インビボおよびインビボでマウス樹状細胞を標的とする全長タンパク質を用いた精製DEC-205指向抗体の化学的結合

要約

インビボ樹状細胞標的に対するエンドサイトーシス受容体特異的抗体に対するモデル抗原オボアルブミンの化学的結合のためのプロトコルについて説明する。プロトコルには、抗体の精製、抗原の化学的共役、ならびにコンジュゲートの精製および効率的な共役の検証が含まれる。

要約

生体 内で クロスプレゼンテ提示樹状細胞(DC)への標的抗原送達は、Tエフェクター細胞応答を効率的に誘導し、ワクチン設計において価値のあるアプローチを示す。抗原は、取り込み、処理、およびMHCクラスI-およびII-プレゼンテーションを誘導するDEC-205などのエンドサイトーシス受容体に特異的な抗体を介してDCに送達される。

適切な抗体に対する望ましい抗原の効率的かつ確実な結合は、DC標的化における重要なステップであり、他の要因の中でも抗原の形式に依存する。精製抗体に対する全長タンパク質の化学的結合は、考えられる1つの戦略である。これまで、マウスでの インビボ DC標的化研究に対して、モデル抗原オボアルブミン(OVA)とDEC-205特異的IgG2a抗体(αDEC-205)の架橋の確立に成功しました。プロトコルの最初のステップは、アフィニティークロマトグラフィーによるNLDC(非リンパ系樹状細胞)-145ハイブリドーマの上清からの抗体の精製である。精製された抗体は、スルホ-SMCC(スルホフチニミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシル酸)によって化学的共役のために活性化されると同時に、OVAタンパク質のスルフヒドリル基はTCEP-HCl(トリス(トリス(トリス(トリス(2-カルボシテヒリル)ホドロフェでインビクテーションを介して露出する。過剰なTCEP-HClおよびスルホ-SMCCは除去され、抗原は一晩の結合のために活性化された抗体と混合される。得られたαDEC-205/OVAコンジュゲートは濃縮され、非結合OVAから解放される。αDEC-205へのOVAの結合に成功した結合は、ウェスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって検証される。

我々は、化学的に架橋されたαDEC-205/OVAを使用して、肝臓で細胞傷害性T細胞応答を誘導し、DEC-205+DCの生体内標的化後に体液性および細胞性免疫を誘導する可能性について異なるアジュバントを比較することに成功した。それ以上に、このような化学的結合抗体/抗原コンジュゲートは、腫瘍抗原に対するワクチン応答の効率的な誘導のための貴重なツールを提供し、様々なタイプの腫瘍の予防および治療に関する古典的な免疫化アプローチよりも優れていることが証明されています。

概要

樹状細胞(DC)は免疫系の中心的なプレーヤーである。彼らは抗原提示に特化した多様な細胞群であり、その主要な機能は、自然免疫と適応免疫^1、2を橋渡しすることである。重要なことに、DCは効率的かつ特異的な病原体指向応答において重要な役割を果たすだけでなく、抗腫瘍性免疫^1、3の多くの側面にも関与している。

宿主免疫における排他的な役割のために、DCはワクチン接種4の標的細胞として焦点を当^てた。一つのアプローチは、抗原特異的免疫応答を誘導するために生体内でDCに抗原を標的にするものであり、そして過去数年間にわたり、多くの研究が適切な受容体および標的戦略^1、4を定義することに専念してきた。その一例が、C型レクチン受容体DEC-205であり、これは、エンドサイトーシスを誘導するためにDEC-205特異的抗体によって標的とすることができる。重要なことに、適切なアジュバントとの組み合わせにおけるDEC-205の標的化は、長期かつ保護的な^{CD4+およびCD8+T}細胞、ならびに抗体応答を効率よく誘導することが示されており、腫瘍抗原^{3、5、6、7、8、9}にも対しても。

DCを標的とする共役抗原が遊離非共役抗原^{3、5、10、11、12}よりも優れているという多数の研究がある。これにより、それぞれのDCターゲティング部分への抗原の結合がDCターゲティングアプローチの中心的なステップとなる。抗体または抗体断片を介してDC標的化する場合、抗原は化学的または遺伝的に結合することができ、かついずれかの戦略は、独自の(dis)利点¹を提供する。一方で、遺伝子組み換え抗体抗原構築物では、抗原用量の制御と、ロット¹間の優れた比較性を提供する場所がある。しかし同時に、化学結合は、実験モデルおよび前臨床モデルで異なる抗原および/またはワクチン接種戦略をテストおよび比較しようとする場合に特に、より少ない準備を必要とし、より柔軟性を提供します。

ここでは、マウスでのインビボDC標的化に適したDEC-205特異的IgG2a抗体(αDEC-205)に対するモデルタンパク質抗原としてのオボアルブミン(OVA)の効率的かつ信頼性の高い化学的結合のためのプロトコルを提示する。まず、αDEC-205は、NLDC-145ハイブリドーマ細胞¹³から精製される。化学共役には、NHS(N-ヒドロキシスクイミド)エステルおよびマレイミド基を含むヘテロビテレンティクロスリンカースルフォスチーニミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sulfo-SMCC)が使用され、アミンおよびスルフシルヒドロを含む分子の共有結合が可能である。具体的には、抗体の一次アミンはスルホ-SMCCと最初に反応し、得られたマレイミド活性化αDEC-205は、TCEP-HCl(Tris(2-カルボクセチル)塩酸塩を介して還元されたスルフヒドリル含有OVAタンパク質と反応する。最終製品は化学的に共役したαDEC-205/OVA(図1)です。化学共役自体を超えて、我々のプロトコルは、結合物からの過剰なOVAの除去、ならびにウェスタンブロット分析および特定の酵素結合免疫吸着アッセイによる正常な結合の検証を記述する。過去にこのアプローチを採用し、OVAや他のタンパク質や免疫原性ペプチドをαDEC-205に化学的に結合しました。我々は、インビトロでCD11c+細胞への効率的な結合、ならびに生体内での細胞および体液性免疫の効率的な誘導を実証する。

確かに、この方法には、ロット間の比較性や最終コンジュゲート内の抗原の正確なドージングなど、欠点があります。しかしながら、化学的結合は、遺伝子組み換え構造と比較して、抗体およびタンパク質抗原の選択において実験的な柔軟性を提供する。したがって、このアプローチは、特に、特定の抗腫瘍性免疫応答の文脈においても、前臨床マウスモデルにおけるDC標的化におけるそれらの効率について異なる抗原を評価する上で特に価値があると考えています。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、地方自治体政府機関(ニーダーゼヒシッシュ・フランデサムト・フュル・ヴェルブラウヒャーシュッツ・ウント・レーベンスミテルシヒャーハイト、ファイル番号33.12-42502-04-10/0108)によって承認され、国と機関のガイドラインに従って行われました。

1. ハイブリドーマ細胞株NLDC-145からのαDEC-205の生産

1. 抗体製造のために、凍結保存されたNLDC-145細胞を水浴中の37°Cで37°Cで産生する凍結保存されたNLDC-145細胞を解凍する。37°Cおよび5%COで細胞を拡大する₂.2つの75 cm² 抗体の生産に進むためには、ボトルが必要になります。細胞培養手順は安全な作業条件を確保し、培養物の汚染を防ぐために安全キャビネットで行われるべきです。
   1. 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに予め温め)を添加したISF-1培地の9mLに解凍した細胞(1 x 10^6-5 x 10⁶細胞/mL)の1 mLを細胞培養フラスコ(25cm2)に再懸濁する。フラスコを細胞培養インキュベーターに水平に置き、37°C、5%CO2にします。
   2. 37°Cおよび5%CO2で細胞を70%合流するまで培養する。これは通常、24 - 48時間後に達成されるはずです。
   3. 細胞が70%コンフルエントになったら、1〜10 mLの体積範囲のピペットコントローラを使用して、完全なNLDC-145細胞懸濁液(10mL)を15 mLの円錐遠心管に移します。ペレット細胞は、室温で10分間250xgで遠心分離して細胞をペレット化した。
   4. 水浴中の37°Cに前温かいISF-1培地と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充するISF-1培地の12 mLでペレットを再懸濁します。再懸濁細胞懸濁液を新鮮な細胞培養フラスコ^(75cm2)に移す。
   5. 37°Cおよび5%CO2で1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したISF-1培地中の細胞を培養および展開し、70%コンフルエントおよび99%生存可能になるまで培養する。これは通常、48 - 72時間後に達成されるはずです。
   6. 細胞を2つの75cm² フラスコに分割します。これを行うには、まず細胞懸濁液を用いて細胞培養フラスコ底/培養表面を洗い流し、全てのNLDC-145細胞を表面から除去する。NLDC-145細胞懸濁液6mLを2本の新鮮な75cm² ボトルのうちの1本に移し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを12 mLまで補充したプリウォームISF-1培地を追加します。
      注:NLDC-145細胞が培地をコンディショインしているので、細胞培養培地を更新しないでください。細胞を培地と一緒に移し、新鮮な培地で所望の体積まで培養液を充填します。これは、NLDC-145細胞による生存率および最大抗体産生にとって極めて重要です。
   7. 細胞培養物を37°Cおよび5%CO2で、48〜72時間後に一般的に達成される約70%のコンフルエントまで拡大する。
   8. 細胞が70%コンフルエントになると、拡張されたNLDC-145細胞懸濁液の10mLを、それぞれ^75cm2ボトルから1つのPETG(ポリエチレンテレフタレートグリコール)ローラーボトル(1,050cm2)に移す。このために、細胞の懸濁液で細胞培養フラスコの底/培養表面を洗い流し、ピペットコントローラと10 mLピペットを用いて表面から全細胞を除去する。
   9. 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに事前に温めた)を加えたISF-1培地を、ローラーボトルを含むNLDC-145のそれぞれに直接培地ボトルから150mLのマークまで充填します。
      注: ステップ 1.1.6 の注を参照してください。
   10. ローラーボトルを37°C、5%CO2、25ラウンド/分で3日間培養します。
   11. ローラーボトルを含むNLDC-145のそれぞれに1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに事前に温め)を加えたISF-1培地150mLを300mLのマークまで充填します。
   12. ローラーボトルを37°C、5%CO2、25ラウンド/分でさらに3日間培養します。
   13. ローラーボトルを含むNLDC-145のそれぞれに1%ペニシリン/ストレプトマイシン(37°Cに事前に温めた)を加えたISF-1培地の別の100 mLを加え、400 mLマークまで充填します。
   14. ローラーボトルは現在、37°Cで400mL培養、5%CO2、25ラウンド/分でさらに7日間培養します。
       注:この週の間に、培養は非常に密(最大95%の密度)になり、生存率は(わずか50%まで)減少し、抗体の最大放出を可能にします。
2. 培養上清からαDEC-205を精製するために、NLDC-145細胞懸濁液(両方のローラーボトルから)を500mLオートクレーブ遠心分離ボトルに直接注ぎます。
   注: 培養量は合計 800 mL にまとめておく必要があります。
   1. 8,600 x g および4°Cで30分間培養して細胞や破片を除去します。
   2. 上清を収集し、ペレットを捨て、滅菌試薬ボトルに上清をプールします。
      注:αDEC-205の精製は、すぐに開始することができます(ステップ2.)または上清は、4°Cで短期保存することができます。

2. NLDC-145細胞上清からのαDEC-205抗体の精製

注:NLDC-145細胞上清からαDEC-205は、タンパク質Gセファローズカラム(再利用可能)を使用して精製されます。カラム寸法は15mm×74mm、5mLタンパク質Gセファローズはカラムごとにパックされています。

1. タンパク質Gセファローズカラムの調製および洗浄のために、タンパク質Gセファローズカラムの上部開口部に気密ゴムプラグを置く。2つの無菌カニューレ(20 G x 1 1/2"、0.90 x 40 mm)でゴムプラグを穿刺します。
   1. 10 mL のシリンジを 2 つのカニューラの 1 つに接続し、2 番目のカニューレにチューブ コネクタを使用して、フレキシブル シリコン チューブ (長さ約 100 cm、直径 2.5 ~ 3 mm) を接続します。
      注:シリンジ/ゴムプラグ構造は再利用可能であり、タンパク質Gセファローズカラムに大量の培養上清の連続的な流れをもたらす真空を提供する。この作業を行うために、シリンジのプランジャーを少し引き戻して、次の手順で連続的な流体の流れを確保します。
   2. 0.1 Mの氷酢酸(pH2)の50 mLでカラムを洗浄し、以前の抗体精製から残っている可能性のある抗体を除去します。シリコンチューブの端を0.1 Mの氷酢酸(pH2)充填試薬ボトルに入れます。誘導真空の結果、0.1Mの氷酢酸(pH2)の50mLがタンパク質Gセファローズカラムを滴下して流れる。
      注:0.1 Mの氷酢酸(pH2)は、試薬ボトルに保管するか、ビーカーで焼き直して保管する必要があります。
   3. 100-200 mL リン酸緩衝生理食塩分(PBS)でカラムを洗浄します。シリコンチューブの端部をPBS充填試薬ボトルまたはビーカーに入れます。100-200 mL PBSはタンパク質Gセファローズカラムを通して滴下します。
2. NLDC-145上清からの抗体精製の場合、NLDC-145上清(ステップ1.2.2から得た)の800 mLをカラムにロードします。シリコンチューブの端をNLDC-145上清充填試薬ボトルに入れます。800 mL NLDC-145 上清をカラムを通してドロップワイズで実行します。
   1. 500 mL の PBS でカラムを洗います。シリコンチューブの端をPBS充填試薬ボトルまたはビーカーに入れます。500 mL PBS をカラムを通してドロップワイズで実行します。
   2. 溶出の場合は、1.5 Mトリス-HCl(pH 8.8)の20個の1.5 mLチューブとピペット100 μLを各1.5 mLチューブに使用します。0.1 Mグリシン(pH3)のカラムとピペット1mLから、タンパク質Gセファローズカラムの上部チャンバーにゴムプラグを取り出し、抗体をカラムから溶出させます。準備された1.5 mLの管の1つに溶出として直接流れ通り収集。
   3. 全20本(1.5mL)の溶出工程(2.2.2.)を繰り返します。
   4. 分光光度計を用いて、抗体含有画分を同定するために、280 nm(OD₂₈₀₎で全溶出画分の光学密度を決定する。
      注: 最初の溶出分数を空白として使用します。
   5. すべての分数を 0.5 より大きい OD₂₈₀ (約 10 分) でプールします。
   6. 20%エタノールを充填したプロテインGセファローズカラムを4°Cで保存してください。
3. 1000 mL PBS(2000 mL ビーカー)に対してプールされた溶出を、分子量が12 - 14 kDaの切り落とし(MWCO)の透析チューブを使用して一晩4°Cで透析します。
   1. 透析チューブを20cmに切ります。ホットプレートを使用して汚染を除去するためにビーカーで30分間、10 mM EDTA(pH 7.5)の500〜800 mLの透析チューブを沸騰させます。10 mM EDTA (pH 7.5) 溶液を廃棄し、透析管を脱イオン水で10分間沸騰させます。
      注:透析チューブは、直接使用するか、次の使用まで4 °Cで0.01%アジドナトリウム(NaN_3)/H2O溶液に保存することができます。
   2. 適切な透析チューブクロージャ/シングルピース、ヒンジ付きクランプ、慎重に抗体溶出を透析チューブにピペットして、透析チューブの底を閉じます。2つ目のクランプで透析管の上部を閉じます。
   3. 透析チューブの上部クランプを浮遊スタンドに固定し、磁気攪拌棒と一緒にPBS充填ビーカーに入れ、ビーカーを磁気スターラーに置きます。
   4. 4°Cで一晩撹拌する透析。
4. αDEC-205の濃度を上げるには、完全な透析液を10 kDa MWCOの遠心濃縮器に積み込みます。チューブの1つのクランプを開き、遠心濃縮器(10 kDa MWCO)に透析管から完全な透析液を慎重にピペットします。
   注:ピペットチップでコンセントレータ底部に触れないでください。
   1. 693 x g (2,000 rpm) と 4 °C で 30 分間の遠心分離機。
   2. 遠心濃縮器にPBSと遠心分離機を10 mL 693 x g(2,000 rpm)、残された抗体溶液の最終体積が1〜1.5mLになるまで4°Cでロードします。
      注: 必要に応じて、2.4.1 の遠心分離手順を繰り返します。をクリックして、目的の量に調整します。
   3. 分光光度計を用いて、280nm(OD280)で濃縮されたαDEC-205溶液の光学密度を決定する。PBS をブランクとして使用します。
   4. 次の式を使用してαDEC-205の濃度を計算します。
      濃度 [mg/mL] = OD₂₈₀/1.4.
   5. 0.22 μmシリンジフィルターユニットを使用して、αDEC-205溶液をフィルター処理します。
      注:NLDC-145ハイブリドーマ細胞上清からのαDEC-205の精製は、FPLC(高速タンパク質液体クロマトグラフィー)でも達成できます。精製されたαDEC-205は、長期保存のために4°Cまたは-18°Cで保存することができます。

3. OVAからαDEC-205への化学的結合

注:最適な化学結合には、0.5 mgのOVAタンパク質と2.5mgのαDEC-205(1:5)の比率が必要です。しかし、この比率は他のタンパク質や抗体に対して異なる可能性があり、代替コンジュゲートに最適化する必要があります。OVAタンパク質のジスルフィド結合の還元は、30 mM TCEP-HClとのインキュベーションを経て行われ、これは、化学的結合のためのスルフヒドリル基をαDEC-205および240 μlのTCEP-HClに曝露するステップ3.2で必要とされている。いずれのステップも、TCEP誘導によるOVAの低減(ステップ3.1)およびαDEC-205のスルホ-SMCC活性化(ステップ3.2.)を、好ましくは並列に行うべきである。

1. 125 mM TCEP-HCl溶液(pH 7.0)を新たに調製します。所望の量の TCEP-HCl を計量し、0.9 M トリス ベース (pH 8.8) で TCEP-HCl を溶解します。pH インジケータストリップを使用して、125 mM TCEP-HCl溶液のpHをテストし(中立である必要があります)、トリスベース(pH 8.8)でpHを調整します。
   1. ピペット200 μL OVAタンパク質溶液(0.5 mg OVAを含む)を1.5 mLの無菌チューブに。ピペットを使用して240 μl 125 mM TCEP-HClと560 μLの無菌超純水をOVAタンパク質に加え、最終濃度の0.5 mg/mL OVAタンパク質と30 mM TCEP-HCl(OVA/TCEP-HCl)を加えます。
      注:2.5 mgのEndoGrade OVA(凍結乾燥)は2.5 mg/mL OVA溶液をもたらす1 mL PBSに溶解される。
   2. 得られた OVA/TCEP-HCl を室温で 1.5 時間インキュベートします。
      注: このインキュベーション手順を拡張しないでください。
2. αDEC-205を結合させるために、2mgのスルフォ-SMCCを100μLの超純水に溶解します。
   注意:スルフォ-SMCCは加水分解の影響を受けやすい。したがって、より多くの未溶解のスルフォ-SMCCを迅速に処理するか、または利用可能な2mgのアリコートを使用する必要があります。
   1. 2.5mgが900μLに含まれるように、PBSでαDEC-205を希釈します。
   2. αDEC-205の2.5mg(900 μL体積、ステップ3.2.1から得られる)と100 μLのスルフォ-SMCC(ステップ3.2から得た)を1.5mLチューブに混合し、合計体積は1mLになります。
   3. 37°Cで30分間、550rpmのαDEC-205/スルフォ-SMCC溶液を加熱ブロックにインキュベートします。
3. これらのインキュベーションの後、過剰なスルホ-SMCCおよびTCEP-HClは脱塩カラム(MWCO 7 kDa;5 mLカラム容積)を使用して溶液から直ちに除去される。
   1. 柱をねじり落とし(MWCO 7 kDa)底部を閉じ、キャップを緩め、柱を15 mLの円錐形チューブに入れます。
   2. 液体を取り除くために室温で1,000 x g で2分間遠心分離機。
   3. カラムを新しいチューブに入れ、キャップを取り外します。抗体/スルフォ-SMCCとOVA/TCEP-HClをそれぞれ1列のコンパクト樹脂ベッドの中央にゆっくりとロードします。
   4. 室温で1,000 x g で2分間遠心分離機。
   5. 使用後に列を破棄します。結合のためにプライミングされた抗体およびOVAを含む溶液は管にある。
   6. αDEC-205とOVAの共役のためにピペット処理により、両溶液をすぐに混合します。
   7. 得られたαDEC-205とOVA混合物を一晩4°Cでインキュベートします。
4. 結合後、過剰な非結合OVAが溶液から除去され、遠心タンパク質濃縮器(MWCO 150kDa)を用いて結合されたαDEC-205/OVAが濃縮される。
   1. 遠心タンパク質濃縮器(MWCO 150 kDa)をカラムに12 mLのPBSをピペット化し、2,000 x g で2分間遠心分離します。
      注: 必要に応じて、約 5 mL の体積が列を通過するまで遠心分離ステップ(3.4.1.)を繰り返します。
   2. αDEC-205/OVAを遠心タンパク質濃縮器にロードする前に、ウェスタンブロット分析のために非濃縮αDEC-205/OVAの20μLサンプルを保存します。分析までこのアリコートを4°Cで保存してください。
   3. αDEC-205/OVAをピペット処理で遠心タンパク質濃縮器に積み込みます。
      注:遠心濃縮器の上部チャンバーのベッドとの接触を避けてください。
   4. コンセントレータをPBSで15mLに充填し、コンセントレータを室温で2,000 x g で5分間遠心分離します。
   5. ウェスタンブロット解析用のフロースルー(フロースルーI)のサンプルを保存し、残りのフロースルーを破棄します。
   6. コンセントレータをPBSで10 mLに充填し、コンセントレータを室温で2,000 x g で少なくとも8分間濃縮器に充填します。
   7. ウェスタンブロット解析用の第2フロースルー(フロースルーII)のサンプルを保存し、残りのフロースルーを破棄します。
   8. 所望の濃縮が達成されたら(αDEC-205/OVA溶液の約1.5 mLは上の部屋に残す必要があります)、濃縮されたサンプルを穏やかに吸引します。
      注:上の部屋にあまりにも多くの流体が残っている場合は、遠心分離を繰り返すことができますが、できるだけ短く保つ必要があります。
5. マイクロボリューム分光光度計を用いて得られたαDEC-205/OVAのタンパク質濃度を決定します。PBS をブランクとして使用します。
6. 0.22 μmシリンジフィルターユニットを使用して、αDEC-205/OVAをフィルターします。
   注意:後での解析および インビボ 実験では、αDEC-205/OVAは4°Cまたは-18°Cで保存することができます。

4. ウェスタンブロットによる化学結合の検証

注意:正常な化学結合の検証のために、OVA(4.2)またはαDEC-205(4.10)のいずれかを検出するウェスタンブロット分析が行われます。OVA(4.2.)またはαDEC-205(4.10.)の検出は並列に行う必要があります。軌道プラットフォームシェーカーは、それぞれの溶液の均一な分布を可能にするために、ウェスタンブロット膜のすべてのインキュベーションステップに好適に使用されるべきである。

1. 標準のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)ゲルをSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)用に調製してください。
2. SDS-PAGE用サンプルを準備して、共役および非共役OVAを検出し、ゲル電気泳動を実行します。
   1. 異なる量の結合されたαDEC-205/OVAを希釈する(例えば、 200、100および50ng)の純粋なOVA(例えば、80、70、60、50、40および30ng)の、非共役αDEC-205(例えば、100および50ng)のアリコート、ステップ3.4.2.2からの非濃縮αDEC-205/OVAコンジュゲートのサンプル。(例えば、125 ng)およびフロースルーIおよびIIのアリコート(ステップ3.4.5.および3.4.7.、それぞれ;任意)の4倍の非還元SDSサンプルバッファー。
      注:コンジュゲートとタンパク質の異なる濃度がロードされ、両方のフリーOVAと共役を同じブロットで検出することができます。
   2. 加熱ブロックでサンプルを10分間、550rpmで65°Cで変性させます。
3. サンプルとプロテイン標準をSDSゲルにロードし、SDS-PAGEを実行します。
4. SDSゲルからメタノール活性化PVDF(ポリビニリデンジフルオリド)膜(75分、125mA)までのタンパク質の標準ブロッティングを行います。
5. ブロッティング後、適切な皿に膜を入れ、4%の食事交換シェイクパウダー/TBS-T(トリス緩衝生理食い物/0.1%Tween 20)の25 mLを膜を含むディッシュにブロッキングバッファーをピペット化して膜をブロックします。
   1. 膜を遮断液中で、室温で60分間、または4°Cで一晩インキュベートします。
6. ブロッキング溶液を廃棄し、ウサギαOVA一次抗体を2%の食事交換シェイクパウダー/TBS-T抗体バッファー(希釈1:3,000)で膜を汚し、15mLの一次抗体溶液を皿中の膜にピペット化します。
   1. 膜を室温で45分間、または4°Cで一晩インキュベートします(プラットフォームシェーカーを使用)。
7. 抗体溶液を廃棄し、皿の中で膜を洗浄します(プラットフォームシェーカーを使用してください)。
   1. 膜に25mLのTBS-Tを加え、5分間インキュベートします。ソリューションを破棄します。
   2. 膜に25mLのTBS-T/0.5 M NaClを加え、5分間インキュベートします。ソリューションを破棄します。
   3. 25 mLの TBS-T/0.5% トリトン X-100 を膜に加え、5 分間インキュベートします。ソリューションを破棄します。
   4. 膜に25mLのTBS-Tを加え、5分間インキュベートします。ソリューションを破棄します。
8. ヤギαrabbit-IgG-HRPO(馬根ペルオキシダーゼ)二次抗体を2%の食事交換シェイクパウダー/TBS-T抗体バッファー(希釈液1:2,000)で膜を染色し、15mLの二次抗体溶液を皿中の膜にピペット化した。
   1. 膜を室温で45分間、または4°C(プラットフォームシェーカー)で一晩インキュベートします。
9. ステップ4.7.1-4.7.4に記載されているように、膜を再度洗浄する。プラットフォームシェーカーを使用しています。この膜については、次にステップ4.16を続けます。(次の手順 4.10. - 4.15.(αDEC-205の検出)は、ステップ4.2.-4.9と並行して行うことができる。
10. SDS-PAGE用αDEC-205の検出用サンプルを用意し、ゲル電気泳動を実行します。
    1. αDEC-205/OVAの異なる量(例えば、200、100および50 ng)の希釈は、非共役αDEC-205(例えば、250、125、62.5ng)の純粋なOVA(例えば、80および70ng)の、非濃縮αDEC-20-205のサンプルである。OVA 4.4.4ステップから2.4.4ステップからαDEC-205/4.4のサンプルである。(例えば、125 ng)およびフロースルーIおよびIIのアリコート(ステップ3.4.5.および3.4.7.、それぞれ;任意)の4倍の非還元SDSサンプルバッファー。
    2. 加熱ブロックでサンプルを10分間、550rpmで65°Cで変性させます。
11. サンプルとプロテインスタンダードをSDSゲルにロードし、ゲル電気泳動を実行します。
12. SDSゲルからメタノール活性化PVDF(ポリビニリデンジフルオリド)膜(75分、125mA)までのタンパク質の標準ブロットを行う。
13. ブロッティング後、適切な皿に膜を入れ、膜を含む皿に10%ブロッキングバッファー(粉ミルク/TBS-T)の25 mLをピペット化して膜をブロックします。
    注意:ブロックソリューションは、αDEC-205とOVA検出(ステップ4.5)の間で異なります。
    1. 膜を遮断液中で、室温で60分間、または4°Cで一晩(プラットフォームシェーカーを使用)インキュベートします。
14. ブロック溶液を廃棄し、粉末15mLの抗体溶液を皿中の膜にピペット化して、5%粉乳/TBS-T抗体バッファー(希釈液1:5,000)にヤギαrat-IgG(H+L)-HRPO抗体を用いて膜を染色します。
    注意:抗体バッファーはαDEC-205検出とOVA検出の間で異なります(ステップ4.6./ 4.8)。
    1. 膜を室温で45分間、または4°Cで一晩インキュベートします(プラットフォームシェーカーを使用)。
15. 手順 4.7.1- 4.7.4 に記載されているように、皿の中で膜を十分に洗います。(プラットフォームシェーカーを使用してください)。
16. 適切な検出試薬を使用してHRP信号を発達させ、X線フィルムまたはイメージングシステムを使用して暗室で化学発光を検出します。

5. ELISAによる化学結合の検証

1. αDEC-205/OVAに至る化学結合の成功のさらなる検証のためにELISAを行う。
2. コーティングバッファーに適切な 96 ウェル ELISA プレートに 3 ng/μL ウサギ αOVA 抗体 (0.1 M 重炭酸ナトリウム (NaHCO₃₎pH 9.6 を H₂O で希釈してコーティングします。
   1. プレートを4°Cで一晩インキュベートする。
3. コーティング後、プレートをPBSで3回洗浄し、例えば、ELISAワッシャーを使用する。
4. プレートの各ウェルに200μLのブロッキングバッファー(PBSで10%FCS)をピペット処理してプレートをブロックし、室温で30分間プレートをインキュベートします。
5. αDEC-205/OVA(ステップ3.6.から得られた)1:2のブロッキングバッファ(PBSでは10%FCS)を連続希釈し、6 μg/mLから93.8 ng/mL αDEC-205/OVAまでの希釈を取得し、これらの減少量の100 μL/wellをウェルに加える。
   1. プレートを室温で1時間インキュベートします。
6. プレートをPBSで3回洗浄し、例えば、ELISAウォッシャーを使用する。
7. 100 μLのヤギαrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO抗体(ブロッキングバッファー(PBSでは10%FCS)で1:200に希釈)をプレートの各ウェルに加えます。
   1. 室温で1時間インキュベートする。
8. PBSを用いてプレートを3回洗浄し、例えばELISAウォッシャーを使用する。
9. 50 μLのHRPO基板をウェルに加えます。透明な色の反応を観察する場合は、1ウェルあたり150μl停止溶液(1M_H2SO4)を添加して反応を停止します。
10. 5分後、ELISAリーダーを用いて450nmで吸収を読み取る。

結果

このプロトコルを用いたαDEC-205のOVAタンパク質への化学的結合は、通常、インビボDCターゲティングアプローチに対するαDEC-205/OVAの効率的な生成を可能にする。技術自体を検証し、降伏した共役の機能性をテストするためのさまざまな戦略があります。ウェスタンブロット分析とELISAは、正常な結合を検証すると同時に、潜在的に残された空きOVAを検出するた?...

ディスカッション

エンドサイトーシス受容体特異的抗体およびタンパク質抗原の化学的結合は、前臨床マウスモデル におけるインビボ DCターゲティングに対する効率的かつ、重要な、柔軟なアプローチを提供する。我々のプロトコルにより、モデル抗原OVAをDEC-205特異的IgG抗体にうまく結合するための効率的なアプローチを提供します。

本プロトコルでは、αDEC-205はハイブリドーマ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
antibody buffer 2 %			2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 %			5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA)			10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 %			4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 %			10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25	Greiner Bio-One	690175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75	Greiner Bio-One	658175	we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)
cell culture flask T175	Greiner Bio-One	661175	we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa	Sartorius	VS2001	Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	88532	Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available
centrifuge bottles	Nalgene	525-2314	PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA)			0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	89891	Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate)	Roche/Merck	12 015 200 01	Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa	SERVA Electrophoresis	44110	Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate	Thermo Fisher Scientific	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Good forte
ISF-1 medium	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
milk powder	Carl Roth	T145.2	powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma	ATCC	HB-290	if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x			for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin	Hyglos (via BioVendor)	321000	EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles	Nunc In Vitro	734-2394	standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany
pH indicator strips	Merck	109535	pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	112-035-062	obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot)	Jackson ImmunoResearch	111-035-045	obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA)	Abcam	ab181688	used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot)	OriGene	R1101	used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column	Merck/Millipore	P3296	5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane	Merck/Millipore	IPVH00010	immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug	Omnilab	5230217	DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast			we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA)			1M H2SO4
sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	22322	Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
syringe 10 ml	Omnilab		Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T			Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	A35349
tubing connector	Omnilab		Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube