液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

要約

我々は、酵母 サッカロミセスセレビシエにおける水溶性代謝産物の主要クラスの同定と定量のためのプロトコルを提示する。記載された方法は、汎用性、堅牢性、および高感度です。これは、構造異性体と水溶性代謝物の立体異性体の分離を可能にします。

要約

メタボロミクスは、細胞、組織、臓器、生体、または生物内の多くの低分子中間体および代謝産物の同定と定量に使用される方法論である。メタボロミクスは伝統的に水溶性代謝産物に焦点を当てています。水溶性のメタボロメは、様々なゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および環境因子を統合する複雑な細胞ネットワークの最終生成物です。したがって、メタボロミック分析は、様々な生物内の生物学的プロセスの多くのこれらの要因の作用の結果を直接評価する。これらの生物の一つは、出芽酵母 サッカロミセスセレビシエ、完全に配列されたゲノムを持つ単細胞真核生物です。 S.cerevisiae は包括的な分子解析に適しているため、真核細胞内の多くの生物学的プロセスの根底にあるメカニズムを解剖するモデルとして使用されています。水溶性のメタボロムの堅牢で、敏感で、正確な定量的評価のための多目的な分析方法は、これらのメカニズムを解剖するための不可欠な方法論を提供するであろう。ここでは 、S.セレビシエ 細胞からの代謝活性の活性化および水溶性代謝産物抽出の最適化条件に関するプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、抽出された水溶性代謝産物の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と結合された液体クロマトグラフィーの使用を記述する。ここで説明する非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法は、汎用性と堅牢性があります。それはこれらの代謝物の異なった構造異性体および立体異性体形態を含む多様な構造、物理的、および化学的特性を有する370以上の水溶性代謝産物の識別そして定量化を可能にする。これらの代謝産物は、種々のエネルギー担体分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体を含む。LC-MS/MS法は、非標的メタボロミクスの感度が高く、0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝物の同定と定量を可能にします。この方法は、異なる条件下で培養した野生型および変異酵母細胞の水溶性メタボロメの評価に成功して使用されている。

概要

水溶性代謝産物は、低分子の中間体であり、必須の細胞プロセスに寄与する代謝産物です。これらの進化的に保存されたプロセスには、栄養素の使用可能エネルギーへの変換、高分子の合成、細胞増殖およびシグナル伝達、細胞周期制御、遺伝子発現調節、ストレス応答、代謝の翻訳後調節、ミトコンドリア機能の維持、静脈細胞密売、オートファジー、細胞老化、および調節細胞死^1、2、3が含まれる。

水溶性代謝産物のこれらの本質的な役割の多くは、出芽酵母S.cerevisiae^{1、3、4、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22}の研究によって発見されています。^....

プロトコル

1. 酵母を育てる培地を製造し、殺菌する

1. 完全な酵母エキスの180 mLをバクトペプトン(YP)培地で作ります。完全なYP培地は、1%(w / v)酵母エキスと2%(w / v)バクトペプトンが含まれています。
2. 180 mLのYP培地を4つの250 mLのエルレンマイヤーフラスコに均等に分配します。これらのフラスコのそれぞれは、YP培地の45 mLを含む。
3. 15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、YP培地でフラスコを殺菌します。

2. 野生型酵母菌株

1. BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)株を使用します。

3. 2%グルコースを含むYP培地中の酵母の成長

1. 15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、グルコースの20%(w/v)ストック溶液を殺菌します。
2. 45 mLの滅菌されたYP培地を用いて、2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれにグルコースのオートクレーブ20%(w/v)ストック溶液の5 mLを加えます。YP培地中の最終濃度グルコースは2%(w/v)である。
3. 2%グルコースを含むYP培地で、酵母細胞を2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに接種する....

結果

酵母細胞内の水溶性代謝産物の定量的評価を改善するために、代謝産物検出のための細胞焼入れ条件を最適化した。この目的のための細胞の焼入れは^{、細胞31、33、37、38}内のすべての酵素反応の迅速な逮捕^を伴^う。このような細胞代謝活性の停止は、生体内の水溶?.......

ディスカッション

ここで説明するプロトコルを正常に使用するには、以下に説明する予防措置に従ってください。クロロホルムとメタノールは、実験室のプラスチック製品から様々な物質を抽出します。したがって、慎重にそれらを処理します。これら2つの有機溶剤と接触するステップでのプラスチックの使用を避けてください。これらのステップには、ホウケイ酸ガラスピペットを使用してください。使用.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
L-histidine	Sigma	H8125
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Propidium iodide	Thermo Scientific	R37108
Uracil	Sigma	U0750
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles	Beckman	355664
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Beckman Coulter Centrifuge	Beckman	6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor	Beckman	JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Digital thermometer	Omega	HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer	Thermo Scientific	02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)	Sigma Milipore	150460
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Vortex	Fisher Scientific	2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm	Agilent Technologies	883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)	Sigma-Aldrich	G8772
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
Software
Compound Discoverer 3.1	Fisher Scientific	V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049