAV utilizzando una pipetta per una concentrazione finale di 0,5 mg/mL di proteina OAV e 30 mM di TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      NOTA: 2,5 mg di OAV endogrado (liofilizzato) vengono sciolti in 1 mL di PBS con conseguente soluzione OAV da 2,5 mg/mL.
    2. Incubare l'OAV/TCEP-HCl risultante a temperatura ambiente per 1,5 ore.
      NOTA: non estendere questa fase di incubazione.
  2. Per attivare αDEC-205 per la coniugazione, sciogliere 2 mg di sulfo-SMCC in 100 μL di acqua ultrapura.
    NOTA: Sulfo-SMCC è suscettibile di idrolisi. Pertanto, maggiori quantità di sulfo-SMCC non disciolto devono essere maneggiate rapidamente o devono essere utilizzate aliquote disponibili da 2 mg.
    1. Diluire αDEC-205 in PBS in modo che 2,5 mg siano contenuti in 900 μL.
    2. Miscelare 2,5 mg di αDEC-205 (volume di 900 μL; ottenuto dal punto 3.2.1.) e 100 μL di sulfo-SMCC (ottenuto dal punto 3.2.) in un tubo da 1,5 mL, ottenendo un volume totale di 1 mL.
    3. Incubare la soluzione αDEC-205/sulfo-SMCC per 30 minuti a 37 °C e 550 giri/min in un blocco riscaldante.
  3. A seguito di queste incubazioni, l'eccesso di sulfo-SMCC e TCEP-HCl viene immediatamente rimosso dalle soluzioni utilizzando colonne di desalinizzazione (MWCO 7 kDa; volume di colonna di 5 mL).
    1. Togliere la chiusura inferiore delle colonne (MWCO 7 kDa), allentare il cappuccio e posizionare la colonna in un tubo conico da 15 ml.
    2. Centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g a temperatura ambiente per rimuovere il liquido.
    3. Posizionare la colonna in un tubo nuovo e rimuovere il cappuccio. Caricare lentamente l'anticorpo/sulfo-SMCC e l'OVA/TCEP-HCl, rispettivamente, al centro del letto di resina compatto di una colonna ciascuno.
    4. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
    5. Eliminare le colonne dopo l'uso. Le soluzioni contenenti anticorpi e OAV innescati per la coniugazione sono nei tubi.
    6. Miscelare immediatamente entrambe le soluzioni mediante pipettaggio per coniugazione di αDEC-205 e OVA.
    7. Incubare la miscela αDEC-205 e OVA risultante durante la notte a 4°C.
  4. Dopo la coniugazione, l'ovaio non legato in eccesso viene rimosso dalla soluzione e l'αDEC-205/OAV accoppiato viene concentrato utilizzando un concentratore di proteine centrifughe (MWCO 150 kDa).
    1. Pre-risciacquare il concentratore di proteine centrifughe (MWCO 150 kDa) mediante pipettaggio di 12 mL di PBS sulla colonna e centrifugazione per 2 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
      NOTA: Se necessario, ripetere la fase di centrifugazione (3.4.1.) fino a quando un volume di circa 5 ml non è passato attraverso la colonna.
    2. Prima di caricare l'αDEC-205/OVA sul concentratore di proteine centrifughe, salvare un campione di 20 μL dell'αDEC-205/OVA non concentrato per l'analisi western blot. Conservare questa aliquota a 4 °C fino all'analisi.
    3. Caricare l'αDEC-205/OVA sul concentratore di proteine centrifughe mediante pipettaggio.
      NOTA: Evitare qualsiasi contatto con il letto della camera superiore del concentratore centrifugo.
    4. Riempire il concentratore a 15 ml con PBS e centrifugare il concentratore per 5 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
    5. Salvare un campione del flow-through (flow-through I) per l'analisi western blot ed eliminare il flow-through rimanente.
    6. Riempire il concentratore a 10 ml con PBS e centrifugare il concentratore per almeno 8 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
    7. Salvare un campione per il secondo flow-through (flow-through II) per l'analisi western blot ed eliminare il flow-through rimanente.
    8. Una volta raggiunto l'arricchimento desiderato (circa 1,5 ml della soluzione αDEC-205/OVA devono essere lasciati nella camera superiore) aspirare delicatamente il campione concentrato.
      NOTA: Se nella camera superiore rimane troppo liquido, la centrifugazione può essere ripetuta ma deve essere mantenuta il più breve possibile.
  5. Determinare la concentrazione proteica dell'αDEC-205/OAV risultante utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Utilizzare PBS come vuoto.
  6. Filtrare l'αDEC-205/OVA utilizzando un'unità filtrante a siringa da 0,22 μm.
    NOTA: per analisi successive ed esperimenti in vivo, αDEC-205/OVA può essere conservato a 4 °C o -18 °C.

4. Verifica della coniugazione chimica mediante western blot

NOTA: per verificare il successo della coniugazione chimica, viene eseguita l'analisi western blot che rileva OVA (4.2) o αDEC-205 (4.10). Il rilevamento di OAV (4.2.) o αDEC-205 (4.10.) deve essere effettuato in parallelo. Uno shaker orbitale della piattaforma dovrebbe essere utilizzato preferibilmente per tutte le fasi di incubazione delle membrane western blot per consentire una distribuzione uniforme delle rispettive soluzioni.

  1. Preparare gel standard 10% SDS (sodio dodecil solfato) per SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio).
  2. Preparare i campioni per SDS-PAGE per rilevare OAV coniugati e non coniugati ed eseguire l'elettroforesi su gel.
    1. Diluire diverse quantità di αDEC-205/OAV accoppiato (ad esempio, 200, 100 e 50 ng), di OAV puro (ad esempio, 80, 70, 60, 50, 40 e 30 ng), un'aliquota di αDEC-205 non coniugato (ad esempio, 100 e 50 ng), un campione di αDEC-205/OAV non concentrato coniugato dal punto 3.4.2. (ad esempio, 125 ng) e un'aliquota di flusso attraverso I e II (rispettivamente i punti 3.4.5 e 3.4.7.; facoltativo) in 4 buffer di campioni SDS non riducenti.
      NOTA: Vengono caricate diverse concentrazioni di coniugato e proteine per garantire che sia l'OAV libero che il coniugato possano essere rilevati sulla stessa macchia.
    2. Denaturare i campioni a 65 °C per 10 min e 550 rpm in un blocco riscaldante.
  3. Caricare i campioni e uno standard proteico su un gel SDS ed eseguire SDS-PAGE.
  4. Eseguire il blotting standard delle proteine dal gel SDS a una membrana PVDF (polivinilidene difluoruro) attivata dal metanolo (75 min, 125 mA).
  5. Dopo il blotting, mettere la membrana in un piatto appropriato e bloccare la membrana pipettando 25 mL di 4% di frullato sostitutivo del pasto in polvere / TBS-T (soluzione salina tamponata Tris / 0,1% Tween 20) tampone bloccante nel piatto contenente la membrana.
    1. Incubare la membrana nella soluzione bloccante per 60 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
  6. Scartare la soluzione bloccante e macchiare la membrana con l'anticorpo primario αOVA di coniglio in polvere di frullato sostitutivo del pasto al 2%/tampone anticorpale TBS-T (diluizione 1:3.000) pipettando 15 ml di soluzione anticorpale primaria alla membrana nel piatto.
    1. Incubare la membrana per 45 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (utilizzare lo shaker della piattaforma).
  7. Scartare la soluzione anticorpale e lavare la membrana nel piatto (utilizzare lo shaker della piattaforma).
    1. Aggiungere 25 ml di TBS-T alla membrana e incubare per 5 minuti. Scartare la soluzione.
    2. Aggiungere 25 mL di TBS-T/0,5 M NaCl alla membrana e incubare per 5 min. Scartare la soluzione.
    3. Aggiungere 25 ml di TBS-T/0,5% Triton X-100 alla membrana e incubare per 5 minuti. Scartare la soluzione.
    4. Aggiungere 25 ml di TBS-T alla membrana e incubare per 5 minuti. Scartare la soluzione.
  8. Macchiare la membrana con l'anticorpo secondario αrabbit-IgG-HRPO (perossidasi di ravanello di cavallo) in polvere di brodo sostitutivo del pasto al 2% / tampone anticorpale TBS-T (diluizione 1:2.000) pipettando 15 mL di soluzione anticorpale secondaria alla membrana nel piatto.
    1. Incubare la membrana per 45 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (sullo shaker della piattaforma).
  9. Lavare nuovamente la membrana come descritto al punto 4.7.1.- 4.7.4. utilizzando lo shaker della piattaforma. Per questa membrana, proseguire con il passaggio 4.16. (i seguenti passaggi 4.10.- 4.15. (rilevamento di αDEC-205) può essere eseguito parallelamente ai passaggi 4.2.- 4.9.).
  10. Preparare i campioni per il rilevamento di αDEC-205 per SDS-PAGE ed eseguire l'elettroforesi su gel.
    1. Diluire diverse quantità di αDEC-205/OVA (ad esempio, 200, 100 e 50 ng), di αDEC-205 non coniugato (ad esempio, 250, 125, 62,5 ng), di OAV puro (ad esempio, 80 e 70 ng), un campione di αDEC-205/OVA non concentrato dal punto 3.4.2. (ad esempio, 125 ng) e un'aliquota di flusso attraverso I e II (rispettivamente i punti 3.4.5 e 3.4.7.; facoltativo) in 4 buffer di campioni SDS non riducenti.
    2. Denaturare i campioni a 65 °C per 10 min e 550 rpm in un blocco riscaldante.
  11. Caricare i campioni e uno standard proteico su un gel SDS ed eseguire l'elettroforesi su gel.
  12. Eseguire il blotting standard delle proteine dal gel SDS a una membrana PVDF (polivinilidene difluoruro) attivata dal metanolo (75 min, 125 mA).
  13. Dopo il blotting, mettere la membrana in un piatto appropriato e bloccare la membrana pipettando 25 mL di tampone bloccante al 10% (latte in polvere / TBS-T) nel piatto contenente la membrana.
    NOTA: le soluzioni di blocco differiscono tra il rilevamento αDEC-205 e OVA (passaggio 4.5.).
    1. Incubare la membrana nella soluzione bloccante per 60 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (utilizzando lo shaker della piattaforma).
  14. Scartare la soluzione bloccante e macchiare la membrana con l'anticorpo αrat-IgG(H+L)-HRPO di capra in tampone anticorpale latte in polvere/TBS-T al 5% (diluizione 1:5.000) pipettando 15 mL di soluzione anticorpale alla membrana nel piatto.
    NOTA: i tamponi anticorpali differiscono tra il rilevamento αDEC-205 e il rilevamento OVA (passaggi 4.6./ 4.8.).
    1. Incubare la membrana per 45 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (utilizzando lo shaker della piattaforma).
  15. Lavare accuratamente la membrana nella piastra come descritto nei passaggi 4.7.1.- 4.7.4. (utilizzare lo shaker della piattaforma).
  16. Utilizzare un reagente di rilevamento appropriato per sviluppare il segnale HRP e rilevare la chemiluminescenza in una stanza buia utilizzando una pellicola a raggi X o tramite un sistema di imaging.

5. Verifica della coniugazione chimica da parte di ELISA

  1. Eseguire ELISA per un'ulteriore verifica del successo della coniugazione chimica con conseguente αDEC-205/OVA.
  2. Rivestire un'appropriata piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 μL/pozzetto di anticorpo 3 ng/μL coniglio αOVA in tampone di rivestimento (0,1 M bicarbonato di sodio (NaHCO3) pH 9,6 diluito in H2O).
    1. Incubare la piastra durante la notte a 4 °C.
  3. Dopo il rivestimento, lavare la piastra tre volte con PBS, ad esempio utilizzando una rondella ELISA.
  4. Bloccare la piastra pipettando 200 μL di tampone di bloccaggio (10% FCS in PBS) in ciascun pozzetto della piastra e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Diluire serialmente αDEC-205/OVA (ottenuto dal passo 3.6.) 1:2 nel tampone di blocco (10% FCS in PBS) per ottenere diluizioni che vanno da 6 μg/mL fino a 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA e aggiungere 100 μL/pozzetto di queste quantità decrescenti di αDEC-205/OVA ai pozzi.
    1. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
  6. Lavare la piastra tre volte con PBS, ad esempio utilizzando una rondella ELISA.
  7. Aggiungere 100 μL dell'anticorpo αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO di capra (diluito a 1:2.000 nel tampone di blocco (10% FCS in PBS)) a ciascun pozzetto della piastra.
    1. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  8. Lavare la piastra tre volte utilizzando PBS, ad esempio utilizzando una rondella ELISA.
  9. Aggiungere 50 μL di substrato HRPO ai pozzetti. Quando si osserva una reazione di colore chiaro, arrestare la reazione attraverso l'aggiunta di 150 μl di soluzione di arresto (1M H2SO4) per pozzetto.
  10. Dopo 5 minuti, leggere l'assorbimento a 450 nm utilizzando un lettore ELISA.

Risultati

La coniugazione chimica di αDEC-205 alla proteina OAV utilizzando questo protocollo consentirà in genere la generazione efficiente di αDEC-205/OVA per approcci di targeting DC in vivo. Esistono diverse strategie per verificare la tecnica stessa e per testare la funzionalità del coniugato ceduto. L'analisi Western blot e l'ELISA vengono utilizzati per verificare il successo della coniugazione e allo stesso tempo rilevare oAV potenzialmente lasciati liberi (

Discussione

La coniugazione chimica di un anticorpo specifico del recettore dell'endocitosi e di un antigene proteico fornisce un approccio efficiente e, soprattutto, anche flessibile per il targeting DC in vivo in modelli murini pre-clinici. Con il nostro protocollo forniamo un approccio efficiente per la coniugazione di successo dell'antigene modello OAV a un anticorpo IgG specifico dec-205.

Nel nostro protocollo, αDEC-205 viene purificato da una linea cellulare di ibridoma e in passato abbiam...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano S. Prettin per l'assistenza tecnica esperta. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Associazione Helmholtz dei centri di ricerca tedeschi (HGF) che è stata fornita come parte dell'Alleanza Helmholtz "Immunoterapia dei tumori" (HCC_WP2b).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody buffer 2 %2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25Greiner Bio-One690175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75Greiner Bio-One658175we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175Greiner Bio-One661175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDaSartoriusVS2001Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 mlThermo Fisher Scientific88532Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottlesNalgene525-2314PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDaThermo Fisher Scientific89891Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)Sigma-Aldrich/MerckT8665-100ML3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)Roche/Merck12 015 200 01Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDaSERVA Electrophoresis44110Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plateThermo Fisher Scientific442404MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serumPAN-BIOtechP40-47500FBS Good forte
ISF-1 mediumBiochrom/bioswisstecF 9061-01
milk powderCarl RothT145.2powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridomaATCCHB-290if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbuminHyglos (via BioVendor)321000EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottlesNunc In Vitro734-2394standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator stripsMerck109535pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 112-035-062obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)Jackson ImmunoResearch 112-035-068obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 111-035-045 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)Abcamab181688used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)OriGeneR1101used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose columnMerck/MilliporeP32965 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standardThermo Fisher Scientific26616PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membraneMerck/MilliporeIPVH00010immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plugOmnilab5230217DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tubeOmnilab5430925DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fastwe have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)1M H2SO4
sulfo-SMCCThermo Fisher Scientific22322Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm Merck/MilliporeSLGV033RSMillex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 mlOmnilabDisposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulasB. BraunSterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-TTris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HClThermo Fisher ScientificA35349
tubing connectorOmnilabKleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

Riferimenti

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