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要約

我々は、酵母 サッカロミセスセレビシエにおける水溶性代謝産物の主要クラスの同定と定量のためのプロトコルを提示する。記載された方法は、汎用性、堅牢性、および高感度です。これは、構造異性体と水溶性代謝物の立体異性体の分離を可能にします。

要約

メタボロミクスは、細胞、組織、臓器、生体、または生物内の多くの低分子中間体および代謝産物の同定と定量に使用される方法論である。メタボロミクスは伝統的に水溶性代謝産物に焦点を当てています。水溶性のメタボロメは、様々なゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオミクス、および環境因子を統合する複雑な細胞ネットワークの最終生成物です。したがって、メタボロミック分析は、様々な生物内の生物学的プロセスの多くのこれらの要因の作用の結果を直接評価する。これらの生物の一つは、出芽酵母 サッカロミセスセレビシエ、完全に配列されたゲノムを持つ単細胞真核生物です。 S.cerevisiae は包括的な分子解析に適しているため、真核細胞内の多くの生物学的プロセスの根底にあるメカニズムを解剖するモデルとして使用されています。水溶性のメタボロムの堅牢で、敏感で、正確な定量的評価のための多目的な分析方法は、これらのメカニズムを解剖するための不可欠な方法論を提供するであろう。ここでは 、S.セレビシエ 細胞からの代謝活性の活性化および水溶性代謝産物抽出の最適化条件に関するプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、抽出された水溶性代謝産物の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と結合された液体クロマトグラフィーの使用を記述する。ここで説明する非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法は、汎用性と堅牢性があります。それはこれらの代謝物の異なった構造異性体および立体異性体形態を含む多様な構造、物理的、および化学的特性を有する370以上の水溶性代謝産物の識別そして定量化を可能にする。これらの代謝産物は、種々のエネルギー担体分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体を含む。LC-MS/MS法は、非標的メタボロミクスの感度が高く、0.05 pmol/μLの低濃度で水溶性代謝物の同定と定量を可能にします。この方法は、異なる条件下で培養した野生型および変異酵母細胞の水溶性メタボロメの評価に成功して使用されている。

概要

水溶性代謝産物は、低分子の中間体であり、必須の細胞プロセスに寄与する代謝産物です。これらの進化的に保存されたプロセスには、栄養素の使用可能エネルギーへの変換、高分子の合成、細胞増殖およびシグナル伝達、細胞周期制御、遺伝子発現調節、ストレス応答、代謝の翻訳後調節、ミトコンドリア機能の維持、静脈細胞密売、オートファジー、細胞老化、および調節細胞死1、2、3が含まれる。

水溶性代謝産物のこれらの本質的な役割の多くは、出芽酵母S.cerevisiae1、3、4、7、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22の研究によって発見されています。この単細胞真核生物は、高度な生化学的、遺伝的、および分子生物学的解析23、24、25、26へのアメナビリティによる細胞プロセスに水溶性代謝物が寄与する解剖機構を解剖するための有用なモデル生物である。非標的メタボロミクスのLC-MS法は、出芽酵母3、18、22、27における水溶性代謝産物の役割を研究するために使用されてきたが、この種の分析では、その汎用性、堅牢性、感度、およびこれらの代謝産物の異なる構造異性体と立体異性体形態を区別する能力の向上が必要である。

近年、非標的メタボロミクスのLC-MS/MS法を生体内の水溶性代謝産物のプロファイリングに適用する際の大きな進歩が顕著である。しかし、この方法論を使用する上での多くの課題は、2、28、29、30、31、32、33、34、35、36のままです。これらの課題には、次のようなものがあります。まず、多くの水溶性代謝産物の細胞内濃度が、現在使用されている方法に対する感受性の閾値を下回る。第二に、代謝活性の改善の効率が低すぎると、細胞内代謝産物の焼入れ関連細胞漏出の程度は、現在の方法では高すぎる。したがって、現在使用されている水溶性代謝産物の細胞内濃度を過小評価する方法。第三に、既存の方法では、特定の代謝物の構造異性体(すなわち、同じ化学式を持つ分子が原子結合性が異なる分子)や立体異性体(すなわち、同じ化学式と原子結合性を有する分子)を区別することはできません。これにより、現在使用されているメソッドによる特定の代謝物の正しい注釈がなくなります。第4に、親イオン(MS1)と二次イオン(MS2)の既存の質量スペクトルオンラインデータベースは不完全です。これは、現在のメソッドの助けを借りて生成された未加工の LC-MS/MS データを使用して、特定の代謝産物の正しい識別と定量に影響します。第五に、既存の方法は、水溶性代謝産物のすべてのまたはほとんどのクラスを回復するために単一のタイプの代謝産物抽出を使用することはできません。第六に、既存の方法は、水溶性代謝産物の全てのクラスまたはほとんどのクラスを互いに分離するために、単一のタイプのLCカラムを使用することはできません。

ここでは 、S.セレビシエ 細胞内の代謝活性を改善し、抽出前にこれらの細胞内の水溶性代謝産物の大部分を維持し、酵母細胞からほとんどのクラスの水溶性代謝産物を抽出するための条件を最適化した。我々は 、S.セレビシエ 細胞から抽出された370以上の水溶性代謝産物のLC-MS/MSベースの同定と定量のための汎用性、堅牢で高感度な方法を開発しました。非標的化メタボロミクスのこの方法は、種々のエネルギーキャリア分子、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、解糖の中間体、および三カルボン酸サイクル中間体の細胞内濃度を評価することを可能にする。開発されたLC-MS/MS法により、多様な構造、物理的、化学的特性を有する水溶性代謝産物の異なる構造異性体および立体異性体の同定と定量化が可能です。

プロトコル

1. 酵母を育てる培地を製造し、殺菌する

  1. 完全な酵母エキスの180 mLをバクトペプトン(YP)培地で作ります。完全なYP培地は、1%(w / v)酵母エキスと2%(w / v)バクトペプトンが含まれています。
  2. 180 mLのYP培地を4つの250 mLのエルレンマイヤーフラスコに均等に分配します。これらのフラスコのそれぞれは、YP培地の45 mLを含む。
  3. 15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、YP培地でフラスコを殺菌します。

2. 野生型酵母菌株

  1. BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)株を使用します。

3. 2%グルコースを含むYP培地中の酵母の成長

  1. 15 psi/121 °Cで45分間オートクレーブすることにより、グルコースの20%(w/v)ストック溶液を殺菌します。
  2. 45 mLの滅菌されたYP培地を用いて、2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれにグルコースのオートクレーブ20%(w/v)ストック溶液の5 mLを加えます。YP培地中の最終濃度グルコースは2%(w/v)である。
  3. 2%グルコースを含むYP培地で、酵母細胞を2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに接種するために、微生物学的ループを使用してください。
  4. 200rpmに設定した回転シェーカーで、酵母細胞を30°Cで一晩成長させます。
  5. 酵母文化のアリコートを取る。培養のmL当たりの酵母細胞の総数を決定する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。

4. 細胞への移動と細胞は、2%グルコースを有するYP培地で成長する

  1. 殺菌した20%(w/v)ストック溶液の5 mLを、オートクレーブされたYP培地を用いて残りの2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに添加する。グルコースの最終的な濃度は2%(w/v)です。
  2. 合計5.0 x107細胞 を含む2%のグルコースを含む2%のグルコースを有するYP培地中の一晩酵母培養物の体積を、2%グルコースを含むYP培地を用いた2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに移す。細胞の移動に滅菌ピペットを使用してください。
  3. 200rpmに設定した回転シェーカーで30°Cで酵母細胞を少なくとも24時間(または実験が必要な場合は以上)成長させます。

5. 試薬の製造、ラボウェアの準備、細胞焼入れ装置の設置

  1. 以下を準備する:1)クエンチング溶液(60%高グレード(>99.9%)メタノール155mM重炭酸アンモニウム(ABC)緩衝液、pH = 8.0);2)氷冷ABC溶液(pH = 8.0);3)-20 °Cまで測定することができるデジタル温度計;4)500 mL大遠心分離機ボトル。5)事前に冷却された高速遠心分離機、あらかじめ冷却されたローターと、このローター用の500 mL遠心分離ボトルを-5 °Cで冷却。6)代謝物抽出管(ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心管)。7)ドライアイス。

6. 細胞の焼入れ

  1. 血球体を使用して、2%グルコース培養でYPのmL当たりの酵母細胞数を決定します。
  2. 5.0 x 108 細胞の総数を含む2%のグルコースを含むYP培地の培養液の体積を、冷却済みの500 mL遠心分離機ボトルに移します。
  3. 細胞を含む遠心分離器ボトルを200mLの体積まで、-20°Cに保存された消光液で素早く満たします。
  4. -5 °Cで3分間、11,325 x gの高速遠心分離機でボトルを遠心分離します。
  5. 迅速かつ優しく遠心分離機からボトルを回復します。蓋を緩めて外し、ペレットを邪魔することなく上清を取り除きます。
  6. 10 mLの氷冷ABCバッファーで細胞ペレットを素早く再懸濁し、代謝物抽出用のポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを備えた15mL高速ガラス遠心管に懸濁液を移管します。
  7. 0°Cで3分間3,000 x gの臨床遠心分離で遠心分離によって細胞を収集します。
  8. 上清を素早く取り除き、ドライアイスにチューブを置いて、代謝物の抽出を開始するか、抽出するまで-80 °Cでチューブを保管します。

7. 代謝物抽出用の試薬、実験器具、装置の調製

  1. 以下を準備します: 1) LC-MSグレードクロロホルム;2)LC-MSグレードメタノール;3)LCグレードナノ純水;4) LC-MSグレード (ACN);5)ガラスビーズ(酸洗浄、425-600 μm);6)リテーナー付きフォームチューブホルダーキット付き渦。7)ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心分離管;8)MSバイアル。9)ドライアイス;10)1.5mLチューブをエタノールで1回、ACNで1回、ナノ純水で1回洗浄した。
    注:有機溶剤に対して耐性のあるポリプロピレン製のマイクロピペットチップとチューブのみを使用してください。

8. 代謝物抽出

  1. ドライアイスに保管するか、ステップ6.7から-80°Cのチューブで保存した代謝物に、次の1)2 mLのクロロホルムを-20°Cで保存します。2) -20 °Cで保存されたメタノールの1 mL;3)氷冷ナノ純水の1 mL;4)425-600 μmの酸洗浄ガラスビーズの200 μL。
  2. チューブの口をアルミホイルで覆い、閉じます。リテーナーと渦を持つフォームチューブホルダーキットにチューブを置き、中速で30分間(すなわち、6に設定された速度で、12は渦の最高速度)4°Cで、代謝物の抽出を容易にします。
  3. チューブを氷上で15分間インキュベートし(ドライアイスではありません!)、タンパク質の沈殿と下側の有機相からの上水域の分離を促進します。
  4. 4°Cで10分間3,000 x gの臨床遠心分離機でチューブを遠心分離します。 この遠心分離ステップは、上層水相(水溶性代謝物を含む)を中間層(細胞の破片およびタンパク質を含む)および下の有機相(主に脂質を含む)から分離することを可能にする。
  5. マイクロピペットを使用して、上の水相(400 μL)を洗浄し、-20°Cで保存した800 μLのACNを含む1.5mLチューブに転写します。
    注:ACNに上水相を加えた後、白雲の降水量が-20°Cに保たれています。
  6. サンプルをテーブル上の遠心分離機で13,400 x gで4°Cで10分間遠心します。
    注:遠心分離後、白雲の降水量は消えます。
  7. チューブ内の液体の上部からラベル付きMSバイアルに800 μLを移します。LC-MS/MSで分析されるまで0°Cで保存してください。

9. LC用試薬・ラボウェア・装置の製造

  1. 以下を準備します: 1) 渦。2)超音波超音波処理器。3)MSガラスバイアル。4)バイナリポンプ、脱ガッサー、およびオートサンプラーを装備したLCシステム。5) ジウテリオニック相クロマトグラフィーカラム(5 μmポリマー、150 x 2.1 mm)を 材料表に記載。6)カラムヒーター。7)移動相、相A(5:95 ACN:水(v/v)20 mM酢酸アンモニウム、pH = 8.0)および相B(100%ACN)を含む。

10. LCによる抽出された代謝物の分離

  1. MSバイアルの内容を15分間超音波処理します。
  2. 室温(RT)で10秒間MSバイアル3倍を渦。
  3. MSバイアルをウェルプレートに入れなさい。
  4. クロマトグラフ中は、カラムを45 °C、流量0.250 mL/minに保ちます。試料は、0°Cのウェルプレートに保管してください。 クロマトグラフィーで使用する必要がある LC 勾配については、 表 1 を参照してください。
    注:野生型株BY4742の細胞から抽出した水溶性代謝物の代表的な全イオンクロマトグラムを 図1に示す。LCによって分離された代謝産物を同定し、ステップ11について説明したように、正イオン化[ESI(+)]モードで行った質量分析によって定量化した。

11. LCによって分離された代謝物の質量分析

  1. LCで分離された水溶性代謝物の同定と定量のために、加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI)を備えた質量分析計を使用してください。MS1イオン用の質量分析計とMS2イオン用の質量分析計の検出器を使用します。 MS1およびMS2 イオンのデータ依存的な取得については、表2および 表3 に示す設定を使用します。
  2. ESI(+)モードとESI(-)モードの両方で、注入には10 μLのサンプルボリュームを使用します。

12. LC-MS/MSからの生データ処理による異なる代謝物の同定と定量

  1. 材料表に記載されているソフトウェアを使用して、生の LC-MS/MS ファイルから異なる水溶性代謝物の同定と定量を行います。このソフトウェアは、代謝物の定量にMS1、代謝物の同定にMS2を使用します。ソフトウェアは、最も広範囲にキュレーション質量スペクトル断片化ライブラリを利用して、MSスペクトルを一致させることによってLC-MS/MS生データを使用して代謝物にアナティケートします。このソフトウェアはまた、オンラインデータベースを使用して代謝物にアナプトするためにMS1と同位体パターンマッチの正確な質量を使用しています。詳細については、図 2を参照してください。
  2. オンラインで自由に利用できるデータベースとスペクトルのライブラリ(https://www.mzcloud.org)を使用して、生データのMS2スペクトルを検索します。

13. ヨウ化プロピジウム(PI)染色法および蛍光顕微鏡による膜完全性測定

  1. ステップ6について説明したように細胞の焼入れを行った後、焼入れ細胞を15mLのABCバッファーで十分に洗浄し、焼入れ溶液を除去する。0°Cで5分間3,000xgで遠心分離して細胞を採取する。
  2. ABCバッファーの1 mLで細胞ペレットを再懸濁し、PI溶液(0.5 mg/mL)の0.5 mLを加えます。
  3. 10 sのサンプル3xでチューブをボルテックスし、暗闇と氷の上で10分間インキュベートします。
  4. サンプルをテーブル上の遠心分離機で13,400 x gで4°Cで10分間遠心します。
  5. 上清を取り除き、ABCバッファーの1mLでペレットを再懸濁します。
  6. チューブを13,400 x gで4°Cで10分間遠心し、上清を取り除く。この手順をさらに 2 回繰り返して、セル表面にバインドされた PI を削除します。
  7. ABCバッファーの300 μLでペレットを再懸濁します。10 μLのサスペンションを顕微鏡スライドの表面に置きます。
  8. 微分干渉コントラスト(DIC)と蛍光顕微鏡画像を蛍光顕微鏡で撮影します。励起波長と発光波長が593nmと636nm(それぞれ)に設定されたフィルタを使用します。
  9. ソフトウェアを使用して、総細胞数(DICモード)と蛍光染色細胞数をカウントします。また、このソフトウェアを使用して、個々の細胞の染色の強度を決定します。

結果

酵母細胞内の水溶性代謝産物の定量的評価を改善するために、代謝産物検出のための細胞焼入れ条件を最適化した。この目的のための細胞の焼入れは、細胞31、33、37、38内のすべての酵素反応の迅速な逮捕を伴う。このような細胞代謝活性の停止は、生体内の水溶?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルを正常に使用するには、以下に説明する予防措置に従ってください。クロロホルムとメタノールは、実験室のプラスチック製品から様々な物質を抽出します。したがって、慎重にそれらを処理します。これら2つの有機溶剤と接触するステップでのプラスチックの使用を避けてください。これらのステップには、ホウケイ酸ガラスピペットを使用してください。使用...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

ティトレンコ研究所の現在および元メンバーの話し合いに感謝しています。我々は、質量分析の生物学的応用センター、構造機能ゲノム研究センター、および顕微鏡・細胞イメージングセンター(すべてコンコルディア大学)が優れたサービスを提供することを認める。この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC)(RGPIN 2014-04482およびCRDPJ 515900 - 17)からの助成金によって支えられた。K.Mは、コンコルディア大学アーマンドC.アルシャンボーフェローシップとコンコルディア大学芸術科学学部優秀賞の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

参考文献

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