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요약

우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.

초록

Metabolomics는 세포 내의 많은 저분자 중량 중간체 및 물질 대사의 제품을 식별 및 정량화하는 데 사용되는 방법론입니다. 메타볼로믹스는 전통적으로 수용성 대사산물에 초점을 맞추고 있습니다. 수용성 메타볼로메는 다양한 게놈, 전형, 전사, 프로테오믹 및 환경 요인을 통합하는 복잡한 세포 네트워크의 최종 제품입니다. 따라서, metabolomic 분석은 각종 유기체 내의 생물학 프로세스의 과다에서 이 모든 요인에 대한 행동의 결과를 직접 평가합니다. 이러한 유기체 중 하나는 완전히 서열게놈을 가진 단세포 진핵생물인 신진 효모 사카로미세스 세레비시아입니다. S. cerevisiae는 포괄적인 분자 분석에 순종하기 때문에, 진핵 세포 내의 많은 생물학적 프로세스의 근본적인 기계장치를 해부하기위한 모델로 사용됩니다. 수용성 메타볼로메의 견고하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법은 이러한 메커니즘을 해부하는 데 필수적인 방법론을 제공할 것입니다. 여기서 우리는 S. 세레비시아 세포로부터 담금질및 수용성 대사산물 추출의 최적화된 조건에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 추출된 수용성 대사산물의 정량적 분석을 위해 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 이러한 대사 산물의 다른 구조 이성질체 및 스테레오시컬 형태를 포함하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 갖춘 370개 이상의 수용성 대사산물을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이 대사 산물은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체를 포함합니다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 민감하며 0.05 pmol/μL의 농도에서 일부 수용성 대사산물의 식별 및 양을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 다른 조건에서 배양된 야생형 및 돌연변이 효모 세포의 수용성 메타볼로메를 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

서문

수용성 대사 산물은 저분자-분자량 중간체및 필수 세포 과정에 기여하는 신진 대사의 제품입니다. 이러한 진화적으로 보존된 과정에는 영양분을 사용 가능한 에너지로 변환하는 것, 거대 분자의 합성, 세포 성장 및 신호, 세포 주기 제어, 유전자 발현 조절, 스트레스 반응, 대사 후 조절, 미토콘드리아 기능 유지, 혈관 세포 인신 매매, 자가 세포 노화 및 규제 된 세포 죽음1,2,3.

수용성 대사산물의 이러한 필수 역할중 상당수는 신진 효모 S. 세레비시아1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21, 22의연구에 의해 발견되었다. 이러한 단세포 진핵생물은 수용성 대사산물이 고급 생화학, 유전적 및 분자 생물학적 분석23,24,25,26에대한 복종성으로 인한 세포 과정에 기여하는 메커니즘을 해부하는 데 유용한 모델 유기체이다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 신진 효모3,18,22,27에서수용성 대사산물의 역할을 연구하는 데 사용되었지만, 이러한 유형의 분석은 다재다능성, 견고성, 감도 및 이러한 대사산물의 스테레오릭 형태를 구별하는 능력의 개선이 필요합니다.

최근 몇 년 동안 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법을 생체내 용해성 대사산물 프로파일링에 적용하는 데 상당한 진전이 있습니다. 그러나, 이 방법론을 사용하는 많은 도전은2,28,29,30,31,32,33,34, 35,36남아있다. 이러한 과제에는 다음이 포함됩니다. 첫째, 많은 수용성 대사산물의 세포 내 농도는 현재 사용되는 방법에 대한 감도의 임계값 미만이다. 둘째, 대사 활성 담금질의 효율이 너무 낮고, 세포 내 대사산물의 담금질 관련 세포 누설의 정도는 현재의 방법에 대해 너무 높다; 따라서, 현재 사용되는 방법은 수용성 대사 산물의 세포 내 농도를 과소 평가한다. 셋째, 기존 방법은 구조이소(즉, 동일한 화학 적 분수하지만 다른 원자 연결을 가진 분자) 또는 스테레오이머스(즉, 동일한 화학 공식 및 원자 연결을 가진 분자,하지만 우주에서 다른 원자 배열)를 특정 대사 산물의 분화할 수 없다; 이것은 현재 사용된 방법에 의하여 특정 대사 산물의 정확한 표시를 방지합니다. 넷째, 모시 이온(MS1) 및 이차 이온(MS2)의 기존 질량 스펙트럼 온라인 데이터베이스는 불완전하다; 이는 현재 방법의 도움으로 생성된 원시 LC-MS/MS 데이터를 사용하여 특정 대사산물의 정확한 식별 및 수량에 영향을 미칩니다. 다섯째, 기존 방법은 단일 유형의 대사산물 추출을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스를 복구할 수 없습니다. 여섯째, 기존 메서드는 LC 컬럼의 단일 유형을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스와 분리할 수 없습니다.

여기에서, 우리는 S. cerevisiae 세포 내의 신진 대사 활동의 담금질을 위한 조건을, 추출하기 전에 이 세포 내의 수용성 대사산물의 대부분을 유지하고, 효모 세포에서 수용성 대사산물의 대부분의 클래스를 추출하기 위한 조건을 조정했습니다. 우리는 S. cerevisiae 세포에서 추출한 370개 이상의 수용성 대사산물의 LC-MS/MS 기반 식별 및 정량화를 위한 다재다능하고 견고하며 민감한 방법을 개발했습니다. 비표적 메타볼로믹스의 이 방법은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체의 세포내 농도를 평가할 수 있게 한다. 개발된 LC-MS/MS 방법은 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 가진 다양한 구조 이성질체 및 입체형 형태의 수용성 대사산물의 식별 및 정량화를 허용합니다.

프로토콜

1. 효모 성장을 위한 배지 만들기 및 살균

  1. 180mL의 완전한 효모 추출물을 박테리아펩톤(YP) 배지로 만듭니다. 완전한 YP 배지에는 효모 추출물 1%(w/v) 및 2%(w/v) 바토펩톤이 포함되어 있습니다.
  2. YP 배지 180mL를 250mL 에렌마이어 플라스크 4개에 동등하게 분배한다. 이러한 플라스크 각각에는 YP 배지의 45mL가 포함되어 있습니다.
  3. 15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 YP 배지로 플라스크를 살균합니다.

2. 야생 형 효모 균주

  1. BY4742(MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)스트레인을 사용한다.

3. 2%의 포도당을 함유하는 YP 배지에서 효모 증가

  1. 포도당의 20% (w/v) 스톡 용액을 15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 살균합니다.
  2. 멸균 된 YP 배지의 45 mL로 두 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 20 % (w /v) 스톡 용액의 5 mL을 추가합니다. YP 배지의 최종 농도 포도당은 2%(w/v)이다.
  3. 2% 포도당을 포함하는 YP 배지를 가진 2개의 Erlenmeyer 플라스크의 각각으로 효모 세포를 접종하는 미생물 루프를 사용합니다.
  4. 효모 세포를 200 rpm에 설정된 회전 셰이커에서 30°C에서 하룻밤 동안 성장시다.
  5. 효모 문화의 알리쿼트를 가져 가라. 배양mL당 효모 세포의 총 수를 결정합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.

4. 세포 전달 및 세포는 2% 포도당으로 YP 배지에서 성장합니다

  1. 멸균된 20% (w/v) 스톡 용액의 5mL를 나머지 2개의 Erlenmeyer 플라스크에 오토클레이브 YP 배지로 추가합니다. 포도당의 최종 농도는 2% (w/v)입니다.
  2. YP 배지에서 야간 효모 배양의 부피를 2%의 포도당을 포함하는 YP 배지로 각각 5.0 x 107 세포의 총 수를 포함하는 2%의 포도당을 전송한다. 세포 전달을 위해 멸균 파이펫을 사용합니다.
  3. 200 rpm에서 설정된 회전 셰이커에서 30°C에서 적어도 24h(또는 실험이 요구하는 경우) 효모 세포를 성장시한다.

5. 시약 만들기, 실험실 준비, 세포 담금질 장비 설정

  1. 다음 준비: 1) 담금질 용액 (60% 고급 (>99.9%) 메탄올 155 mM 암모늄 중탄산염 (ABC) 버퍼, pH = 8.0); 2) 얼음 차가운 ABC 솔루션 (pH = 8.0); 3) -20 °C까지 측정 할 수있는 디지털 온도계; 4) 500 mL 큰 원심 분리기 병; 5) 사전 냉각 된 로터와 사전 냉각 된 500 mL 원심 분리기 병이있는 사전 냉각 된 고속 원심 분리기는 -5 °C에서 모두; 6) 대사 산물 추출 튜브 (폴리테트라플루오로에틸렌 안감 캡15 mL 고속 유리 원심분리기 튜브); 및 7) 드라이 아이스.

6. 세포 담금질

  1. 혈류계를 사용하여 YP의 mL 당 효모 세포의 수를 2% 포도당 배양시로 결정합니다.
  2. YP 배지에서 배양물의 양을 2%의 포도당을 전달하여 총 5.0 x 108 세포의 총 수를 사전 냉각된 500mL 원심분리기 병으로 이송한다.
  3. -20°C에 저장된 담금질 용액으로 세포를 200mL의 부피까지 포함하는 원심분리기 병을 신속하게 채웁니다.
  4. -5°C에서 3분 동안 11,325 x g의 고속 원심분리기에서 병을 원심분리합니다.
  5. 원심분리기에서 병을 빠르고 부드럽게 복구합니다. 뚜껑을 부드럽게 풀고 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다.
  6. 10mL의 얼음 차가운 ABC 버퍼로 셀 펠릿을 신속하게 회수하고 현탁액을 대사 산물 추출을 위한 폴리테트라플루오로틸렌 안감 캡이 있는 15mL 고속 유리 원심분리기 튜브로 이송합니다.
  7. 0°C에서 3분 동안 3,000 x g에서 임상 원심분리기에서 원심분리기로 세포를 수집합니다.
  8. 상체를 신속하게 제거하고 튜브를 드라이 아이스에 배치하여 대사산물 추출을 시작하거나 추출할 때까지 -80°C에 튜브를 저장합니다.

7. 대사 산물 추출시 시약, 실험실 용품 및 장비 준비

  1. 다음 준비: 1) LC-MS 등급 클로로폼; 2) LC-MS 등급 메탄올; 3) LC 등급 나노 순수 한 물; 4) LC-MS 등급 (ACN); 5) 유리 구슬 (산 세척, 425-600 μm); 6) 리테이너가있는 폼 튜브 홀더 키트가있는 소용돌이; 7) 폴리테트라플루오로틸렌 안감 캡이 있는 15mL 고속 유리 원심분리기 튜브; 8) MS 바이알; 9) 드라이 아이스; 및 10) 1.5 mL 튜브는 에탄올로 한 번 세척, ACN과 한 번 나노 순수 한 물로.
    참고: 유기 용매에 강한 폴리프로필렌으로 만든 마이크로피펫 팁과 튜브만 사용하십시오.

8. 대사 산물 추출

  1. 건조 얼음에 보관하거나 6.7단계에서 -80°C 튜브에 저장된 대사산물에, 다음을 추가하였다: 1) 2mL의 클로로포형은 -20°C에 저장된다; 2) -20 °C에 저장된 메탄올 1 mL; 3) 얼음 차가운 나노 순수 한 물의 1 mL; 및 4) 425-600 μm산 세척 유리 구슬의 200 μL.
  2. 알루미늄 호일로 튜브의 입을 덮고 닫습니다. 튜브를 리테이너와 함께 폼 튜브 홀더 키트에 놓고 중간 속도(즉, 6에서 설정된 속도) 4°C에서 30분 동안 튜브를 소용돌이로 처리하여 대사산물 추출을 용이하게 합니다.
  3. 튜브를 얼음에 15분 동안 배양하여 단백질 강수량과 하부 유기상으로부터 수성의 분리를 촉진합니다.
  4. 4°C에서 10분 동안 3,000 x g의 임상 원심분리기에서 튜브를 원심분리합니다. 이 원심 분리 단계는 중간 층 (세포 파편과 단백질을 포함하는) 및 낮은 유기 상 (주로 지질을 포함하는)에서 상부 수성 단계 (수용성 대사 산물을 포함하는)를 분리 할 수 있습니다.
  5. 마이크로피펫을 사용하여 상부 수성 상(400 μL)을 -20°C에 저장된 ACN의 800μL을 포함하는 세척 및 표지된 1.5mL 튜브로 전송한다.
    참고: ACN에 상부 수성 위상을 추가한 후 백색 구름 침전이 있을 것입니다.-20°C.
  6. 4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 탁상 원심분리기에서 샘플로 튜브를 원심분리합니다.
    참고: 원심 분리 후 흰색 구름 침전이 사라집니다.
  7. 튜브내 액체의 상부에서 800 μL을 표지된 MS 바이알로 옮기다. LC-MS/MS에 의해 분석될 때까지 샘플을 0°C로 저장합니다.

9. LC용 시약, 실험실 및 장비 준비

  1. 다음 준비: 1) 소용돌이; 2) 초음파 초음파 처리기; 3) MS 유리 유리 바이알; 4) 이진 펌프, 드가저 및 자동 샘플러가 장착 된 LC 시스템; 5) 재료표에명명된 zwitterionic 상 크로마토그래피 컬럼(5μm 폴리머, 150 x 2.1 mm); 6) 컬럼 히터; 및 7) 20mM암모늄 아세테이트, pH = 8.0 및 위상 B(100% ACN)를 포함하는 상 A(5:95 ACN:water(v/v)를 포함하는 이동상.

10. LC에 의해 추출된 대사산물의 분리

  1. MS 바이알의 함량을 초음파 초음파로 15 분 동안 피사체.
  2. 실온(RT)에서 10초 동안 MS 바이알 3x를 소용돌이시다.
  3. MS 바이알을 웰 플레이트에 넣습니다.
  4. 크로마토그래프 동안, 기둥을 45°C및 0.250mL/min의 유량으로 유지한다. 샘플을 웰 플레이트에 0°C로 유지합니다. 크로마토그래피 중에 사용해야 하는 LC 그라데이션의 표 1을 참조하십시오.
    참고: 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출된 수용성 대사산물의 대표적인 총 이온 크로마토그램이 도 1에도시된다. LC에 의해 분리된 대사산물은 11단계에 대해 설명된 바와 같이 양성 이온화[ESI(+)] 모드에서 수행된 질량 분광 분석에 의해 확인및 정량화되었다.

11. LC에 의해 분리된 대사 산물의 질량 분광 분석

  1. LC에 의해 분리된 수용성 대사산물의 식별 및 수량을 위해 가열된 전기분무(HESI)가 장착된 질량 분광계를 사용합니다. MS1 이온에 대한 질량 분광계의 분석기와 MS2 이온에 대한 질량 분광계의 검출기를 사용합니다. 각각 MS1 및 MS2 이온의 데이터 종속 수집에 대해 표 2 및 표 3에 제공된 설정을 사용합니다.
  2. ESI(+) 및 ESI(-) 모드에서 모두 주입에 10 μL의 샘플 부피를 사용합니다.

12. LC-MS/MS의 원시 데이터 처리에 의한 다른 대사 산물의 식별 및 수량

  1. 재료의 표에 명명 된 소프트웨어를 사용하여 원시 LC-MS / MS 파일에서 다른 수용성 대사 산물의 식별 및 수량을 수행합니다. 이 소프트웨어는 대사 산물 수량에 대한 MS1을 사용하고 대사 산물 식별을 위해 MS2를 사용합니다. 이 소프트웨어는 MS 스펙트럼을 일치시켜 LC-MS/MS 원시 데이터를 사용하여 대사 산물에 주석을 지정하기 위해 가장 광범위하게 선별된 질량 스펙트럼 조각 라이브러리를 활용합니다. 이 소프트웨어는 또한 MS1및 동위원소 패턴의 정확한 질량을 온라인 데이터베이스를 사용하여 대사 산물에 대한 부토에 일치합니다. 자세한 내용은 그림 2를 참조하십시오.
  2. 온라인(https://www.mzcloud.org)에서 자유롭게 사용할 수 있는 데이터베이스 및 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 원시 데이터의 MS2 스펙트럼을 검색합니다.

13. 프로피듐 이오드 (PI) 염색 및 형광 현미경 검사에 의한 멤브레인 무결성 분석

  1. 6단계에 대해 설명된 바와 같이 수행된 세포 담금질 후, 담금질 용액을 제거하기 위해 15mL의 ABC 버퍼로 담금질 세포를 철저히 세척한다. 0°C에서 5분 동안 3,000 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.
  2. ABC 버퍼의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 PI 용액의 0.5 mL을 추가합니다(0.5 mg/mL).
  3. 10s에 대한 샘플 3x와 튜브를 소용돌이와 어둠과 얼음에 10 분 동안 배양.
  4. 4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 탁상 원심분리기에서 샘플로 튜브를 원심분리합니다.
  5. 상체를 제거하고 ABC 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 분리합니다.
  6. 4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 튜브원심분리기를 제거하고 상류체를 제거합니다. 이 단계를 2회 더 반복하여 셀 표면에 바인딩된 PI를 제거합니다.
  7. ABC 버퍼의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 현미경 슬라이드의 표면에 서스펜션의 10 μL을 놓습니다.
  8. 형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 및 형광 현미경 이미지를 캡처합니다. 593nm 및 636nm(각각)의 여기 및 방출 파장에 설정된 필터를 사용합니다.
  9. 소프트웨어를 사용하여 총 세포 수(DIC 모드에서)와 형광 염색 된 세포의 수를 계산합니다. 또한 이 소프트웨어를 사용하여 개별 셀에 대한 염색 강도를 결정합니다.

결과

효모 세포 내의 수용성 대사산물의 정량적 평가를 개선하기 위해 대사 산물 검출을 위한 세포 담금질 조건을 최적화했습니다. 이러한 목적을 위해 세포 담금질은세포31,33,37,38내의 모든 효소 반응의 신속한 체포를 포함한다. 이러한 세포대사 활성의 이러한 체포는 생체 내?...

토론

여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 사용하려면 아래에 설명된 예방 조치를 따르십시오. 클로로폼과 메탄올은 실험실 플라스틱 제품에서 다양한 물질을 추출합니다. 따라서 신중하게 처리하십시오. 이 두 유기 용매와 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 마십시오. 이러한 단계에 는 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용합니다. 사용하기 전에 클로로폼과 메탄올로 이 파이펫을 상승시보세?...

공개

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

우리는 토론에 대한 티토렌코 연구소의 현재와 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분광학의 생물학 응용 센터를 인정합니다, 구조 및 기능 유전체학센터, 및 미해결 서비스를 위한 현미경 및 세포 화상 진찰 센터 (콩코르디아 대학에 모두). 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482 CRDPJ 515900 - 17). K.M. 콩코르디아 대학 아르만드 C. 아캄볼트 펠로우십과 콩코르디아 대학 예술 과학 우수 학장의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

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