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Resumo

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Resumo

Metabolômica é uma metodologia utilizada para a identificação e quantificação de muitos intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo dentro de uma célula, tecido, órgão, fluido biológico ou organismo. A metabolômica tradicionalmente se concentra em metabólitos solúveis em água. O metabolome solúvel em água é o produto final de uma complexa rede celular que integra vários fatores genômicos, epigenômicos, transcriômicos, proteômicos e ambientais. Assim, a análise metabolômica avalia diretamente o resultado da ação para todos esses fatores em uma infinidade de processos biológicos dentro de diversos organismos. Um desses organismos é o fermento saccharomyces cerevisiae, um eucariote unicelular com o genoma totalmente sequenciado. Como a S. cerevisiae é favorável a análises moleculares abrangentes, é usada como modelo para dissecar mecanismos subjacentes a muitos processos biológicos dentro da célula eucariótica. Um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa do metabolome solúvel em água forneceria a metodologia essencial para dissecar esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo para as condições otimizadas de atividade metabólica saciando e extração metabólito solúvel em água a partir de células de S. cerevisiae. O protocolo também descreve o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos metabólitos solúveis em água extraídos. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada descrito aqui é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de mais de 370 metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas, incluindo diferentes isômeros estruturais e formas estereogômicas desses metabólitos. Estes metabólitos incluem várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada é sensível e permite a identificação e a quantitação de alguns metabólitos solúveis em água em concentrações tão baixas quanto 0,05 pmol/μL. O método tem sido usado com sucesso para avaliar metabóboles solúveis em água de células de levedura silvestre e mutantes cultivadas em diferentes condições.

Introdução

Metabólitos solúveis em água são intermediários de baixo peso molecular e produtos do metabolismo que contribuem para processos celulares essenciais. Esses processos evolutivamente conservados incluem a conversão de nutrientes em energia utilizável, síntese de macromoléculas, crescimento e sinalização celular, controle do ciclo celular, regulação da expressão genética, resposta ao estresse, regulação pós-translacional do metabolismo, manutenção da funcionalidade mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envelhecimento celular e morte celular regulada1,2,3.

Muitos desses papéis essenciais de metabólitos solúveis em água foram descobertos por estudos na levedura S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Este eucariote unicelular é um organismo modelo útil para dissecar mecanismos através dos quais metabólitos solúveis em água contribuem para processos celulares devido à sua comodidade às análises biológicas bioquímicas avançadas, genéticas e moleculares23,24,25,26. Embora os métodos LC-MS/MS de metabolômica não-direcionada tenham sido utilizados para estudar os papéis de metabólitos solúveis em água emleveduras brotantes 3,18,22,27, este tipo de análise requer a melhoria de sua versatilidade, robustez, sensibilidade e capacidade de distinguir entre diferentes isômeros estruturais e formas estereotipadas desses metabólicos.

Os últimos anos são marcados por avanços significativos na aplicação dos métodos LC-MS/MS de metabolômica não direcionada ao perfil de metabólitos solúveis em água in vivo. No entanto, muitos desafios no uso dessa metodologia permanecem2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Esses desafios incluem o seguinte. Em primeiro lugar, as concentrações intracelulares de muitos metabólitos solúveis em água estão abaixo de um limiar de sensibilidade para os métodos atualmente utilizados. Em segundo lugar, a eficiência da saciamento da atividade metabólica é muito baixa, e a extensão do vazamento celular associado à extinção de metabólitos intracelulares é muito alta para os métodos atuais; portanto, os métodos atualmente utilizados subestimam as concentrações intracelulares de metabólitos solúveis em água. Em terceiro lugar, os métodos existentes não podem diferenciar os isômeros estruturais (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química, mas conectividade atômica diferente) ou estereomers (ou seja, moléculas com a mesma fórmula química e conectividade atômica, mas com o arranjo atômico diferente no espaço) de metabólitos específicos; isso impede a anotação correta de certos metabólitos pelos métodos atualmente utilizados. Em quarto lugar, as bases de dados on-line espectrais existentes de íons-pais (MS1) e íons secundários (MS2) estão incompletas; isso afeta a identificação e a quantitação corretas de metabólitos específicos utilizando os dados brutos LC-MS/MS produzidos com a ajuda dos métodos atuais. Em quinto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo de extração metabólito para recuperar todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água. Em sexto lugar, os métodos existentes não podem usar um único tipo da coluna LC para separar-se entre si todas ou a maioria das classes de metabólitos solúveis em água.

Aqui, otimizamos as condições para a extinção da atividade metabólica dentro das células de S. cerevisiae, mantendo a maioria dos metabólitos solúveis em água dentro dessas células antes da extração, e extraindo a maioria das classes de metabólitos solúveis em água de células de levedura. Desenvolvemos um método versátil, robusto e sensível para a identificação e quantificação baseada em LC-MS/MS de mais de 370 metabólitos solúveis em água extraídos de células S. cerevisiae. Este método de metabolomia não-direcionada permite avaliar as concentrações intracelulares de várias moléculas portadoras de energia, nucleotídeos, aminoácidos, monossacarídeos, intermediários de glicólise e intermediários do ciclo tricarboxílico. O método desenvolvido LC-MS/MS permite a identificação e quantificação de diferentes isômeros estruturais e formas estereosméricas de metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas.

Protocolo

1. Fazer e esterilizar um meio para o cultivo de leveduras

  1. Faça 180 mL de um extrato completo de levedura com meio bactopepton (YP). O meio YP completo contém 1% (p/v) extrato de levedura e 2% (w/v) bactopeptone.
  2. Distribua 180 mL do meio YP igualmente em quatro frascos de 250 mL Erlenmeyer. Cada um desses frascos contém 45 mL do meio YP.
  3. Esterilize os frascos com meio YP autoclavando a 15 psi/121 °C por 45 min.

2. Cepa de levedura tipo selvagem

  1. Use a cepa BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Fermento crescente no meio YP contendo 2% de glicose

  1. Esterilize uma solução de estoque de 20% (w/v) de glicose por autoclaving a 15 psi/121 °C por 45 min.
  2. Adicione 5 mL da solução de estoque autoclaved de 20% (w/v) de glicose a cada um dos dois frascos Erlenmeyer com 45 mL do meio YP esterilizado. A glicose de concentração final no meio YP é de 2% (c/v).
  3. Use um laço microbiológico para inocular células de levedura em cada um dos dois frascos erlenmeyer com o meio YP contendo 2% de glicose.
  4. Cresça as células de levedura durante a noite a 30 °C em um agitador rotacional a 200 rpm.
  5. Tome uma alíquota da cultura da levedura. Determine o número total de células de levedura por mL de cultura. Conte células usando um hemócito.

4. Transferência celular para e célula cresce no meio YP com 2% de glicose

  1. Adicione 5 mL da solução de glicose esterilizada de 20% (w/v) para cada um dos dois frascos erlenmeyer restantes com o meio YP autoclavado. A concentração final de glicose é de 2% (c/v).
  2. Transfira um volume da cultura da levedura durante a noite em YP médio com 2% de glicose que contém o número total de 5,0 x 107 células em cada um dos dois frascos Erlenmeyer com o meio YP contendo 2% de glicose. Use uma pipeta estéril para a transferência celular.
  3. Cresça as células de levedura por pelo menos 24 h (ou mais, se o experimento exigir) a 30 °C em um agitador rotacional definido a 200 rpm.

5. Fazer reagentes, preparar labware e configurar equipamentos para saciar células

  1. Preparar o seguinte: 1) uma solução de saciação (60% de alto grau (>99,9%) metanol em 155 mM de biocarbonato de amônio (ABC), pH = 8,0); 2) uma solução ABC gelada (pH = 8,0); 3) um termômetro digital capaz de medir até -20 °C; 4) garrafas de centrífugas grandes de 500 mL; 5) uma centrífuga pré-resfriada de alta velocidade com um rotor pré-resfriado e garrafas de centrífugas de centrífugas pré-resfriadas de 500 mL para este rotor, tudo a -5 °C; 6) tubos de extração metabólito (tubos de centrífugas de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas forradas de politetrafluoroetileno); e 7) gelo seco.

6. Saciamento de células

  1. Use um hemótmetro para determinar o número de células de levedura por mL de YP com cultura de glicose de 2%.
  2. Transfira um volume da cultura em meio YP com 2% de glicose que contém o número total de 5,0 x 108 células em garrafas de centrífugas pré-resfriadas de 500 mL.
  3. Encha rapidamente a garrafa centrífuga contendo as células até o volume de 200 mL com uma solução de saciamento armazenada a -20 °C.
  4. Centrifugar as garrafas em uma centrífuga de alta velocidade a 11.325 x g por 3 min a -5 °C.
  5. Recuperar rapidamente e ternamente a garrafa da centrífuga; gentilmente desaparafusar a tampa e remover o sobrenatante sem perturbar a pelota.
  6. Ressuspenque rapidamente a pelota celular em 10 mL de tampão ABC gelado e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de vidro de alta velocidade de 15 mL com uma tampa forrada de politefluoroetileno para extração metabólito.
  7. Coletar células por centrifugação em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 3 min a 0 °C.
  8. Remova rapidamente o supernasal e coloque o tubo em gelo seco para iniciar a extração metabólito ou armazene o tubo a -80 °C até a extração.

7. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para extração metabólito

  1. Preparar o seguinte: 1) clorofórmio de grau LC-MS; 2) Metanol de grau LC-MS; 3) Água nano-pura de grau LC; 4) Grau LC-MS (ACN); 5) contas de vidro (lavadas com ácido, 425-600 μm); 6) um vórtice com um kit porta-tubos de espuma com retentor; 7) Tubos de centrífugas de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas forradas com politefluoroetileno; 8) Frascos de MS; 9) gelo seco; e 10) tubos de 1,5 mL lavados uma vez com etanol, uma vez com ACN e uma vez com água nano-pura.
    NOTA: Utilize apenas pontas de micropipette e tubos feitos de polipropileno resistente a solventes orgânicos.

8. Extração metabólito

  1. Para os metabólitos mantidos em gelo seco ou armazenados a -80 °C a partir da etapa 6.7, adicione o seguinte: 1) 2 mL de clorofórmio armazenado a -20 °C; 2) 1 mL de metanol armazenado a -20 °C; 3) 1 mL de água nano-pura gelada; e 4) 200 μL de 425-600 μm contas de vidro lavadas com ácido.
  2. Cubra e feche a boca de um tubo com papel alumínio. Coloque os tubos em um kit portador de tubo de espuma com retentor e vórtice por 30 minutos em velocidade média (ou seja, a uma velocidade que é definida em 6, sendo 12 a velocidade máxima de um vórtice) a 4 °C para facilitar a extração metabólito.
  3. Incubar o tubo por 15 minutos no gelo (NÃO gelo seco!) para promover a precipitação proteica e a separação do aquoso superior da fase orgânica inferior.
  4. Centrifugar o tubo em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 10 min a 4 °C. Esta etapa de centrifugação permite separar a fase aquosa superior (que contém metabólitos solúveis em água) da camada média (que contém detritos celulares e proteínas) e da fase orgânica inferior (que contém principalmente lipídios).
  5. Use uma micropipette para transferir a fase aquosa superior (400 μL) para um tubo lavado e rotulado de 1,5 mL contendo 800 μL de ACN que foi armazenado a -20 °C.
    NOTA: Haverá precipitação de nuvens brancas após a adição da fase aquosa superior à ACN mantida em -20 °C.
  6. Centrifugar o tubo com a amostra em uma centrífuga de mesa a 13.400 x g por 10 min a 4 °C.
    NOTA: A precipitação da nuvem branca desaparecerá após a centrifugação.
  7. Transfira 800 μL da porção superior de um líquido no tubo para um frasco ms rotulado. Armazene a amostra a 0 °C até que seja analisada por LC-MS/MS.

9. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para LC

  1. Preparar o seguinte: 1) um vórtice; 2) um sônico ultrassônico; 3) Frascos de vidro MS; 4) um sistema LC equipado com uma bomba binária, degasser e autosampler; 5) uma coluna de cromatografia em fase zwitterionica (polímero de 5 μm, 150 x 2,1 mm) nomeada em Tabela de Materiais; 6) um aquecedor de coluna; e 7) fases móveis, incluindo fase A (5:95 ACN:água (v/v) com acetato de amônio de 20 mM, pH = 8,0) e fase B (100% ACN).

10. Separação de metabólitos extraídos por LC

  1. Sujeito o conteúdo do frasco de MS à sônica ultrassônica por 15 min.
  2. Vórtice o frasco MS 3x por 10 segundos à temperatura ambiente (RT).
  3. Coloque o frasco MS na placa do poço.
  4. Durante o cromatógrafo, mantenha a coluna a 45 °C e uma vazão de 0,250 mL/min. Mantenha a amostra na placa do poço a 0 °C. Consulte a Tabela 1 para os gradientes de LC que precisam ser utilizados durante a cromatografia.
    NOTA: Um cromatograma total representativo de metabólitos solúveis em água que foram extraídos das células da cepa do tipo selvagem BY4742 é mostrado na Figura 1. Os metabólitos separados por LC foram identificados e quantificados pela análise espectrométrica de massa que foi realizada no modo ionização positiva [ESI (+)], conforme descrito para a etapa 11.

11. Análise espectrométrica em massa de metabólitos separados pela LC

  1. Use um espectrômetro de massa equipado com ionização de eletrospray aquecida (HESI) para identificação e quantitação de metabólitos solúveis em água que foram separados por LC. Use o analisador de espectrômetro de massa para íons MS1 e o detector de espectrômetro de massa para íons MS2. Utilize as configurações fornecidas na Tabela 2 e Na Tabela 3 para a aquisição dependente de dados de íons MS1 e MS2, respectivamente.
  2. Use um volume amostral de 10 μL para a injeção nos modos ESI (+) e ESI (-).

12. Identificação e quantitação de diferentes metabólitos pelo processamento de dados brutos da LC-MS/MS

  1. Use o software nomeado em Tabela de Materiais para realizar a identificação e quantitação de diferentes metabólitos solúveis em água a partir de arquivos LC-MS/MS brutos. Este software usa MS1 para quantitação metabólica e MS2 para identificação metabólica. O software explora a biblioteca de fragmentação espectral de massa mais extensivamente curada para anotar os metabólitos usando os dados brutos LC-MS/MS, combinando os espectros de MS. Este software também usa a massa exata de MS1 e o padrão de isótopos corresponde a metabólitos anotados usando bancos de dados on-line. Consulte a Figura 2 para obter detalhes.
  2. Use a biblioteca de bancos de dados e espectros, que está disponível gratuitamente online (https://www.mzcloud.org), para procurar espectros MS2 dos dados brutos.

13. Ensaio de integridade da membrana por sarampo de propidium Iodide (PI) e microscopia de fluorescência

  1. Após a saciação de células realizada como descrito para o passo 6, lave as células saciadas completamente com 15 mL de tampão ABC para remover a solução de saciamento. Coletar células por centrifugação a 3.000 x g por 5 min a 0 °C.
  2. Resuspense a pelota de célula em 1 mL de tampão ABC e adicione 0,5 mL da solução PI (0,5 mg/mL).
  3. Vórtice um tubo com a amostra 3x para 10 s e incuba-lo por 10 minutos no escuro e no gelo.
  4. Centrifugar o tubo com a amostra em uma centrífuga de mesa a 13.400 x g por 10 min a 4 °C.
  5. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de buffer ABC.
  6. Centrifugar o tubo a 13.400 x g por 10 min a 4 °C e remover o sobrenatante. Repita esta etapa mais 2 vezes para remover o PI ligado à superfície da célula.
  7. Resuspenda a pelota em 300 μL de buffer ABC. Coloque 10 μL da suspensão na superfície de um deslizamento de microscópio.
  8. Capture as imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia de fluorescência com um microscópio de fluorescência. Use um filtro configurado nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 593 nm e 636 nm (respectivamente).
  9. Use um software para contar o número total de células (no modo DIC) e o número de células manchadas fluorescentes. Além disso, use este software para determinar a intensidade da coloração para células individuais.

Resultados

Para melhorar uma avaliação quantitativa de metabólitos solúveis em água dentro de uma célula de levedura, otimizamos as condições de saciamento celular para detecção metabólito. A extinção celular para este fim envolve uma prisão rápida de todas as reações enzimáticas dentro de uma célula31,33,37,38. Tal apreensão da atividade metabólica ce...

Discussão

Para utilizar com sucesso o protocolo aqui descrito, siga as medidas preventivas descritas abaixo. Clorofórmio e metanol extraem várias substâncias de plásticos de laboratório. Portanto, lide com eles com cautela. Evite o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com qualquer um desses dois solventes orgânicos. Use pipetas de vidro borossilicato para estas etapas. Levante essas pipetas com clorofórmio e metanol antes de usar. Use apenas pontas de micropipette e tubos feitos de polipropileno resistente a sol...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Somos gratos aos atuais e antigos membros do laboratório Titorenko pelas discussões. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas da Espectrometria de Massa, o Centro de Genômica Estrutural e Funcional e o Centro de Microscopia e Imagem Celular (todos na Universidade de Concórdia) por serviços de destaque. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá (RGPIN 2014-04482 e CRDPJ 515900 - 17). K.M. foi apoiado pela Concordia University Armand C. Archambault Fellowship e pelo Prêmio de Excelência da Universidade de Concórdia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

Referências

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