Conjugação Química de um anticorpo purificado DEC-205-Directed com proteína de comprimento completo para direcionar células dendríticas de camundongos in vitro e in vivo

Resumo

Descrevemos um protocolo para a conjugação química do modelo de ovalbumin de antígeno para um anticorpo específico do receptor de endocitose para o direcionamento de células dendríticas in vivo. O protocolo inclui a purificação do anticorpo, a conjugação química do antígeno, bem como a purificação do conjugado e a verificação de uma conjugação eficiente.

Resumo

A entrega de antígenos direcionados para células dendríticas de apresentação cruzada (DC) in vivo in vivo induz eficientemente as respostas celulares de efeito T e exibe uma abordagem valiosa no design da vacina. O antígeno é fornecido em DC através de anticorpos específicos para receptores de endocitose, como o DEC-205, que induz a captação, processamento e apresentação da classe I e II do MHC.

A conjugação eficiente e confiável do antígeno desejado para um anticorpo adequado é um passo crítico na segmentação dc e, entre outros fatores, depende do formato do antígeno. A conjugação química de proteína de comprimento total para anticorpos purificados é uma estratégia possível. No passado, estabelecemos com sucesso a inter-vinculação do modelo antigen ovalbumin (OVA) e um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) para estudos in vivo DC direcionados em camundongos. O primeiro passo do protocolo é a purificação do anticorpo do supernacante do NLDC (células dendríticas não linfoides)-145 hibrim por cromatografia de afinidade. O anticorpo purificado é ativado para conjugação química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato) enquanto ao mesmo tempo os grupos de sulfhydryl da proteína OVA são expostos através de incubação com TCEP-HCl (tris (tris (2 carboxyethyl). O excesso de TCEP-HCl e sulfo-SMCC são removidos e o antígeno é misturado com o anticorpo ativado para acoplamento durante a noite. O conjugado αDEC-205/OVA resultante é concentrado e liberado de OVA não vinculado. A conjugação bem sucedida de OVA para αDEC-205 é verificada pela análise de manchas ocidentais e ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA).

Usamos com sucesso αDEC-205/OVA quimicamente cruzado para induzir respostas de células T citotóxicas no fígado e comparar diferentes adjuvantes para seu potencial em induzir imunidade humoral e celular após o direcionamento vivo do DEC-205⁺ DC. Além disso, esses conjugados quimicamente acoplados a anticorpos/antígenos oferecem ferramentas valiosas para a indução eficiente das respostas vacinais aos antígenos tumorais e têm sido comprovadamente superiores às abordagens clássicas de imunização em relação à prevenção e terapia de vários tipos de tumores.

Introdução

As células dendríticas (DC) são atores centrais do sistema imunológico. Tratam-se de um grupo diversificado de células especializadas em apresentação de antígenos e sua principal função é fazer a ponte entre imunidade inata e adaptativa^1,2. É importante ressaltar que a DC não só desempenha um papel importante em respostas eficientes e específicas dirigidas por patógenos, mas também está envolvida em muitos aspectos da imunidade antitumoral^1,3.

Devido ao seu papel exclusivo na imunidade do hospedeiro, a DC entrou em foco como células-alvo para^{a vacinação 4}. Uma abordagem é direcionar antígenos para DC in vivo para induzir respostas imunes específicas de antígenos e, nos últimos anos, um grande número de estudos tem sido dedicado à definição de receptores adequados e estratégias de segmentação^1,4. Um exemplo é o receptor de lectina tipo C DEC-205, que pode ser alvo de anticorpos específicos DEC-205 para induzir a endocitose. É importante ressaltar que o alvo DO DEC-205 na combinação com adjuvantes adequados tem sido mostrado para induzir eficientemente células CD4⁺ e CD8⁺ T de longa duração, bem como respostas de anticorpos, também contra antígenos tumorais^3,5,6,7,8,9.

Há uma série de estudos que mostram que antígenos conjugados direcionados à DC são superiores ao antígeno não conjugado^{livre 3,5,10,11,12}. Isso torna a conjugação do antígeno para o respectivo DC visando moiety um passo central nas abordagens de segmentação dc. No caso do direcionamento dc via anticorpos ou fragmentos de anticorpos, os antígenos podem ser quimicamente ou geneticamente ligados e qualquer estratégia fornece suas próprias (des)vantagens¹. Por um lado, em construções de anticorpos-antígenos geneticamente modificados há um controle sobre a dose de antígeno, bem como a localização proporcionando comparabilidade superior entre os lotes¹. Ao mesmo tempo, no entanto, a conjugação química precisa de menos preparação e proporciona mais flexibilidade especialmente na tentativa de testar e comparar diferentes antígenos e/ou estratégias de vacinação em modelos experimentais e pré-clínicos.

Aqui, apresentamos um protocolo para a conjugação química eficiente e confiável de ovalbumin (OVA) como um antígeno de proteína modelo para um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) adequado para o direcionamento in vivo DC em camundongos. Primeiro, o αDEC-205 é purificado a partir de células hybridoma NLDC-145¹³. Para conjugação química, é utilizado o sulfosuccinimidil heterobifuncional 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contém os grupos de ester e maleiminimide n-hidroxisuccinimide( N-hidroxisuccinimide), permitindo a conjugação covalente de moléculas de amina e sulfidry-constitucional. Especificamente, as aminas primárias do anticorpo inicialmente reagem com sulfo-SMCC e o αDEC-205 ativado por maleimida resultante, então reage com a proteína OVA contendo sulfidryl reduzida através do CLOP-HCl (Tris(2-carboxyethyl) cloridrato. O produto final é quimicamente conjugado αDEC-205/OVA (Figura 1). Além da conjugação química em si, nosso protocolo descreve a remoção do excesso de OVA do conjugado, bem como a verificação da conjugação bem sucedida através da análise de manchas ocidentais e um ensaio imunológico específico ligado à enzima. Nós empregamos com sucesso essa abordagem no passado para conjugar quimicamente OVA e outras proteínas ou peptídeos imunogênicos para αDEC-205. Demonstramos vinculação eficiente às células CD11c⁺ in vitro, bem como a eficiente indução da imunidade celular e humoral in vivo.

Certamente, há desvantagens para este método, como na comparabilidade lot-to-lot e na dosagem exata do antígeno dentro do conjugado final. No entanto, a conjugação química proporciona flexibilidade experimental na escolha do anticorpo e do antígeno proteico em comparação com construções geneticamente modificadas. Portanto, acreditamos que essa abordagem é especialmente valiosa na avaliação de diferentes antígenos para sua eficiência na segmentação dc em modelos pré-clínicos de camundongos, importante também no contexto de respostas imunes antitumorais específicas.

Protocolo

Todos os experimentos animais descritos foram aprovados pela agência do governo local (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; arquivo número 33.12-42502-04-10/0108) e foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais.

1. Produção de αDEC-205 a partir da linha celular hybridoma NLDC-145

1. Para a produção de anticorpos, descongele as células NLDC-145 que produzem αDEC-205 a 37 °C em banho-maria. Expanda as células a 37 °C e 5% de CO₂. Dois 75 cm² garrafas serão necessárias para proceder à produção de anticorpos. Os procedimentos de cultura celular devem ser realizados em um gabinete de segurança para garantir condições seguras de trabalho e evitar a contaminação das culturas.
   1. Resuspend 1 mL de células descongeladas (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ células/mL) em 9 mL de meio ISF-1 suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (pré-aquecido a 37 °C) em um frasco de cultura celular (25 cm²). Coloque o frasco horizontalmente em uma incubadora de cultura celular a 37 °C, 5% DE CO₂.
   2. Cultura as células a 37 °C e 5% DE CO₂, até 70% de confluência. Isso normalmente deve ser alcançado depois das 24 - 48 h.
   3. Uma vez que as células sejam 70% confluentes, transfira a suspensão completa da célula NLDC-145 (10 mL) para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL usando um controlador de pipeta com uma pipeta em uma faixa de volume de 1-10 mL. Pelota as células por centrifugação a 250 x g por 10 min a temperatura ambiente.
   4. Isf-1 pré-aquecido médio a 37 °C em banho-maria e resuspenque a pelota em 12 mL de meio ISF-1 suplementado com penicilina/estreptomicina de 1%. Transfira a suspensão celular resuspended em um frasco de cultura celular fresca (75 cm²).
   5. Cultura e expansão das células em meio ISF-1 suplementadas com penicilina/estreptomicina de 1% a 37 °C e 5% DE CO_2,até 70% confluentes e 99% viáveis. Isso normalmente deve ser alcançado depois de 48 - 72 h.
   6. Divida as células para dois frascos de 75 cm^2. Para fazer isso primeiro lave a cultura celular flask superfície inferior/cultura com a suspensão celular para remover todas as células NLDC-145 da superfície. Transfira 6 mL da suspensão celular NLDC-145 cada uma em uma das duas garrafas frescas de 75 cm² e adicione o meio ISF-1 pré-aquecido complementado com penicilina/estreptomicina de 1% até 12 mL.
      NOTA: Não renove o meio de cultura celular, pois as células NLDC-145 terão condicionado ao meio. Transfira as células junto com seu meio e preencha a cultura até o volume desejado com meio fresco. Isso é crucial para a viabilidade e a produção máxima de anticorpos pelas células NLDC-145.
   7. Expanda as culturas celulares a 37 °C e 5% de CO₂, até cerca de 70% de confluentes que geralmente é alcançado após 48 - 72 h.
   8. Uma vez que as células sejam 70% confluentes, transfira 10 mL da suspensão celular NLDC-145 expandida de cada uma das 75 cm² garrafas em uma garrafa de rolo PETG (polietileno tereftalato glicol) (1.050 cm²). Para isso, lave a superfície de fundo/cultura do frasco de cultura da cultura da célula com a suspensão celular para remover todas as células da superfície usando um controlador de pipeta e uma pipeta de 10 mL.
   9. Adicione 140 mL de isf-1 médio suplementado com penicilina/estreptomicina de 1% (pré-aquecido a 37 °C) diretamente da garrafa média para cada um dos NLDC-145 contendo garrafas de rolo que as enchem até a marca de 150 mL.
      NOTA: Veja nota na etapa 1.1.6.
   10. Cultura as garrafas de rolo a 37 °C, 5% CO₂ e 25 rodadas/min durante três dias.
   11. Adicione 150 mL de isf-1 médio suplementado com penicilina/estreptomicina de 1% (pré-aquecido a 37 °C) a cada um dos NLDC-145 contendo garrafas de rolo que as enchem até a marca de 300 mL.
   12. Cultura as garrafas de rolo agora contendo 300 mL cultura cada um a 37 °C, 5% CO₂ e 25 rodadas/min por mais três dias.
   13. Adicione mais 100 mL de isf-1 médio suplementado com penicilina/estreptomicina de 1% (pré-aquecido a 37 °C) a cada um dos frascos de rolo NIDC-145 contendo, preenchendo-as até a marca de 400 mL.
   14. Cultura as garrafas de rolo agora contendo 400 mL cultura cada um a 37 °C, 5% CO₂ e 25 rodadas/min por mais sete dias.
       NOTA: Durante esta semana, a cultura fica muito densa (até 95% de densidade) e a viabilidade diminui (até 50%), permitindo a liberação máxima de anticorpos.
2. Para a purificação do αDEC-205 da cultura supernadant despeje a suspensão celular NLDC-145 (de ambas as garrafas de rolo) diretamente para garrafas de centrífugação autoclaved de 500 mL.
   NOTA: Deve ser coletado um volume total de 800 mL de cultura.
   1. Centrifugar a cultura por 30 min a 8.600 x g e 4 °C para remover células e detritos.
   2. Colete os supernantes, descartando as pelotas e agrupando os supernantes em uma garrafa de reagente estéril.
      NOTA: A purificação do αDEC-205 pode ser iniciada imediatamente (etapa 2.) ou o sobrenante pode ser armazenado a curto prazo a 4 °C.

2. Purificação do anticorpo αDEC-205 do supernatante celular NLDC-145

NOTA: A partir do supernanato celular NLDC-145, αDEC-205 é purificado usando uma coluna de proteína G Sepharose (reutilizável). As dimensões da coluna são 15 mm x 74 mm e 5 mL de proteína G Sepharose são embaladas por coluna.

1. Para preparação e lavagem da coluna proteína G Sepharose, coloque um plugue de borracha hermético na abertura superior da coluna proteína G Sepharose. Puna o plugue de borracha com duas cânulas estéreis (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
   1. Conecte uma seringa de 10 mL a uma das duas cânulas e um tubo de silício flexível (aproximadamente 100 cm de comprimento, 2,5 - 3 mm de diâmetro) com um conector de tubulação à segunda cânula.
      NOTA: A construção da seringa/plugue de borracha é reutilizável e fornece um vácuo resultando em um fluxo contínuo do grande volume de cultura sobrenassivo à coluna proteína G Sepharose. Para este fim, puxe ligeiramente o êmbolo da seringa para garantir o fluxo contínuo de fluidos nas etapas seguintes.
   2. Lave a coluna com 50 mL de ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) para remover o anticorpo potencialmente remanescente de qualquer purificação de anticorpos anterior. Coloque a extremidade do tubo de silício no ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) garrafa de reagente preenchido. Como resultado do vácuo induzido, 50 mL do ácido acético glacial de 0,1 M (pH 2) passam pela coluna proteína G Sepharose.
      NOTA: 0,1 M ácido acético glacial (pH 2) deve ser armazenado em uma garrafa de reagente ou recém-preenchido em um béquer.
   3. Lave a coluna com salina tamponada com fosfato de 100-200 mL (PBS). Coloque a extremidade do tubo de silício em uma garrafa de reagente ou béquer preenchido PBS. Deixe que 100-200 mL PBS execute dropwise através da coluna proteína G Sepharose.
2. Para purificação de anticorpos do supernanato NLDC-145, carregue 800 mL do supernatante NLDC-145 (obtido a partir da etapa 1.2.2.2.) na coluna. Coloque a extremidade do tubo de silício na garrafa de reagente recheada de supernascedor NLDC-145. Deixe que 800 mL NLDC-145 supernatant execute dropwise através da coluna.
   1. Lave a coluna com 500 mL de PBS. Coloque a ponta do tubo de silício em uma garrafa de reagente ou béquer preenchido PBS. Deixe que 500 mL PBS execute dropwise através da coluna.
   2. Para elução, utilize 20 tubos de 1,5 mL e pipeta 100 μL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) em cada tubo de 1,5 mL. Remova o plugue de borracha da coluna e a pipeta 1 mL de 0,1 M de gliccina (pH 3) para a câmara superior da coluna proteína G Sepharose para elutar o anticorpo da coluna. Colecione o fluxo diretamente como elunato em um dos tubos preparados de 1,5 mL.
   3. Repita a etapa de elução (2.2.2.2.) para todos os 20 tubos (1,5 mL).
   4. Determine a densidade óptica de todas as frações de elução a 280 nm (OD₂₈₀) utilizando um espectotúmetro para identificar as frações contendo anticorpos.
      NOTA: Use a primeira fração de elução em branco.
   5. Acumule todas as frações com um OD₂₈₀ maior que 0,5 (aproximadamente 10 frações).
   6. Armazene a coluna proteína G Sepharose cheia com 20% de etanol a 4 °C.
3. Dialisar as eluções agrupadas contra 1000 mL PBS (em um béquer de 2000 mL) a 4 °C durante a noite usando tubos de diálise com um corte de peso molecular (MWCO) de 12 a 14 kDa.
   1. Corte o tubo de diálise em pedaços de 20 cm. Ferva a tubulação de diálise em 500-800 mL de 10 mM EDTA (pH 7.5) por 30 min em um béquer usando uma placa quente para remover a contaminação. Descarte a solução EDTA de 10 mM (pH 7.5) e ferva o tubo de diálise em água desionizada por 10 minutos.
      NOTA: O tubo de diálise pode ser usado diretamente ou armazenado em azida de sódio de 0,01% (NaN₃)/H₂O a 4 °C até o próximo uso.
   2. Feche a parte inferior da tubulação de diálise com um fechamento apropriado de tubos de diálise/único, grampo articulado e pipeta cuidadosamente a elução de anticorpos na tubulação de diálise. Feche a parte superior da tubulação de diálise com um segundo grampo.
   3. Fixar o grampo superior da tubulação de diálise em um suporte flutuante, coloque-o junto com uma barra de agitação magnética no béquer cheio de PBS e coloque o béquer em um agitador magnético.
   4. Dialyze durante a noite agitando a 4 °C.
4. Para aumentar a concentração de αDEC-205, carregue o dialise completo para um concentrador centrífuga com MWCO de 10 kDa. Abra um grampo da tubulação e pipeta cuidadosamente o dialise completo da tubulação de diálise no concentrador centrífugo (10 kDa MWCO).
   NOTA: Não toque na parte inferior do concentrador com a ponta da pipeta.
   1. Centrifugar por 30 min a 693 x g (2.000 rpm) e 4 °C.
   2. Carregue o concentrador centrífugo com 10 mL de PBS e centrífuga a 693 x g (2.000 rpm) e 4 °C até que o volume final da solução de anticorpos seja de 1-1,5 mL.
      NOTA: Se necessário, repita a etapa de centrifugação de 2.4.1. para ajustar à quantidade desejada.
   3. Utilizando um espectrofotômetro, determine a densidade óptica da solução concentrada αDEC-205 a 280 nm (OD₂₈₀). Use PBS como em branco.
   4. Calcule a concentração de αDEC-205 usando a seguinte fórmula:
      concentração [mg/mL] = OD₂₈₀/1.4.
   5. Filtre a solução αDEC-205 utilizando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
      NOTA: A purificação do αDEC-205 do supernanato celular nldc-145 híbrido também pode ser alcançada por FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida). O αDEC-205 purificado pode ser armazenado a 4 °C ou a -18 °C para armazenamento a longo prazo.

3. Conjugação química de OVA para αDEC-205

NOTA: É necessária uma razão de 0,5 mg de proteína OVA a 2,5 mgs αDEC-205 (1:5) para a conjugação química ideal. No entanto, essa proporção pode variar para outras proteínas e anticorpos e precisa ser otimizada para conjugados alternativos. A redução das ligações de dissulfeto da proteína OVA é realizada por meio da incubação com 30 mM TCEP-HCl, o que expõe os grupos de sulfidríl para conjugação química a αDEC-205 e 240 μl de TCEP-HCl são necessários na etapa 3.2. Ambas as etapas, redução induzida pelo TCEP de OVA (etapa 3.1.) e ativação sulfo-SMCC de αDEC-205 (etapa 3.2.), devem ser realizadas preferencialmente em paralelo.

1. Prepare recentemente uma solução DE 125 mM TCEP-HCl (pH 7.0). Pesar a quantidade desejada de TCEP-HCl e dissolver o TCEP-HCl na base de 0,9 M Tris (pH 8.8). Use tiras indicadoras de pH para testar o pH da solução TCEP-HCl de 125 mM (que deve ser neutra) e ajustar o pH com base Tris (pH 8.8).
   1. Pipeta 200 μL solução de proteína OVA (contendo 0,5 mg OVA) em um tubo estéril de 1,5 mL. Adicione 240 μl 125 mM TCEP-HCl e 560 μL de água ultrapura estéril à proteína OVA usando uma pipeta a uma concentração final de 0,5 mg/mL proteína OVA e 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      NOTA: 2,5 mg OVA Endograde (liofilizado) é dissolvido em PBS de 1 mL resultando em uma solução OVA de 2,5 mg/mL.
   2. Incubar o OVA/TCEP-HCl resultante à temperatura ambiente por 1,5 h.
      NOTA: Não prolongue esta etapa de incubação.
2. Para ativar αDEC-205 para conjugação, dissolva 2 mg de sulfo-SMCC em 100 μL de água ultrauso.
   NOTA: O Sulfo-SMCC é suscetível à hidrólise. Portanto, devem ser utilizadas quantidades maiores de sulfo-SMCC não resolvidas ou disponíveis.
   1. Diluir αDEC-205 em PBS de modo que 2,5 mgs estejam contidos em 900 μL.
   2. Misture 2,5 mgs de αDEC-205 (volume de 900 μL; obtido a partir da etapa 3.2.1.) e 100 μL de sulfo-SMCC (obtido a partir da etapa 3.2.) em um tubo de 1,5 mL, resultando em um volume total de 1 mL.
   3. Incubar a solução αDEC-205/sulfo-SMCC por 30 min a 37 °C e 550 rpm em um bloco de aquecimento.
3. Após essas incubações, o excesso de sulfo-SMCC e TCEP-HCl são imediatamente removidos das soluções usando colunas de dessecação (MWCO 7 kDa; volume de coluna de 5 mL).
   1. Gire as colunas (MWCO 7 kDa) de fechamento inferior, solte a tampa e coloque a coluna em um tubo cônico de 15 mL.
   2. Centrifugar por 2 min a 1.000 x g em temperatura ambiente para remover o líquido.
   3. Coloque a coluna em um tubo fresco e remova a tampa. Carregue lentamente o anticorpo/sulfo-SMCC e o OVA/TCEP-HCl, respectivamente, para o centro do leito de resina compacta de uma coluna cada.
   4. Centrifugar por 2 min a 1.000 x g em temperatura ambiente.
   5. Descarte as colunas após o uso. As soluções que contêm anticorpos e OVA preparados para conjugação estão nos tubos.
   6. Misture imediatamente ambas as soluções por pipetagem para conjugação de αDEC-205 e OVA.
   7. Incubar a mistura αDEC-205 resultante e OVA durante a noite a 4°C.
4. Após a conjugação, o OVA não vinculado em excesso é removido da solução e o acoplado αDEC-205/OVA está concentrado usando um concentrador de proteína centrífuga (MWCO 150 kDa).
   1. Pré-enxágue o concentrador de proteína centrífugas (MWCO 150 kDa) por tubos de 12 mL de PBS na coluna e centrifugação por 2 min a 2.000 x g à temperatura ambiente.
      NOTA: Se necessário, repita a etapa de centrifugação (3.4.1.) até que um volume de cerca de 5 mL tenha passado pela coluna.
   2. Antes de carregar o αDEC-205/OVA no concentrador de proteína centrífugas, salve uma amostra de 20 μL do αDEC-205/OVA não concentrado para análise de manchas ocidentais. Armazene esta alíquota a 4 °C até a análise.
   3. Carregue o αDEC-205/OVA no concentrador de proteína centrífugas por pipetação.
      NOTA: Evite qualquer contato com a cama da câmara superior do concentrador centrífuga.
   4. Encha o concentrador a 15 mL com PBS e centrífugue o concentrador por 5 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
   5. Salve uma amostra do fluxo -through (flow-through I) para análise de manchas ocidentais e descarte o fluxo restante.
   6. Encha o concentrador a 10 mL com PBS e centrífugue o concentrador por pelo menos 8 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
   7. Guarde uma amostra para o segundo fluxo -through (flow-through II) para análise de manchas ocidentais e descarte o fluxo restante.
   8. Uma vez alcançado o enriquecimento desejado (cerca de 1,5 mL da solução αDEC-205/OVA deve ser deixado na câmara superior) aspirar suavemente a amostra concentrada.
      NOTA: Se sobrou muito fluido na câmara superior, a centrifugação pode ser repetida, mas deve ser mantida o mais curta possível.
5. Determine a concentração proteica do αDEC-205/OVA resultante usando um espectrofotômetro microvolume. Use PBS como em branco.
6. Filtre o αDEC-205/OVA utilizando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 μm.
   NOTA: Para análise posterior e experimentos in vivo, o αDEC-205/OVA pode ser armazenado a 4 °C ou -18 °C.

4. Verificação da conjugação química por mancha ocidental

NOTA: Para verificação da conjugação química bem sucedida, é realizada a análise de manchas ocidentais detectando ova (4.2) ou αDEC-205 (4.10). A detecção de OVA (4.2.) ou αDEC-205 (4.10.) deve ser realizada em paralelo. Um agitador de plataforma orbital deve ser usado preferencialmente para todas as etapas de incubação das membranas de manchas ocidentais para permitir a distribuição uniforme das respectivas soluções.

1. Prepare os géis padrão de 10% de SDS (sulfato de dodecila de sódio) para SDS-PAGE (eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio).
2. Prepare as amostras para SDS-PAGE para detectar OVA conjugado e não conjugado e executar eletroforese de gel.
   1. Diluir diferentes quantidades de αDEC-205/OVA acoplado (por exemplo, 200, 100 e 50 ng), de OVA puro (por exemplo, 80, 70, 60, 50, 40 e 30 ng), uma alíquota de αDEC-205 não conjugado (por exemplo, 100 e 50 ng), uma amostra de conjugado não concentrado αDEC-205/OVA a partir do passo 3.4.2. (por exemplo, 125 ng) e uma alíquota de fluxo I e II (etapas 3.4.5. e 3.4.7., respectivamente; opcional) em 4 x tampão de amostra SDS não redutor.
      NOTA: Diferentes concentrações de conjugados e proteínas são carregadas para garantir que tanto o OVA livre quanto o conjugado possam ser detectados na mesma mancha.
   2. Desnaturar as amostras a 65 °C por 10 min e 550 rpm em um bloco de aquecimento.
3. Carregue as amostras e um padrão de proteína em um gel SDS e execute ODS-PAGE.
4. Realize a mancha padrão das proteínas do gel SDS até uma membrana PVDF ativada por metanol (polivinylidene difluoreto) (75 min, 125 mA).
5. Após a mancha, coloque a membrana em um prato apropriado e bloqueie a membrana ao tubo de 25 mL de 4% de shake de substituição de refeição/TBS-T (soro fisiológico tampão/0,1% Tween 20) bloqueando tampão no prato que contém a membrana.
   1. Incubar a membrana na solução de bloqueio por 60 min a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
6. Descarte a solução de bloqueio e manche a membrana com o anticorpo primário αOVA coelho em 2% de reposição de farinha em pó/tampão de anticorpos TBS-T (diluição 1:3.000) por tubos de 15 mL de solução de anticorpos primários para a membrana no prato.
   1. Incubar a membrana por 45 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (use o agitador de plataforma).
7. Descarte a solução de anticorpos e lave a membrana no prato (use o agitador de plataforma).
   1. Adicione 25 mL de TBS-T à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
   2. Adicione 25 mL de TBS-T/0,5 M NaCl à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
   3. Adicione 25 mL de TBS-T/0,5% Triton X-100 à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
   4. Adicione 25 mL de TBS-T à membrana e incubar por 5 min. Descarte a solução.
8. Manche a membrana com o anticorpo secundário αrabbit-IgG-HRPO (rabanete de rabanete de cavalo) em 2% de reposição de farinha em pó/tampão de anticorpos TBS-T (diluição 1:2.000) por tubos 15 mL de solução de anticorpos secundários para a membrana no prato.
   1. Incubar a membrana por 45 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (no agitador da plataforma).
9. Lave a membrana novamente conforme descrito na etapa 4.7.1.- 4.7.4. usando o agitador de plataforma. Para esta membrana, continue com o passo 4.16. (as seguintes etapas 4.10.- 4.15. (detecção do αDEC-205) pode ser realizado paralelamente às etapas 4.2.- 4.9.).
10. Prepare as amostras para a detecção do αDEC-205 para SDS-PAGE e execute a eletroforese do gel.
    1. Diluir diferentes quantidades de αDEC-205/OVA (por exemplo, 200, 100 e 50 ng), do αDEC-205 não conjugado (por exemplo, 250, 125, 62,5 ng), de OVA puro (por exemplo, 80 e 70 ng), uma amostra de αDEC-205/OVA não concentrado da etapa 3.4.2. (por exemplo, 125 ng) e uma alíquota de fluxo I e II (etapas 3.4.5. e 3.4.7., respectivamente; opcional) em 4 x tampão de amostra SDS não redutor.
    2. Desnaturar as amostras a 65 °C por 10 min e 550 rpm em um bloco de aquecimento.
11. Carregue as amostras e um padrão de proteína em um gel SDS e execute eletroforese de gel.
12. Realizar a mancha padrão das proteínas do gel SDS para uma membrana PVDF ativada de metanol (polivinylidene difluoreto) (75 min, 125 mA).
13. Após a mancha, coloque a membrana em um prato apropriado e bloqueie a membrana ao tubo de 25 mL de tampão de bloqueio de 10% (leite em pó/TBS-T) no prato que contém a membrana.
    NOTA: As soluções de bloqueio diferem entre a detecção de αDEC-205 e o OVA (etapa 4.5.).
    1. Incubar a membrana na solução de bloqueio por 60 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (usando o agitador de plataforma).
14. Descarte a solução de bloqueio e manche a membrana com o anticorpo αrat-IgG(H+L)-HRPO em 5% de leite em pó/tampão de anticorpos TBS-T (diluição 1:5.000) por tubos de 15 mL de solução de anticorpos para a membrana no prato.
    NOTA: Os buffers de anticorpos diferem entre a detecção αDEC-205 e a detecção de OVA (etapas 4.6./ 4.8.).
    1. Incubar a membrana por 45 min à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (usando o agitador de plataforma).
15. Lave bem a membrana no prato, conforme descrito nas etapas 4.7.1.- 4.7.4. (use o agitador de plataforma).
16. Use um reagente de detecção apropriado para desenvolver o sinal HRP e detectar a chemiluminescence em uma sala escura usando filme de raio-x ou através de um sistema de imagem.

5. Verificação da conjugação química por ELISA

1. Realize ELISA para verificação posterior da conjugação química bem sucedida resultando em αDEC-205/OVA.
2. Cubra uma placa ELISA apropriada de 96 poços com 100 μL/well de 3 ng/μL de coelho αOVA anticorpo em tampão de revestimento (0,1 M bicarbonato de sódio (NaHCO₃) pH 9,6 diluído em H₂O).
   1. Incubar a placa durante a noite a 4 °C.
3. Após o revestimento, lave a placa três vezes com PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
4. Bloqueie a placa pipetando 200 μL de tampão de bloqueio (10% FCS em PBS) em cada poço da placa e incubar a placa por 30 minutos à temperatura ambiente.
5. Diluir em série αDEC-205/OVA (obtido a partir da etapa 3.6.) 1:2 no buffer de bloqueio (10% FCS em PBS) para obter diluições que variam de 6 μg/mL até 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA e adicionar 100 μL/bem dessas quantidades decrescentes de αDEC-205/OVA aos poços.
   1. Incubar a placa por 1h em temperatura ambiente.
6. Lave a placa três vezes com PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
7. Adicione 100 μL do anticorpo αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (diluído a 1:2.000 no buffer de bloqueio (10% FCS em PBS)) a cada poço da placa.
   1. Incubar por 1h à temperatura ambiente.
8. Lave a placa três vezes usando PBS, por exemplo, usando uma arruela ELISA.
9. Adicione 50 μL de hrpo-substrato aos poços. Ao observar uma reação de cor clara, pare a reação através da adição de 150 μl de solução de parada (1M H₂SO₄) por poço.
10. Após 5 min, leia a absorção a 450 nm usando um leitor ELISA.

Resultados

A conjugação química da proteína αDEC-205 para o OVA usando este protocolo normalmente permitirá uma geração eficiente de αDEC-205/OVA para abordagens de segmentação in vivo DC. Existem diferentes estratégias para verificar a técnica em si e testar a funcionalidade do conjugado rendido. A análise da mancha ocidental e o ELISA são usados para verificar a conjugação bem sucedida e, ao mesmo tempo, detectar OVA potencialmente deixado livre(Figur...

Discussão

A conjugação química de um anticorpo específico do receptor de endocitose e um antígeno proteico fornece uma abordagem eficiente e, importante, também flexível para o direcionamento in vivo DC em modelos pré-clínicos de camundongos. Com nosso protocolo, fornecemos uma abordagem eficiente para a conjugação bem sucedida do modelo de antígeno OVA a um anticorpo IgG específico DEC-205.

Em nosso protocolo, αDEC-205 é purificado de uma célula híbrida e, no passado, purifica...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
antibody buffer 2 %			2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %			5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)			10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %			4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %			10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25	Greiner Bio-One	690175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75	Greiner Bio-One	658175	we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)
cell culture flask T175	Greiner Bio-One	661175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	88532	Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available
centrifuge bottles	Nalgene	525-2314	PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)			0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	89891	Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)	Roche/Merck	12 015 200 01	Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa	SERVA Electrophoresis	44110	Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate	Thermo Fisher Scientific	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Good forte
ISF-1 medium	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
milk powder	Carl Roth	T145.2	powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma	ATCC	HB-290	if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x			for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin	Hyglos (via BioVendor)	321000	EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles	Nunc In Vitro	734-2394	standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany
pH indicator strips	Merck	109535	pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	112-035-062	obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	111-035-045	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)	Abcam	ab181688	used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)	OriGene	R1101	used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column	Merck/Millipore	P3296	5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane	Merck/Millipore	IPVH00010	immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug	Omnilab	5230217	DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast			we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)			1M H2SO4
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
syringe 10 ml	Omnilab		Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T			Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	A35349
tubing connector	Omnilab		Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube