JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكول لتحديد وكمية الفئات الرئيسية من الأيض للذوبان في الماء في الخميرة Saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة. فإنه يسمح فصل ايزومرات الهيكلية وأشكال ستيريويسوميريك من الأيض للذوبان في الماء من بعضها البعض.

Abstract

الأيض هو منهجية تستخدم لتحديد وتحديد كمي من العديد من وسيطات الوزن الجزيئي المنخفض ومنتجات التمثيل الغذائي داخل الخلية أو الأنسجة أو الأعضاء أو السوائل البيولوجية أو الكائن الحي. يركز الميتابوميك تقليديا على الأيض القابل للذوبان في الماء. المستقلب القابل للذوبان في الماء هو المنتج النهائي لشبكة خلوية معقدة تدمج مختلف العوامل الجينومية، الجينومية، النسخية، البروتيومية، والبيئية. وبالتالي، فإن التحليل الأيضي يقيم مباشرة نتيجة العمل لجميع هذه العوامل في عدد كبير من العمليات البيولوجية داخل الكائنات الحية المختلفة. واحدة من هذه الكائنات الحية هي الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae، وهو eukaryote أحادي الخلية مع الجينوم تسلسل كامل. لأن S. cerevisiae قابلة للتحليلات الجزيئية الشاملة ، يتم استخدامه كنموذج لتشريح الآليات الكامنة وراء العديد من العمليات البيولوجية داخل الخلية eukaryotic. ومن شأن اتباع طريقة تحليلية متعددة الاستخدامات للتقييم الكمي القوي والحساس والدقيق للميبولوم القابل للذوبان في الماء أن يوفر المنهجية الأساسية لتشريح هذه الآليات. هنا نقدم بروتوكولا للظروف الأمثل من النشاط الأيضي في إرواء واستخراج المستقلب للذوبان في الماء من خلايا S. cerevisiae. ويصف البروتوكول أيضا استخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للميثابات المستخلصة القابلة للذوبان في الماء. طريقة LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة الموصوفة هنا متعددة الاستخدامات وقوية. وهو يتيح تحديد وتحديد كمي لأكثر من 370 المستقلبات القابلة للذوبان في الماء مع خصائص هيكلية ومادية وكيميائية متنوعة، بما في ذلك إيزومرات هيكلية مختلفة وأشكال ستيريويسوميريك من هذه الأيضات. وتشمل هذه الأيض جزيئات مختلفة الناقل الطاقة, النيوكليوتيدات, الأحماض الأمينية, السكريات الأحادية, وسيطة من انحلال الجليكوليسيس, ووسيطة دورة tricarboxylic. طريقة LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض الأيضات القابلة للذوبان في الماء بتركيزات منخفضة يصل إلى 0.05 pmol/μL. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لتقييم الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة البرية من نوع ومتحولة المستزرعة في ظل ظروف مختلفة.

Introduction

الأيضات القابلة للذوبان في الماء هي وسيطة منخفضة الوزن الجزيئي ومنتجات التمثيل الغذائي التي تساهم في العمليات الخلوية الأساسية. وتشمل هذه العمليات المحفوظة تطوريا تحويل المواد الغذائية إلى طاقة قابلة للاستخدام، وتركيب الجزيئات الكبيرة، والنمو الخلوي والإشارات، والسيطرة على دورة الخلية، وتنظيم التعبير الجيني، والاستجابة للإجهاد، وتنظيم ما بعد الترجمة من التمثيل الغذائي، والحفاظ على وظائف الميتوكوندريا، والاتجار الخلوي المركبات، autophagy، الشيخوخة الخلوية، وتنظيم موت الخلية1،2،3.

وقد تم اكتشاف العديد من هذه الأدوار الأساسية من الأيض للذوبان في الماء من قبل الدراسات في الخميرة الناشئة S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. هذا eukaryote أحادي الخلية هو كائن نموذجي مفيد لتشريح الآليات التي من خلالها الأيض القابل للذوبان في الماء تساهم في العمليات الخلوية بسبب قابليتها للالمتقدمة البيوكيميائية والوراثية والجزيئية التحليلات البيولوجية23،24،25،26. على الرغم من أن أساليب LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة قد استخدمت لدراسة أدوار الأيض القابل للذوبان في الماء في الخميرة الناشئة3،18،22،27، يتطلب هذا النوع من التحليل تحسين براعة ، متانة ، حساسية ، والقدرة على التمييز بين مختلف الايزومرات الهيكلية والأشكال المجسمة لهذه الأيضات.

وتتميز السنوات الأخيرة من التقدم الكبير في تطبيق أساليب LC-MS/MS من الأيض غير المستهدفة إلى التنميط من الأيض للذوبان في الماء في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال العديد من التحديات في استخدام هذه المنهجية2،28،29،30،31،32،33،34،35،36. وتشمل هذه التحديات ما يلي: أولا، تركيزات داخل الخلايا من العديد من الأيضات القابلة للذوبان في الماء هي أقل من عتبة الحساسية للطرق المستخدمة حاليا. ثانيا، كفاءة إرواء النشاط الأيضي منخفضة جدا، ومدى تسرب الخلايا المرتبطة بإرواء الأيض داخل الخلايا مرتفع جدا بالنسبة للطرق الحالية؛ وبالتالي، فإن الأساليب المستخدمة حاليا أقل تقدير تركيزات داخل الخلايا من الأيض للذوبان في الماء. ثالثا، لا يمكن للأساليب القائمة أن تميز بين الأيزومرات الهيكلية (أي الجزيئات ذات الصيغة الكيميائية نفسها ولكن الاتصال الذري المختلف) أو الجسيمات المجسمة (أي الجزيئات ذات الصيغة الكيميائية نفسها والاتصال الذري، ولكن مع الترتيب الذري المختلف في الفضاء) لمييضات محددة؛ وهذا يمنع التعليق التوضيحي الصحيح لبعض الأيضات بالطرق المستخدمة حاليا. رابعا، إن قواعد البيانات الطيفية الكتلية الموجودة على الإنترنت للتوابع الأصلية (MS1) والأيونات الثانوية (MS2) غير مكتملة؛ وهذا يؤثر على تحديد الصحيح والكمية من الأيض محددة باستخدام البيانات الخام LC-MS / MS المنتجة بمساعدة الأساليب الحالية. خامسا، لا يمكن استخدام الطرق القائمة نوع واحد من استخراج المستقلب لاسترداد جميع أو معظم فئات الأيض للذوبان في الماء. سادسا، لا يمكن استخدام الطرق الموجودة نوع واحد من العمود LC لفصل عن بعضها البعض جميع أو معظم فئات الأيض للذوبان في الماء.

هنا، ونحن الأمثل الظروف لإرواء النشاط الأيضي داخل خلايا S. cerevisiae، والحفاظ على معظم الأيض للذوبان في الماء داخل هذه الخلايا قبل الاستخراج، واستخراج معظم فئات الأيض للذوبان في الماء من خلايا الخميرة. طورنا طريقة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة لتحديد وتحديد كمية أكثر من 370 استقلاب قابل للذوبان في الماء مستخرج من خلايا S. cerevisiae. هذه الطريقة من الأيض غير المستهدفة تمكن من تقييم تركيزات داخل الخلايا من جزيئات الناقل الطاقة المختلفة, النيوكليوتيدات, الأحماض الأمينية, السكريات الأحادية, وسيطة من انحلال الجليكوليسيس, ووسيطة دورة tricarboxylic. تسمح طريقة LC-MS/MS المطورة بتحديد وتحديد كمي لمختلف الأيزومرات الهيكلية والأشكال المجسمة من الأيضات القابلة للذوبان في الماء ذات الخصائص الهيكلية والفيزيائية والكيميائية المتنوعة.

Protocol

1. صنع وتعقيم وسيلة لزراعة الخميرة

  1. جعل 180 مل من استخراج الخميرة كاملة مع bactopeptone (YP) المتوسطة. المتوسطة كاملة YP يحتوي على 1٪ (ث / الخامس) استخراج الخميرة و 2٪ (ث / الخامس) bactopeptone.
  2. توزيع 180 مل من المتوسط YP بالتساوي في أربع قوارير Erlenmeyer 250 مل. كل من هذه القوارير يحتوي على 45 مل من المتوسط YP.
  3. تعقيم قوارير مع المتوسطة YP عن طريق الالاستعباد التلقائي في 15 psi/121 °C لمدة 45 دقيقة.

2. سلالة الخميرة البرية من نوع

  1. استخدام BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) سلالة.

3. الخميرة المتنامية في المتوسط YP تحتوي على الجلوكوز 2٪

  1. تعقيم محلول مخزون 20٪ (ث / v) من الجلوكوز عن طريق الالاستعباد التلقائي في 15 psi/121 °C لمدة 45 دقيقة.
  2. إضافة 5 مل من محلول الأسهم autoclaved 20٪ (ث / v) من الجلوكوز إلى كل من قوارير Erlenmeyer اثنين مع 45 مل من المتوسط YP المعقمة. نسبة السكر في التركيز النهائي في متوسط YP هي 2٪ (ث/v).
  3. استخدام حلقة الميكروبيولوجية لتطعيم خلايا الخميرة في كل من قوارير Erlenmeyer اثنين مع المتوسط YP التي تحتوي على الجلوكوز 2٪.
  4. تنمو خلايا الخميرة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في شاكر التناوب تعيين في 200 دورة في الدقيقة.
  5. اتخاذ aliquot من ثقافة الخميرة. تحديد العدد الإجمالي لخلايا الخميرة لكل مل من الثقافة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.

4. نقل الخلية إلى الخلية وينمو في المتوسط YP مع الجلوكوز 2٪

  1. إضافة 5 مل من محلول الأسهم المعقم 20٪ (ث / v) من الجلوكوز إلى كل من قوارير Erlenmeyer المتبقية مع وسيط YP المعقم. التركيز النهائي للجلوكوز هو 2٪ (ث / v).
  2. نقل حجم ثقافة الخميرة بين عشية وضحاها في المتوسط YP مع الجلوكوز 2٪ الذي يحتوي على العدد الإجمالي لل5.0 × 107 خلايا في كل من قوارير Erlenmeyer اثنين مع المتوسطة YP التي تحتوي على الجلوكوز 2٪. استخدام ماصة معقمة لنقل الخلية.
  3. تنمو خلايا الخميرة لمدة 24 ساعة على الأقل (أو أكثر، إذا كانت التجربة تتطلب) في 30 درجة مئوية في شاكر التناوب تعيين في 200 دورة في الدقيقة.

5. صنع الكواشف، وإعداد المختبرات، وإعداد معدات لإرواء الخلايا

  1. إعداد ما يلي: 1) محلول إخماد (60٪ عالية الجودة (>99.9٪) الميثانول في 155 mM الأمونيوم بيكربونات (ABC) العازلة، درجة الحموضة = 8.0)؛ 2) حل ABC الجليد الباردة (درجة الحموضة = 8.0)؛ 3) ميزان الحرارة الرقمية قادرة على قياس ما يصل إلى -20 درجة مئوية؛ 4) 500 مل زجاجات الطرد المركزي الكبيرة؛ 5) جهاز طرد مركزي عالي السرعة مبرد مسبقا مع دوار مبرد مسبقا وزجاجات طرد مركزي مبردة مسبقا سعة 500 مل لهذا الدوار ، كل ذلك عند -5 درجة مئوية ؛ 6) أنابيب استخراج المستقلب (15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج عالية السرعة مع قبعات مبطنة البوليتيترافلوروإيثيلين); و 7) الجليد الجاف.

6. خلية التبريد

  1. استخدام مقياس الدم لتحديد عدد خلايا الخميرة لكل مل من YP مع 2٪ ثقافة الجلوكوز.
  2. نقل حجم الثقافة في المتوسط YP مع 2٪ الجلوكوز الذي يحتوي على العدد الإجمالي لل5.0 × 108 خلايا في زجاجات الطرد المركزي 500 مل المبردة مسبقا.
  3. ملء بسرعة زجاجة الطرد المركزي التي تحتوي على خلايا تصل إلى حجم 200 مل مع محلول التبريد المخزنة في -20 درجة مئوية.
  4. طرد مركزي الزجاجات في جهاز طرد مركزي عالي السرعة في 11,325 x g لمدة 3 دقائق في -5 درجة مئوية.
  5. بسرعة وبحنان استرداد زجاجة من الطرد المركزي؛ فك بلطف الغطاء وإزالة supernatant دون إزعاج بيليه.
  6. إعادة إنفاق بيليه الخلية بسرعة في 10 مل من الجليد الباردة ABC العازلة ونقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الزجاج عالية السرعة 15 مل مع غطاء مبطن البوليتيترافلوروإيثيلين لاستخراج المستقلب.
  7. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي سريري في 3000 x g لمدة 3 دقائق عند 0 درجة مئوية.
  8. إزالة بسرعة supernatant ووضع أنبوب على الجليد الجاف لبدء استخراج المستقلب أو تخزين الأنبوب في -80 درجة مئوية حتى استخراج.

7. إعداد الكواشف، ومختبرات ومعدات لاستخراج المستقلب

  1. إعداد ما يلي: 1) الكلوروفورم LC-MS الصف؛ 2) LC-MS الصف الميثانول؛ 3) LC الصف نانو نقية المياه؛ 4) درجة LC-MS (ACN)؛ 5) الخرز الزجاجي (حمض غسلها، 425-600 ميكرومتر)؛ 6) دوامة مع طقم حامل أنبوب رغوة مع التجنيب؛ 7) 15 مل أنابيب الطرد المركزي الزجاج عالية السرعة مع قبعات مبطنة البوليتيترافلوروإيثيلين؛ 8) قوارير MS؛ 9) الجليد الجاف؛ و 10) أنابيب 1.5 مل غسلها مرة واحدة مع الإيثانول، مرة واحدة مع ACN ومرة واحدة مع نانو نقية المياه.
    ملاحظة: استخدم فقط نصائح micropipette والأنابيب المصنوعة من البولي بروبلين المقاوم للمذيبات العضوية.

8. استخراج ميتابوليت

  1. إلى الأيض أبقى على الجليد الجاف أو المخزنة في أنبوب -80 درجة مئوية من الخطوة 6.7، إضافة ما يلي: 1) 2 مل من الكلوروفورم المخزنة في -20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية؛ 2 مل من الكلوروفورم. 2) 1 مل من الميثانول المخزنة في -20 درجة مئوية؛ 3) 1 مل من الجليد الباردة نانو نقية المياه؛ و 4) 200 ميكرولتر من حبات الزجاج المغسولة بالأحماض 425-600 ميكرومتر.
  2. تغطية وإغلاق فم أنبوب مع رقائق الألومنيوم. ضع أنابيب في طقم حامل أنبوب رغوي مع التجنيب ودوامة لهم لمدة 30 دقيقة بسرعة متوسطة (أي في سرعة التي يتم تعيينها في 6، مع 12 كونها السرعة القصوى للدوامة) في 4 درجة مئوية لتسهيل استخراج المستقلب.
  3. احتضان أنبوب لمدة 15 دقيقة على الجليد (وليس الجليد الجاف!) لتعزيز هطول الأمطار البروتين وفصل المائية العليا من المرحلة العضوية السفلى.
  4. طرد مركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري في 3000 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية. تسمح خطوة الطرد المركزي هذه بفصل المرحلة المائية العليا (التي تحتوي على نواتج الأيض القابلة للذوبان في الماء) عن الطبقة الوسطى (التي تحتوي على حطام الخلايا والبروتينات) ومن المرحلة العضوية السفلية (التي تحتوي في الغالب على الدهون).
  5. استخدم ميكروباينيت لنقل المرحلة المائية العليا (400 ميكرولتر) إلى أنبوب مغسول ومسمي 1.5 مل يحتوي على 800 ميكرولتر من ACN تم تخزينه عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيكون هناك هطول الأمطار سحابة بيضاء بعد إضافة المرحلة المائية العليا إلى ACN أبقى في -20 درجة مئوية.
  6. طرد مركزي أنبوب مع العينة في جهاز الطرد المركزي الطاولة في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: سوف تختفي هطول الأمطار سحابة بيضاء بعد الطرد المركزي.
  7. نقل 800 ميكرولتر من الجزء العلوي من السائل في الأنبوب إلى قارورة MS المسماة. تخزين العينة عند 0 درجة مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة LC-MS/MS.

9. إعداد الكواشف، ومختبرات، ومعدات لLC

  1. إعداد ما يلي: 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة؛ 1) دوامة 2) سونيكاتور بالموجات فوق الصوتية؛ 3) MS الزجاج قارورة؛ 4) نظام LC مجهزة مضخة ثنائية، ديجاسر، وautautsampler؛ 5) عمود كروماتوغرافيا المرحلة zwitterionic (5 ميكرومتر البوليمر، 150 × 2.1 ملم) اسمه في جدول المواد؛ 6) سخان العمود؛ و7) مراحل متنقلة، بما في ذلك المرحلة A (5:95 ACN: المياه (v/v) مع خلات الأمونيوم 20 mM، درجة الحموضة = 8.0) والمرحلة B (ACN 100٪).

10. فصل الأيض المستخرج من LC

  1. إخضاع محتوى قارورة MS إلى سونيكيشن بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
  2. دوامة قارورة MS 3x لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. ضع قارورة التصلب المتعدد في لوحة البئر.
  4. أثناء التصوير اللوني، حافظ على العمود عند 45 درجة مئوية ومعدل تدفق 0.250 مل/دقيقة. احتفظ بالعينة في لوحة البئر عند 0 درجة مئوية. راجع الجدول 1 للتدرجات LC التي تحتاج إلى استخدام أثناء الكروماتوغرافيا.
    ملاحظة: يظهر في الشكل 1رسم لوني أيوني إجمالي تمثيلي للمثيلات القابلة للذوبان في الماء التي تم استخراجها من خلايا السلالة البرية BY4742. تم تحديد الأيضات التي فصلها LC وقياسها كميا من خلال التحليل الطيفي الكتلي الذي تم إجراؤه في وضع التأين الإيجابي [ESI (+)] ، كما هو موضح للخطوة 11.

11. التحليل الطيفي الشامل من الأيض مفصولة LC

  1. استخدم مطياف كتلة مجهز بتأين الرذاذ الكهربائي الساخن (HESI) لتحديد وكمية الأيضات القابلة للذوبان في الماء التي تم فصلها بواسطة LC. استخدم محلل مطياف الكتلة لأيونات MS1 وكاشف مطياف الكتلة لأيونات MS2. استخدم الإعدادات المتوفرة في الجدول 2 والجدول 3 للحصول على أيونات MS1 وMS2 المعتمدة على البيانات على التوالي.
  2. استخدم حجم عينة من 10 ميكرولتر للحقن في وضعي ESI (+) وESI (-).

12. تحديد وكمية من الأيض المختلفة عن طريق معالجة البيانات الخام من LC-MS/MS

  1. استخدام البرنامج المسمى في جدول المواد لإجراء تحديد وكمية من الأيضات القابلة للذوبان في الماء مختلفة من ملفات LC-MS/MS الخام. يستخدم هذا البرنامج MS1 لكمية المستقلب وMS2 لتحديد المستقلب. يستغل البرنامج مكتبة التجزئة الطيفية الطيفية الشاملة الأكثر تنسيقا لشرح المستقلبات باستخدام البيانات الخام LC-MS/MS من خلال مطابقة أطياف MS. يستخدم هذا البرنامج أيضا الكتلة الدقيقة ل MS1 ومطابقة نمط النظائر لشرح الأيض باستخدام قواعد البيانات عبر الإنترنت. انظر الشكل 2 للاطلاع على التفاصيل.
  2. استخدام مكتبة قواعد البيانات والأطياف، والتي تتوفر بحرية على الانترنت (https://www.mzcloud.org)، للبحث عن أطياف MS2 من البيانات الخام.

13. فحص سلامة الغشاء بواسطة البروبيديوم يوديد (PI) تلطيخ ومجهر مضان

  1. بعد إخماد الخلية تنفيذها كما هو موضح للخطوة 6، غسل الخلايا المروية جيدا مع 15 مل من العازلة ABC لإزالة محلول التبريد. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 5 دقائق في 0 درجة مئوية.
  2. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من العازلة ABC وإضافة 0.5 مل من الحل PI (0.5 ملغ / مل).
  3. دوامة أنبوب مع عينة 3x لمدة 10 ق واحتضانه لمدة 10 دقيقة في الظلام وعلى الجليد.
  4. طرد مركزي أنبوب مع العينة في جهاز الطرد المركزي الطاولة في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  5. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 1 مل من العازلة ABC.
  6. طرد مركزي أنبوب في 13400 س غ لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant. كرر هذه الخطوة 2 مرات أخرى لإزالة PI منضم إلى سطح الخلية.
  7. Resuspend بيليه في 300 ميكرولتر من العازلة ABC. ضع 10 ميكرولتر من التعليق على سطح شريحة المجهر.
  8. التقط تباين التداخل التفاضلي (DIC) وصور المجهر الفلوري مع مجهر مضان. استخدم مرشح تم إعداده عند أطوال موجية من الإثارة والانبعاثات من 593 نانومتر و 636 نانومتر (على التوالي).
  9. استخدم برنامجا لحساب إجمالي عدد الخلايا (في وضع DIC) وعدد الخلايا الملونة الفلورية. أيضا، استخدم هذا البرنامج لتحديد كثافة تلطيخ للخلايا الفردية.

النتائج

لتحسين التقييم الكمي للنواتج الأيضية القابلة للذوبان في الماء داخل خلية الخميرة، قمنا بتحسين ظروف إخماد الخلايا للكشف عن المستقلب. خلية إرواء لهذا الغرض ينطوي على اعتقال سريع لجميع ردود الفعل الأنزيمية داخلالخلية 31،33،37

Discussion

لاستخدام البروتوكول الموضح هنا بنجاح، اتبع التدابير الوقائية الموضحة أدناه. الكلوروفورم والميثانول استخراج مواد مختلفة من البلاستيك المختبري. لذلك، التعامل معها بحذر. تجنب استخدام البلاستيك في الخطوات التي تنطوي على الاتصال مع أي من هذه المذيبات العضوية اثنين. استخدام ماصة الزجاج borosilic...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تيتورينكو على المناقشات. ونعترف بمركز التطبيقات البيولوجية لقياس الطيف الكتلي، ومركز الجينوم الهيكلي والوظيفي، ومركز الفحص المجهري والتصوير الخلوي (وكلها في جامعة كونكورديا) للخدمات المتميزة. وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من مجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (RGPIN 2014-04482 وCRDPJ 515900 - 17). حصل ك.M على دعم زمالة أرشامبولت بجامعة كونكورديا وجائزة عميد الآداب والعلوم في جامعة كونكورديا للتميز.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved