JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Model antijen ovalbumin'in in vivo dendritik hücre hedeflemesi için endositoz reseptörüne özgü antikora kimyasal konjugasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, antikorun saflaştırılmasını, antijenin kimyasal konjugasyonunu, ayrıca konjugenin saflaştırılmasını ve verimli konjugasyonun doğrulanmasını içerir.

Özet

Çapraz sunum dendritik hücrelere (DC) hedeflenen antijen in vivo, T efektör hücre yanıtlarını verimli bir şekilde indükler ve aşı tasarımında değerli bir yaklaşım sergiler. Antijen, DEC-205 gibi endositoz reseptörlerine özgü antikorlar aracılığıyla DC'ye teslim edilir ve bu da alımı, işlenmesini ve MHC sınıfı I ve II sunumlarını teşvik eder.

İstenilen antijenin uygun bir antikora verimli ve güvenilir bir şekilde konjugasyonu DC hedeflemesinde kritik bir adımdır ve diğer faktörlerin yanı sıra antijenin formatına bağlıdır. Tam boy proteinin saflaştırılmış antikorlara kimyasal konjugasyonu olası bir stratejidir. Geçmişte, farelerde in vivo DC hedefleme çalışmaları için antijen ovalbumin (OVA) ve DEC-205'e özgü IgG2a antikorunun (αDEC-205) çapraz bağlamasını başarıyla kurduk. Protokolün ilk adımı, antikorun NLDC (lenfoid olmayan dendritik hücreler)-145 hibridomanın afinite kromatografisi ile üstnatantından arındırılmasıdır. Saflaştırılmış antikor, sülfo-SMCC (sülfoksinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksan-1-karboksila) tarafından kimyasal konjugasyon için aktive edilir.te) aynı zamanda OVA proteininin sülfhidrit grupları TCEP-HCl (tris (tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür ile inkübasyon yoluyla maruz kalır. Aşırı TCEP-HCl ve sülfo-SMCC çıkarılır ve antijen gece kaplin için aktif antikor ile karıştırılır. Elde edilen αDEC-205/OVA konjuge konsantre edilir ve ilişkisiz OVA'dan kurtulur. OVA'nın αDEC-205'e başarılı bir şekilde konjugasyonu batı blot analizi ve enzime bağlı immünosorbent tahlil (ELISA) ile doğrulanır.

Karaciğerde sitotoksik T hücre yanıtlarını teşvik etmek ve DEC-205+ DC'nin in vivo hedeflemesini takiben humoral ve hücresel bağışıklığı teşvik etme potansiyelleri için farklı yardımcıları karşılaştırmak için kimyasal olarak çapraz bağlı αDEC-205/OVA'yı başarıyla kullandık. Bunun ötesinde, bu tür kimyasal olarak birleştirilmiş antikor/ antijen konjugeleri, tümör antijenlerine aşı yanıtlarının verimli bir şekilde indüksiyonu için değerli araçlar sunar ve çeşitli tümör türlerinin önlenmesi ve tedavisi ile ilgili klasik bağışıklama yaklaşımlarından daha üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Giriş

Dendritik hücreler (DC) bağışıklık sisteminin merkezi oyuncularıdır. Antijen sunumu konusunda uzmanlaşmış çeşitli bir hücre grubudur ve başlıca işlevleri doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık arasında köprü yapmaktır1,2. Daha da önemlisi, DC sadece verimli ve spesifik patojene yönelik yanıtlarda önemli bir rol oynamakla kalmaz, aynı zamanda antitümör bağışıklığının birçok yönüne de katılır1,3.

Konak bağışıklığındaki özel rolleri nedeniyle, DC aşılama için hedef hücreler olarak odak noktasına geldi4. Bir yaklaşım, antijene özgü immün yanıtları teşvik etmek için antijenleri DC in vivo'ya hedeflemektir ve son yıllarda, çok sayıda çalışma uygun reseptörleri tanımlamaya ve stratejileri hedeflemeye adanmıştır1,4. Örneklerden biri, endositoz indükleyen DEC-205 spesifik antikorlar tarafından hedeflenebilen C tipi lektin reseptörü DEC-205'tir. Daha da önemlisi, UYGUN adjuvanlarla kombinasyondaki DEC-205 hedeflemesinin, tümör antijenleri 3 ,5,6,7, 8, 9'akarşı antikor yanıtlarının yanı sıra uzun ömürlü ve koruyucu CD4 + veCD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde teşvik ettiği gösterilmiştir.

DC'ye yönelik konjuge antijenlerin serbest konjuge edilmemiş antijen 3 ,5,10,11,12'denüstün olduğunu gösteren bir dizi çalışma vardır. Bu, antijenin ilgili DC hedefleme moiety'ye konjugasyonunu DC hedefleme yaklaşımlarında merkezi bir adım haline getirir. Antikorlar veya antikor parçaları aracılığıyla DC hedeflemesi durumunda, antijenler kimyasal veya genetik olarak bağlanabilir ve strateji kendi (dis) avantajlarını sağlar1. Bir yandan, genetik olarak tasarlanmış antikor-antijen yapılarında, antijen dozu üzerinde bir kontrol ve lotlar arasında üstün karşılaştırılma sağlayan konumvardır 1. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon daha az hazırlık gerekir ve özellikle deneysel ve klinik öncesi modellerde farklı antijenleri ve / veya aşılama stratejilerini test etmeye ve karşılaştırmaya çalışırken daha fazla esneklik sağlar.

Burada, ovalbumin (OVA) model protein antijeni olarak, farelerde in vivo DC hedeflemeye uygun bir DEC-205 spesifik IgG2a antikoru (αDEC-205) için verimli ve güvenilir kimyasal konjugasyon için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, αDEC-205 NLDC-145 hibridoma hücrelerinden arındırılır13. Kimyasal konjugasyon için, NHS (N-hydroxysuccinimide) ester ve maleimid gruplarını içeren heterobifunctional crosslinker sülfosinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksane-1-karboksilat (sulfo-SMCC), amin ve sülfhidrit içeren moleküllerin kovalansiyel konjugasyonuna izin veren kullanılır. Spesifik olarak, antikorun birincil aminleri başlangıçta sülfo-SMCC ile reaksiyona girer ve ortaya çıkan maleimid-aktive αDEC-205 daha sonra TCEP-HCl (Tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür yoluyla azaltılmış sülfhidrit içeren OVA proteini ile reaksiyona girer. Nihai ürün kimyasal olarak konjuge αDEC-205/OVA(Şekil 1). Kimyasal konjugasyonun kendisinin ötesinde, protokolümüz fazla OVA'nın konjugeden çıkarılmasını ve batı blot analizi ve belirli bir enzime bağlı immünorbent test yoluyla başarılı konjugasyonun doğrulanmasını açıklar. Ova ve diğer proteinleri veya immünojenik peptitleri αDEC-205'e kimyasal olarak konjuge etmek için bu yaklaşımı geçmişte başarıyla çalıştırdık. CD11c+ hücreler in vitro'ya verimli bağlamanın yanı sıra hücresel ve humoral bağışıklığın verimli indüksiyonunu vivo.

Elbette, bu yöntemin dezavantajları vardır, örneğin çok-çok karşılaştırılma ve antijenin son konjuge içinde tam olarak yapılması gibi. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon, genetik olarak tasarlanmış yapılara kıyasla antikor ve protein antijen seçiminde deneysel esneklik sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın özellikle klinik öncesi fare modellerinde DC hedeflemesinde verimliliği için farklı antijenlerin değerlendirilmesinde, özellikle de spesifik antitümör immün yanıtlar bağlamında değerli olduğuna inanıyoruz.

Protokol

Açıklanan hayvan deneylerinin tümü yerel devlet kurumu (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; dosya numarası 33.12-42502-04-10/0108) tarafından onaylanmış ve ulusal ve kurumsal yönergelere göre gerçekleştirilmiştir.

1. NLDC-145 hibridoma hücre hattından αDEC-205 üretimi

  1. Antikor üretimi için, bir su banyosunda 37 °C'de αDEC-205 üreten NLDC-145 hücrelerini çözün. Hücreleri 37 °C ve %5 CO'da genişletin2. İki adet 75 cm2 antikor üretimine devam etmek için şişelere ihtiyaç duyulacaktır. Güvenli çalışma koşullarını sağlamak ve kültürlerin kirlenmesini önlemek için hücre kültürü prosedürleri bir güvenlik kabininde yapılmalıdır.
    1. 1 mL çözünülmüş hücreyi (1 x 106 - 5 x 106 hücre/mL) %1 penisilin/streptomisin (önceden 37 °C'ye ısıtılmış) ile desteklenmiş 9 mL ISF-1 ortamında hücre kültürü şişesine (25 cm2)yeniden biriktirin. Şişeyi yatay olarak 37 °C, %5 CO 2'de bir hücre kültürü inkübatörüneyerleştirin.
    2. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de kültüre edin, % 70'e kadar. Bu normalde 24 - 48 saat sonra elde edilmelidir.
    3. Hücreler %70 birleştiğinde, NLDC-145 hücre süspansiyonu (10 mL) tamamını 1-10 mL arasında bir hacim aralığında pipetli pipet denetleyicisi kullanarak 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile hücreleri pelet.
    4. Bir su banyosunda önceden ısınan ISF-1 ortamı ile 37 °C arasında ve peletin%1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş 12 mL ISF-1 ortamında yeniden diriltin. Yeniden sulanan hücre süspansiyonu taze bir hücre kültürü şişesine (75 cm2)aktarın.
    5. ISF-1 ortamındaki hücreleri 37 °C'de %1 penisilin/streptomisinin ve %5 CO2ile desteklenmiş olarak%70 izdiah ve %99 uygulanabilir seviyeye kadar kültüre edin ve genişletin. Bu normalde 48 - 72 saat sonra elde edilmelidir.
    6. Hücreleri iki adet 75 cm2 şişeye bölün. Bunu yapmak için önce hücre kültürü şişesi alt/kültür yüzeyini hücre süspansiyonu ile yıkayarak tüm NLDC-145 hücrelerini yüzeyden çıkarın. NLDC-145 hücre süspansiyonunun 6 mL'sini her biri iki taze 75 cm2 şişeden birine aktarın ve 12 mL'ye kadar% 1 penisilin / streptomisi ile desteklenmiş önceden ısıtılmış ISF-1 ortamı ekleyin.
      NOT: NLDC-145 hücreleri ortamı koşullandırmış olacağından hücre kültürü ortamını yenilemeyin. Hücreleri ortamlarıyla birlikte aktarın ve kültürü istenen hacme kadar taze ortamla doldurun. Bu, NLDC-145 hücrelerinin canlılığı ve maksimum antikor üretimi için çok önemlidir.
    7. Hücre kültürlerini 37 °C ve% 5 CO2'de genişletin, genellikle 48 - 72 saat sonra elde edilen yaklaşık% 70 birleştiği zamana kadar.
    8. Hücreler% 70 birleştiğinde, genişletilmiş NLDC-145 hücre süspansiyonunun 10 mL'sini 75 cm2 şişenin her birinden bir PETG (polietilen tereftalat glikol) rulo şişesine (1.050 cm2)aktarın. Bunun için, bir pipet denetleyicisi ve 10 mL pipet kullanarak tüm hücreleri yüzeyden çıkarmak için hücre kültürü şişesi alt / kültür yüzeyini hücre süspansiyonu ile yıkayın.
    9. 140 mL ISF-1 ortamını% 1 penisilin/ streptomisi ile desteklenmiş (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) doğrudan orta şişeden NLDC-145'in her birine ekleyin ve bunları 150 mL işaretine kadar dolduran rulo şişeler ekleyin.
      NOT: 1.1.6 adımındaki nota bakın.
    10. Silindir şişelerini üç gün boyunca 37 °C, %5 CO2 ve 25 mermi/dak'ta kültürleyin.
    11. NLDC-145 içeren silindir şişelerinin her birine 300 mL işaretine kadar dolduran NLDC-145'in her birine%1 penisilin/streptomisilin (önceden 37 °C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 150 mL ISF-1 ortamı ekleyin.
    12. Kültür silindir şişeleri artık her biri 37 °C'de 300 mL kültür, üç gün boyunca% 5 CO2 ve 25 mermi / dakika içeriyor.
    13. Silindir şişeleri içeren NLDC-145'in her birine% 1 penisilin / streptomisilin (önceden 37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 100 mL isf-1 ortamı ekleyin, böylece 400 mL işaretine kadar doldurun.
    14. Kültür silindir şişeleri artık her biri 37 °C'de 400 mL kültür, % 5 CO2 ve 25 tur / dakika yedi gün daha içeriyor.
      NOT: Bu hafta boyunca, kültür çok yoğunlaşır (%95'e kadar yoğunluk) ve canlılık azalır (%50'ye kadar inerek maksimum antikor salınımı sağlar).
  2. αDEC-205'in kültür süperndanstantından arındırılması için NLDC-145 hücre süspansiyonunu (her iki silindir şişesinden) doğrudan 500 mL otomatik kapatılmış santrifüj şişesine dökün.
    NOT: Toplam 800 mL kültür hacmi toplanmalıdır.
    1. Hücreleri ve kalıntıları gidermek için kültürü 8.600 x g ve 4 °C'de 30 dakika santrifüj edin.
    2. Süpernatantları toplayın, peletleri atın ve süpernatantları steril bir reaktif şişede biriktin.
      NOT: αDEC-205'in saflaştırılmasına hemen başlanabilir (adım 2.) veya süpernatant 4 °C'de kısa süreli saklanabilir.

2. ΑDEC-205 antikorunun NLDC-145 hücre süperndantantından arındırılması

NOT: NLDC-145 hücre süpernatantından, αDEC-205 bir protein G Sepharose sütunu (yeniden kullanılabilir) kullanılarak saflaştırılır. Sütun boyutları 15 mm x 74 mm'dir ve sütun başına 5 mL protein G Sepharose paketlenir.

  1. G Sepharose sütununun hazırlanması ve yıkanması için, protein G Sepharose sütununun üst açıklığına hava geçirmez bir kauçuk fiş takın. Kauçuk fişi iki steril kanonla (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm) delin.
    1. İki kanondan birine 10 mL şırınna ve ikinci kanolaya bir boru konektörü ile esnek bir silikon tüp (yaklaşık 100 cm uzunluğunda, 2,5 - 3 mm çapında) bağlayın.
      NOT: Şırınd/kauçuk fiş yapısı yeniden kullanılabilir ve büyük kültür süpernatantının protein G Sepharose sütununa sürekli akışına neden olan bir vakum sağlar. Bu amaçla, aşağıdaki adımlarda sürekli sıvı akışını sağlamak için şırınnanın pistonu hafifçe geri çekin.
    2. Önceki antikor saflaştırmasından kalan antikoru çıkarmak için sütunu 50 mL 0,1 M buzul asetik asit (pH 2) ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu 0,1 M buzul asetik asit (pH 2) dolgulu reaktif şişeye koyun. İndüklenen vakumun bir sonucu olarak, 0.1 M buzul asetik asetik asidinin (pH 2) 50 mL'si damla yönünde G Sepharose protein kolonunun içinden geçer.
      NOT: 0,1 M buzul asetik asit (pH 2) bir reaktif şişede saklanmalı veya bir behere taze doldurulmalıdır.
    3. Kolonu 100-200 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu PBS dolu bir reaktif şişesine veya behere koyun. 100-200 mL PBS protein G Sepharose sütunu boyunca damla yönünde çalışmasına izin verin.
  2. NLDC-145 süperndantanttan antikor saflaştırması için, sütuna NLDC-145 süpernatantının 800 mL'sini (adım 1.2.2.'den elde edilir) yükleyin. Silikon tüpün ucunu NLDC-145 süpernatant dolgulu reaktif şişesine koyun. 800 mL NLDC-145 supernatant sütun boyunca damla yönünde çalışmasına izin verin.
    1. Sütunu 500 mL PBS ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu PBS dolu bir reaktif şişesine veya behere koyun. 500 mL PBS'nin sütun boyunca damla yönünde çalışmasına izin verin.
    2. Elution için, her 1,5 mL tüpe 20 adet 1,5 mL boru ve 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) pipet 100 μL kullanın. Antikorun kolondan elüte etmesi için kauçuk fişi sütundan ve pipetten 1 mL 0,1 M glisin (pH 3) protein G Sepharose sütununun üst odasına çıkarın. Akış akışını doğrudan hazırlanan 1,5 mL tüplerden birinde elüat olarak toplayın.
    3. 20 tüpün tümü (1,5 mL) için elution adımını (2,2,2.) tekrarlayın.
    4. Antikor içeren fraksiyonları tanımlamak için spektrofotometre kullanarak 280 nm (OD280)seviyesindeki tüm elution fraksiyonlarının optik yoğunluğunu belirleyin.
      NOT: İlk elution kesirini boş olarak kullanın.
    5. Tüm kesirleri 0,5'ten (yaklaşık 10 kesir) büyük bir OD280 ile bir depola.
    6. %20 etanol ile dolu G Sepharose sütununu 4 °C'de saklayın.
  3. 12 - 14 kDa moleküler ağırlığı kesilmiş (MWCO) diyaliz borularını kullanarak bir gecede 4 °C'de 1000 mL PBS'ye (2000 mL'lik bir beherde) karşı havuzlanmış elutionları dialyze edin.
    1. Diyaliz tüpünü 20 cm'lik parçalar halinde kesin. Diyaliz borularını 10 mM EDTA'nın (pH 7.5) 500-800 mL'sinde, kirlenmeyi gidermek için sıcak bir plaka kullanarak bir beherde 30 dakika kaynatın. 10 mM EDTA (pH 7.5) çözeltisini atın ve diyaliz borularını deiyonize suda 10 dakika kaynatın.
      NOT: Diyaliz tüpü doğrudan kullanılabilir veya bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de % 0,01 sodyum azit (NaN3) / H2O çözeltisinde saklanabilir.
    2. Diyaliz tüpünün altını uygun bir diyaliz boru kapatma/tek parça, menteşeli kelepçe ile kapatın ve antikor salınımını diyaliz tüpüne dikkatlice boruleyin. Diyaliz tüpünün üst kısmını ikinci bir kelepçe ile kapatın.
    3. Diyaliz tüpünün üst kelepçesini yüzen bir standa sabitleyin, PBS dolu kabın içine manyetik bir karıştırma çubuğu ile birleştirin ve kabı manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin.
    4. Dialyze gece boyunca 4 °C'de karıştırın.
  4. αDEC-205 konsantrasyonu artırmak için, kadranın tamamını 10 kDa MWCO'lu bir santrifüj konsantratöre yükleyin. Borunun bir kelepçesini açın ve diyaliz tüpünün tamamını dikkatlice santrifüj konsantratöre (10 kDa MWCO) borulayın.
    NOT: Pipet ucu ile konsantratörün altına dokunmayın.
    1. 693 x g (2.000 rpm) ve 4 °C'de 30 dakika santrifüj.
    2. Santrifüj konsantratörü 10 mL PBS ve santrifüj ile 693 x g (2.000 rpm) ve 4 °C'de, kalan son antikor çözeltisi hacmi 1-1,5 mL olana kadar yükleyin.
      NOT: Gerekirse, 2.4.1 santrifüjleme adımını tekrarlayın. istenen miktara ayarlamak için.
    3. Spektrofotometre kullanarak, konsantre αDEC-205 çözeltisinin optik yoğunluğunu 280 nm'de (OD280)belirleyin. PBS'i boş olarak kullanın.
    4. Aşağıdaki formülü kullanarak αDEC-205 konsantrasyonunun hesaplanacağını hesaplayın:
      konsantrasyon [mg/mL] = OD280/1.4.
    5. αDEC-205 solüsyonını 0,22 μm şırınna filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
      NOT: ΑDEC-205'in NLDC-145 hibridoma hücreli süpernatanttan arındırılması FPLC (hızlı protein sıvı kromatografisi) ile de sağlanabilir. Saflaştırılmış αDEC-205, uzun süreli depolama için 4 °C'de veya -18 °C'de saklanabilir.

3. OVA'nın αDEC-205'e kimyasal konjugasyonu

NOT: Optimal kimyasal konjugasyon için 0,5 mg OVA proteininin 2,5 mg αDEC-205 'e (1:5) oranı gereklidir. Bununla birlikte, bu oran diğer proteinler ve antikorlar için değişebilir ve alternatif konjugeler için optimize edilmesi gerekir. OVA proteininin disülfit bağlarının azaltılması, kimyasal konjugasyon için sülfhidrit gruplarını αDEC-205 ve 240 μl TCEP-HCl'ye maruz bırakan 30 mM TCEP-HCl ile inkübasyon yoluyla gerçekleştirilir. Her iki adımda da OVA'nın TCEP kaynaklı azaltılması (adım 3.1.) ve αDEC-205'in sülfo-SMCC aktivasyonu (adım 3.2.) tercihen paralel olarak yapılmalıdır.

  1. 125 mM TCEP-HCl çözümü (pH 7.0) hazırlayın. İstediğiniz miktarda TCEP-HCl tartın ve TCEP-HCl'yi 0,9 M Tris tabanında (pH 8,8) çözün. 125 mM TCEP-HCl çözeltisinin pH'ını test etmek (nötr olmalıdır) ve pH'ı Tris tabanı (pH 8.8) ile ayarlamak için pH gösterge şeritlerini kullanın.
    1. Pipet 200 μL OVA protein çözeltisi (0,5 mg OVA içeren) 1,5 mL steril bir tüpe. Ova proteinine pipet kullanarak 240 μl 125 mM TCEP-HCl ve 560 μL steril ultra saf su ekleyerek 0,5 mg/mL OVA proteini ve 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl) konsantrasyonuna son bir konsantrasyon ekleyin.
      NOT: 2.5 mg EndoGrade OVA (liyofilize) 1 mL PBS'de çözülür ve 2.5 mg/mL OVA çözeltisi ile sonuçlanır.
    2. Elde ettiği OVA/TCEP-HCl'yi oda sıcaklığında 1,5 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Bu inkübasyon adımlarını uzatmayın.
  2. Konjugasyon için αDEC-205'i etkinleştirmek için, 100 μL ultra saf suda 2 mg sülfo-SMCC çözün.
    NOT: Sulfo-SMCC hidrolize karşı hassastır. Bu nedenle, daha büyük miktarlarda çözülmemiş sülfo-SMCC hızla ele alınmalı veya mevcut 2 mg aliquots kullanılmalıdır.
    1. PBS'de αDEC-205'i seyreltin, böylece 900 μL'de 2,5 mg bulunur.
    2. 2,5 mg αDEC-205 (900 μL hacim; adım 3.2.1.'den elde edilen) ve 100 μL sülfo-SMCC'yi (adım 3.2.'den elde edilir) 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırın ve toplam 1 mL hacim elde edin.
    3. αDEC-205/sulfo-SMCC çözeltisini 37 °C'de 30 dakika ve ısıtma bloğunda 550 rpm kuluçkaya yatırın.
  3. Bu inkübasyonların ardından, aşırı sülfo-SMCC ve TCEP-HCl, tuzdan arındırma sütunları (MWCO 7 kDa; 5 mL sütun hacmi) kullanılarak çözeltilerden hemen çıkarılır.
    1. Sütunları (MWCO 7 kDa) alt kapamayı bükün, kapağı gevşetin ve sütunu 15 mL konik bir tüpe yerleştirin.
    2. Sıvıyı çıkarmak için oda sıcaklığında 1.000 x g'da 2 dakika santrifüj.
    3. Sütunu yeni bir tüpe yerleştirin ve kapağı çıkarın. Antikor/sülfo-SMCC ve OVA/TCEP-HCl'yi sırasıyla bir sütunlu kompakt reçine yatağının ortasına yavaşça yükleyin.
    4. Oda sıcaklığında 1.000 x g'da 2 dakika santrifüj.
    5. Kullandıktan sonra sütunları atın. Konjugasyon için astarlanmış antikor ve OVA içeren çözeltiler tüplerdedir.
    6. αDEC-205 ve OVA konjugasyonu için pipetleme yaparak her iki çözeltiyi de hemen karıştırın.
    7. Elde ettiği αDEC-205 ve OVA karışımını 4°C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  4. Konjugasyondan sonra, aşırı ilişkisiz OVA çözeltiden çıkarılır ve eşleştirilmiş αDEC-205/OVA bir santrifüj protein konsantratör (MWCO 150 kDa) kullanılarak konsantre edilir.
    1. Santrifüj protein konsantratörunu (MWCO 150 kDa) kolona 12 mL PBS pipetleme ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da 2 dakika santrifüjleme ile önceden durulayın.
      NOT: Gerekirse, sütundan yaklaşık 5 mL'lik bir hacim geçene kadar santrifüjleme adımını (3.4.1.) tekrarlayın.
    2. αDEC-205/OVA'yı santrifüj protein konsantratörüne yüklemeden önce, batı leke analizi için konsantre olmayan αDEC-205/OVA'nın 20 μL örneğini saklayın. Analize kadar bu aliquot'ı 4 °C'de saklayın.
    3. αDEC-205/OVA'yı pipetleme ile santrifüj protein konsantratörüne yükleyin.
      NOT: Santrifüj konsantratörün üst odasının yatağıyla herhangi bir temastan kaçının.
    4. Yoğunlaştırıcıyı PBS ile 15 mL'ye doldurun ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da 5 dakika boyunca konsantratörü santrifüj edin.
    5. Batı blot analizi için akış (akış I) örneğini kaydedin ve kalan akış akışını atın.
    6. Yoğunlaştırıcıyı PBS ile 10 mL'ye doldurun ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da en az 8 dakika boyunca konsantratörü santrifüj edin.
    7. Batı blot analizi için ikinci akış (akış II) için bir örnek kaydedin ve kalan akış akışını atın.
    8. İstenilen zenginleştirme elde edildikten sonra (αDEC-205/OVA çözeltisinin yaklaşık 1,5 mL'si üst bölmede bırakılmalıdır) konsantre numuneyi hafifçe epire edin.
      NOT: Üst bölmede çok fazla sıvı bırakılırsa, santrifüj tekrarlanabilir, ancak mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır.
  5. Elde ettiği αDEC-205/OVA'nın protein konsantrasyonunu mikrovolum spektrofotometresi kullanarak belirleyin. PBS'i boş olarak kullanın.
  6. αDEC-205/OVA'yı 0,22 μm şırınd filtresi ünitesi kullanarak filtreleyin.
    NOT: Daha sonraki analizler ve in vivo deneyler için αDEC-205/OVA 4 °C veya -18 °C'de saklanabilir.

4. Kimyasal konjugasyonun batı lekesi tarafından doğrulanması

NOT: Başarılı kimyasal konjugasyonun doğrulanması için OVA (4.2) veya αDEC-205 (4.10) tespit eden batı blot analizi yapılır. Paralel olarak OVA (4.2.) veya αDEC-205 (4.10.) tespiti yapılmalıdır. Bir yörüngesel platform çalkalayıcı tercihen ilgili çözümlerin düzgün dağılımına izin vermek için batı leke zarlarının tüm kuluçka adımları için kullanılmalıdır.

  1. SDS-PAGE (sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez) için standart %10 SDS (sodyum dodecyl sülfat) jelleri hazırlayın.
  2. Eşlenmemiş ve konjuge edilmemiş OVA'yı tespit etmek ve jel elektroforezi çalıştırmak için örnekleri SDS-PAGE için hazırlayın.
    1. Farklı miktarlarda eşleştirilmiş αDEC-205/OVA (örneğin, 200, 100 ve 50 ng), saf OVA (örneğin, 80, 70, 60, 50, 40 ve 30 ng), 3.4.2 adımından konsantre olmayan αDEC-205/OVA konjugesinin bir örneği olan αDEC-205 (örneğin, 100 ve 50 ng) bir aliquot. (örneğin, 125 ng) ve 4 x azaltmayan SDS örnek tamponunda akışlı I ve II aliquot (sırasıyla 3.4.5. ve 3.4.7. adımlar; isteğe bağlı).
      NOT: Hem serbest OVA'nın hem de konjugenin aynı leke üzerinde tespit edilebilmesini sağlamak için farklı konjuge ve protein konsantrasyonları yüklenir.
    2. Numuneleri 65 °C'de 10 dakika ve 550 rpm'de bir ısıtma bloğunda denature.
  3. Numuneleri ve protein standardını bir SDS jeline yükleyin ve SDS-PAGE'i çalıştırın.
  4. Proteinlerin SDS jelinden metanolle aktive edilmiş bir PVDF (polivinyliden difluorid) membrana (75 dk, 125 mA) standart şişirilmesini gerçekleştirin.
  5. Şişkinlik sonrasında, membranı uygun bir yemeğe koyun ve membran içeren çanağa 25 mL%4 yemek değiştirme sallama tozu/TBS-T (Tris tamponlu salin/%0,1 Ara 20) bloke tamponu pipetleyarak zarı tıkayın.
    1. Membranı blokaj çözeltisinde oda sıcaklığında 60 dakika veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya bırakın.
  6. Bloklama solüsyonunu atın ve yemekteki zara 15 mL birincil antikor çözeltisi pipetleterek% 2 öğün değiştirme sallama tozu / TBS-T antikor tamponunda (seyreltme 1:3.000) tavşan αOVA birincil antikoru ile membranı lekeleyin.
    1. Membranı oda sıcaklığında 45 dakika veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya bırakın (platform çalkalayıcıyı kullanın).
  7. Antikor çözeltisini atın ve zarı bulaşıkta yıkayın (platform çalkalayıcıyı kullanın).
    1. Membrana 25 mL TBS-T ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
    2. Membrana 25 mL TBS-T/0,5 M NaCl ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
    3. Membrana 25 mL TBS-T/%0,5 Triton X-100 ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
    4. Membrana 25 mL TBS-T ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
  8. Yemekteki membrana 15 mL ikincil antikor çözeltisi pipetleterek% 2 öğün değiştirme sallama tozu / TBS-T antikor tamponunda (seyreltme 1:2.000) keçi αrabbit-IgG-HRPO (at turpu peroksidaz) ikincil antikor ile zarı lekeleyin.
    1. Membranı oda sıcaklığında 45 dakika veya 4 °C'de (platform çalkalayıcıda) gece boyunca kuluçkaya bırakın.
  9. Membranı 4.7.1.- 4.7.4 adımında açıklandığı gibi tekrar yıkayın. platform çalkalayıcıyı kullanarak. Bu zar için, bir sonraki adım 4.16 ile devam edin. (aşağıdaki adımlar 4.10.- 4.15. (αDEC-205'in tespiti) 4.2.- 4.9. adımlara paralel olarak gerçekleştirilebilir.
  10. Örnekleri SDS-PAGE için αDEC-205'in tespiti için hazırlayın ve jel elektroforezini çalıştırın.
    1. Farklı miktarlarda αDEC-205/OVA seyreltin (örn. 200, 100 ve 50 ng), un-conjugated αDEC-205 (örneğin, 250, 125, 62.5 ng), saf OVA (örneğin, 80 ve 70 ng), adım 3.4.2'den konsantre olmayan αDEC-205/OVA örneği. (örneğin, 125 ng) ve 4 x azaltmayan SDS örnek tamponunda akışlı I ve II aliquot (sırasıyla 3.4.5. ve 3.4.7. adımlar; isteğe bağlı).
    2. Numuneleri 65 °C'de 10 dakika ve 550 rpm'de bir ısıtma bloğunda denature.
  11. Numuneleri ve protein standardını bir SDS jeline yükleyin ve jel elektroforezi çalıştırın.
  12. Proteinlerin SDS jelinden metanol aktif PVDF (polivinyliden difluorid) membran (75 dk, 125 mA) kadar standart şişirilmesini gerçekleştirin.
  13. Şişkinliği takiben, membranı uygun bir kaba koyun ve membranı içeren kabın içine% 10 bloke tamponunun (süt tozu / TBS-T) 25 mL'sini pipetleyarak zarı tıkayın.
    NOT: Engelleme çözümleri αDEC-205 ve OVA algılama (adım 4.5.
    1. Membranı oda sıcaklığında 60 dakika veya 4 °C'de gece boyunca (platform çalkalayıcıyı kullanarak) blokaj çözeltisinde kuluçkaya bırakın.
  14. Blokaj çözeltisini atın ve membranı keçi αrat-IgG(H+L)-HRPO antikoru ile %5 süt tozu/TBS-T antikor tamponunda (seyreltme 1:5.000) bulaşıktaki zara 15 mL antikor çözeltisi pipetleterek lekeleyin.
    NOT: Antikor tamponları αDEC-205 tespiti ile OVA tespiti arasında farklılık gösterir (adım 4.6./ 4.8.).
    1. Membranı oda sıcaklığında 45 dakika veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya bırakın (platform çalkalayıcıyı kullanarak).
  15. Membranı, 4.7.1.- 4.7.4 adımlarında açıklandığı gibi tabakta iyice yıkayın. (platform çalkalayıcıyı kullanın).
  16. HRP sinyalini geliştirmek ve karanlık bir odadaki chemiluminescence'ı x-ray filmi veya görüntüleme sistemi aracılığıyla tespit etmek için uygun bir algılama reaktifi kullanın.

5. Kimyasal konjugasyonun ELISA tarafından doğrulanması

  1. αDEC-205/OVA ile sonuçlanan başarılı kimyasal konjugasyonun daha fazla doğrulanması için ELISA'yı gerçekleştirin.
  2. Uygun bir 96 kuyulu ELISA plakasını kaplama tamponunda 100 μL/kuyu 3 ng/μL tavşan αOVA antikoru ile kapla (0,1 M sodyum bikarbonat (NaHCO3) pH 9,6 H2O'da seyreltilmiştir).
    1. Plakayı 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Kaplamadan sonra, plakayı PBS ile üç kez yıkayın, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak.
  4. Plakanın her kuyusuna 200 μL blokaj tamponu (PBS'de % 10 FCS) pipetleme yaparak plakayı tıkayın ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. 6 μg/m arasında değişen seyreltmeler elde etmek için αDEC-205/OVA'yı (adım 3.6.) 1:2 blokaj tamponunda (PBS'de %10 FCS) seri olarak seyreltin 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA'ya kadar iner ve kuyulara bu azalan αDEC-205/OVA miktarlarının 100 μL/kuyusunun eklenmesini sağlar.
    1. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
  6. Plakayı PBS ile üç kez yıkayın, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak.
  7. Plakanın her kuyusuna 100 μL keçi αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO antikoru (blokaj tamponunda 1:2.000'e kadar seyreltilmiş (PBS'de %10 FCS)) ekleyin.
    1. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  8. Plakayı PBS kullanarak, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak üç kez yıkayın.
  9. Kuyulara 50 μL HRPO substrat ekleyin. Net bir renk reaksiyonu gözlemlerken, kuyu başına 150 μl durdurma çözeltisi (1M H2SO4)eklenerek reaksiyonu durdurun.
  10. 5 dakika sonra, elisa okuyucu kullanarak 450 nm'de emilimi okuyun.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak αDEC-205 ila OVA proteininin kimyasal konjugasyonu tipik olarak in vivo DC hedefleme yaklaşımları için verimli αDEC-205/OVA üretimine izin verecektir. Tekniğin kendisini doğrulamak ve verilen konjugenin işlevselliğini test etmek için farklı stratejiler vardır. Batı blot analizi ve ELISA başarılı konjugasyonu doğrulamak ve aynı zamanda potansiyel olarak serbest OVA'yı tespit etmek için kullanılır (Şekil 2

Tartışmalar

Endositoz reseptörüne özgü antikor ve protein antijeninin kimyasal konjugasyonu, klinik öncesi fare modellerinde in vivo DC hedeflemesi için verimli ve daha da önemlisi esnek bir yaklaşım sağlar. Protokolümüzle, model antijen OVA'nın DEC-205'e özgü bir IgG antikoru için başarılı bir şekilde konjugasyonu için verimli bir yaklaşım sağlıyoruz.

Protokolümüze göre, αDEC-205 bir hibridoma hücre hattından arındırıldır ve geçmişte, tanımlandığı gibi G ...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar uzman teknik yardımı için S. Prettin'e teşekkür eder. Bu çalışma Helmholtz Alman Araştırma Merkezleri Birliği'nin (HGF) Helmholtz İttifakı ''Kanserlerin İmmünoterapisi' (HCC_WP2b) kapsamında sağlanan bir hibe ile desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody buffer 2 %2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25Greiner Bio-One690175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75Greiner Bio-One658175we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175Greiner Bio-One661175we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDaSartoriusVS2001Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 mlThermo Fisher Scientific88532Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottlesNalgene525-2314PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDaThermo Fisher Scientific89891Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)Sigma-Aldrich/MerckT8665-100ML3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)Roche/Merck12 015 200 01Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDaSERVA Electrophoresis44110Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plateThermo Fisher Scientific442404MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serumPAN-BIOtechP40-47500FBS Good forte
ISF-1 mediumBiochrom/bioswisstecF 9061-01
milk powderCarl RothT145.2powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridomaATCCHB-290if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbuminHyglos (via BioVendor)321000EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottlesNunc In Vitro734-2394standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator stripsMerck109535pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 112-035-062obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)Jackson ImmunoResearch 112-035-068obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch 111-035-045 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)Abcamab181688used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)OriGeneR1101used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose columnMerck/MilliporeP32965 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standardThermo Fisher Scientific26616PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membraneMerck/MilliporeIPVH00010immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plugOmnilab5230217DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tubeOmnilab5430925DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fastwe have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)1M H2SO4
sulfo-SMCCThermo Fisher Scientific22322Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm Merck/MilliporeSLGV033RSMillex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 mlOmnilabDisposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulasB. BraunSterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-TTris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HClThermo Fisher ScientificA35349
tubing connectorOmnilabKleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

Referanslar

  1. Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
  4. Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
  5. Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
  6. Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
  7. Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
  8. Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
  9. Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
  10. Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
  11. Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
  12. Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
  13. Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
  14. Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmasSay 168dendritik h cre hedeflemedendritik h crelerDEC 205antijen do umuantijen konjugasyonukimyasal konjugasyonantikor arac l endositoza lamaantit m r ba kl k

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır