JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Özet

Metabolomik, bir hücre, doku, organ, biyolojik sıvı veya organizma içindeki birçok düşük moleküler ağırlıklı ara ve metabolizma ürününün tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılan bir metodolojidir. Metabolomics geleneksel olarak suda çözünen metabolitlere odaklanır. Suda çözünen metabolom, çeşitli genomik, epigenomik, transkriptomik, proteomik ve çevresel faktörleri entegre eden karmaşık bir hücresel ağın son ürünüdür. Bu nedenle, metabolomik analiz, çeşitli organizmalar içindeki çok sayıda biyolojik işlemde tüm bu faktörler için eylemin sonucunu doğrudan değerlendirir. Bu organizmalardan biri tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, tamamen sıralanmış genoma sahip tek hücreli bir ökaryot. S. cerevisiae kapsamlı moleküler analizlere elverişli olduğundan, ökaryotik hücre içindeki birçok biyolojik işlemin altında kalan mekanizmaların parçalanması için bir model olarak kullanılır. Suda çözünen metabolomların sağlam, hassas ve doğru nicel değerlendirmesi için çok yönlü bir analitik yöntem, bu mekanizmaların parçalandırılması için gerekli metodolojiyi sağlayacaktır. Burada, S. cerevisiae hücrelerinden suda çözünen metabolit ekstraksiyonu ve söndürülen metabolik aktivitenin optimize edilmiş koşulları için bir protokol sunuyoruz. Protokol ayrıca, çıkarılan suda çözünen metabolitlerin nicel analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisinin kullanımını açıklar. Burada açıklanan hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemi çok yönlü ve sağlamdır. Bu metabolitlerin farklı yapısal izomerleri ve stereoisomerik formları da dahil olmak üzere çeşitli yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip 370'ten fazla suda çözünür metabolitlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar. Bu metabolitler çeşitli enerji taşıyıcı molekülleri, nükleotitler, amino asitler, monoakkaritler, glikoliz araları ve trikarboksilik döngü aralarını içerir. Hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemi hassastır ve 0,05 pmol/μL'ye kadar düşük konsantrasyonlarda suda çözünen bazı metabolitlerin tanımlanmasına ve nicelleşmesine izin verir. Yöntem, farklı koşullar altında kültürlenmiş vahşi tip ve mutant maya hücrelerinin suda çözünen metabolomlarını değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır.

Giriş

Suda çözünen metabolitler, temel hücresel süreçlere katkıda bulunan düşük moleküler ağırlıklı ara ürünler ve metabolizma ürünleridir. Bu evrimsel olarak korunan süreçler arasında besin maddelerinin kullanılabilir enerjiye dönüştürülmesi, makromolekül sentezi, hücresel büyüme ve sinyalizasyon, hücre döngüsü kontrolü, gen ekspresyonunun düzenlenmesi, stres yanıtı, metabolizmanın çeviri sonrası düzenlenmesi, mitokondriyal işlevselliğin sürdürülmesi, veziküler hücresel kaçakçılık, otofaji, hücresel yaşlanma ve düzenlenmiş hücre ölümü1,2,3sayıldı.

Suda çözünen metabolitlerin bu temel rollerinin çoğu, tomurcuklanan maya S. cerevisiae1 , 3 , 4 , 7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22'deki çalışmalarla keşfedilmiştir. Bu tek hücreli ökaryot, suda çözünen metabolitlerin gelişmiş biyokimyasal, genetik ve moleküler biyolojik analizlere uygunluğu nedeniyle hücresel süreçlere katkıda bulunduğu mekanizmaların parçalandırılması için yararlı bir model organizmadır23,24,25,26. Hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemleri tomurcuklanan maya 3,18, 22,27'desuda çözünen metabolitlerin rollerini incelemek için kullanılmış olsa da, bu tür analizler çok yönlülüğünün, sağlamlığının, hassasiyetinin ve bu metabolitlerin farklı yapısal izomerleri ve stereoisomerik formlarını ayırt etme yeteneğinin iyileştirilmesini gerektirir.

Son yıllarda, hedefsiz metabolomik LC-MS/MS yöntemlerinin suda çözünen metabolitlerin in vivo profillemesine uygulanmasında önemli gelişmeler vardır. Bununla birlikte, bu metodolojiyi kullanmada birçok zorluk2,28,29,30,31,32,33,34,35,36olarak kalır. Bu zorluklar aşağıdakileri içerir. İlk olarak, suda çözünür birçok metabolitin hücre içi konsantrasyonları, şu anda kullanılan yöntemler için bir duyarlılık eşiğinin altındadır. İkincisi, metabolik aktivite söndürmenin verimliliği çok düşüktür ve hücre içi metabolitlerin söndürme ile ilişkili hücre sızıntısının boyutu mevcut yöntemler için çok yüksektir; bu nedenle, şu anda kullanılan yöntemler, suda çözünür metabolitlerin hücre içi konsantrasyonlarını az tahmin eder. Üçüncüsü, mevcut yöntemler belirli metabolitlerin yapısal izomerlerini (yani, aynı kimyasal formüle ancak farklı atomik bağlantıya sahip molekülleri) veya stereoisomer'ları (yani, aynı kimyasal formüle ve atomik bağlantıya sahip moleküller, ancak uzaydaki farklı atomik düzenleme ile) ayırt edemez; bu, şu anda kullanılan yöntemlerle belirli metabolitlerin doğru ek açıklamalarını önler. Dördüncüsü, üst iyonların (MS1) ve ikincil iyonların (MS2) mevcut kütle spektral çevrimiçi veritabanları eksiktir; bu, mevcut yöntemlerin yardımıyla üretilen ham LC-MS/MS verilerini kullanarak belirli metabolitlerin doğru tanımlanmasını ve nicelliğini etkiler. Beşinci olarak, mevcut yöntemler suda çözünen metabolitlerin tüm veya çoğu sınıfını kurtarmak için tek bir metabolit ekstraksiyonu kullanamaz. Altıncı olarak, mevcut yöntemler, suda çözünür metabolitlerin tüm veya çoğu sınıfından ayırmak için tek bir LC sütunu türünü kullanamaz.

Burada, S. cerevisiae hücrelerindeki metabolik aktivitenin söndürülmesi, ekstraksiyondan önce bu hücreler içindeki suda çözünen metabolitlerin çoğunun korunması ve maya hücrelerinden suda çözünen metabolitlerin çoğu sınıfının çıkarılması için koşulları optimize ettik. S. cerevisiae hücrelerinden çıkarılan 370'ten fazla suda çözünür metabolitin LC-MS/MS tabanlı tanımlanması ve nicelleştirilmesi için çok yönlü, sağlam ve hassas bir yöntem geliştirdik. Hedefsiz metabolomik bu yöntem, çeşitli enerji taşıyıcı moleküllerinin, nükleotitlerin, amino asitlerin, monoakkaritlerin, glikoliz aralarının ve trikarboksilik döngü aralarının hücre içi konsantrasyonlarını değerlendirmeyi sağlar. Geliştirilen LC-MS/MS yöntemi, farklı yapısal, fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip suda çözünen metabolitlerin farklı yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının tanımlanmasına ve nicelleştirilmesine izin sağlar.

Protokol

1. Maya yetiştirmek için bir ortam yapmak ve sterilize etmek

  1. Bactopeptone (YP) ortamı ile tam bir maya özünden 180 mL yapın. Tam YP ortamı% 1 (w / v) maya özü ve% 2 (w / v) bactopeptone içerir.
  2. YP ortamının 180 mL'lik kısmını dört 250 mL Erlenmeyer şişesine eşit olarak dağıtın. Bu şişelerin her biri YP ortamının 45 mL'sini içerir.
  3. 15 psi/121 °C'de 45 dk otomatik kapatarak şişeleri YP ortamı ile sterilize edin.

2. Yabani tip maya suşu

  1. BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) suşu kullanın.

3. % 2 glikoz içeren YP ortamında büyüyen maya

  1. 15 psi/121 °C'de 45 dakika boyunca otoklavlayarak% 20 (w/v) stok glikoz çözeltisini sterilize edin.
  2. Sterilize edilmiş YP ortamının 45 mL'lik iki Erlenmeyer şişesinin her birine otomatik olarak kapatılmış% 20 (w/v) stok glikoz çözeltisinin 5 mL'sini ekleyin. YP ortamındaki son konsantrasyon glikozu% 2'dir (w/v).
  3. Maya hücrelerini% 2 glikoz içeren YP ortamı ile iki Erlenmeyer şişesinin her birine aşılamak için mikrobiyolojik bir döngü kullanın.
  4. Maya hücrelerini 30 °C'de 200 rpm'de ayarlanmış bir rotasyonel çalkalayıcıda bir gecede büyütün.
  5. Maya kültüründen bir aliquot alın. Kültürün mL'si başına toplam maya hücresi sayısını belirleyin. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

4. Hücre transferi ve hücre YP ortamında% 2 glikoz ile büyür

  1. Otoklavlı YP ortamı ile kalan iki Erlenmeyer şişesinin her birine sterilize edilmiş% 20 (w/ v) stok glikoz çözeltisinin 5 mL'sini ekleyin. Son glikoz konsantrasyonu% 2'dir (w / v).
  2. Toplam 5.0 x 10 7 hücre sayısını içeren %2 glikoz ile YP ortamındaki gece maya kültürünün bir hacmini%2 glikoz içeren YP ortamı ile iki Erlenmeyer şişesinin her birine aktarın. Hücre transferi için steril bir pipet kullanın.
  3. Maya hücrelerini 200 rpm'de ayarlanmış bir dönme çalkalayıcıda 30 °C'de en az 24 saat (veya daha fazla) büyütün.

5. Reaktifler yapmak, labware hazırlamak ve hücre söndürme için ekipman kurmak

  1. Aşağıdakileri hazırlayın: 1) 155 mM amonyum bikarbonat (ABC) tamponunda söndürme çözeltisi (%60 yüksek dereceli (%>99,9) metanol, pH = 8,0); 2) buz gibi bir ABC çözeltisi (pH = 8.0); 3) -20 °C'ye kadar ölçüm yapabilen dijital bir termometre; 4) 500 mL büyük santrifüj şişeleri; 5) önceden soğutulmuş rotorlu önceden soğutulmuş yüksek hızlı santrifüj ve bu rotor için önceden soğutulmuş 500 mL santrifüj şişeleri, hepsi -5 °C'de; 6) metabolit ekstraksiyon tüpleri (15 mL yüksek hızlı cam santrifüj tüpleri ile politetrafloroetilen astarlı kapaklar); ve 7) kuru buz.

6. Hücre söndürme

  1. % 2 glikoz kültürüne sahip YP'nin mL'si başına maya hücrelerinin sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın.
  2. Toplam 5.0 x 108 hücre sayısını içeren% 2 glikoz ile YP ortamında kültürün bir hacmini önceden soğutulmuş 500 mL santrifüj şişelerine aktarın.
  3. 200 mL hacme kadar olan hücreleri içeren santrifüj şişesini -20 °C'de depolanan bir söndürme çözeltisi ile hızlıca doldurun.
  4. Şişeleri -5 °C'de 3 dakika boyunca 11.325 x g'da yüksek hızlı bir santrifüjde santrifüj edin.
  5. Şişeyi santrifüjden hızlı ve yumuşak bir şekilde geri çıkarın; kapağı yavaşça sökün ve peleti bozmadan üst kapağı çıkarın.
  6. Hücre peletini 10 mL buz gibi ABC tamponunda hızla yeniden depolayın ve süspansiyonu metabolit ekstraksiyonu için politetrafloroetilen kaplı bir kapakla 15 mL yüksek hızlı cam santrifüj tüpüne aktarın.
  7. Hücreleri 0 °C'de 3 dakika boyunca 3.000 x g'da klinik santrifüjde santrifüjleme ile toplayın.
  8. Hızlı bir şekilde süpernatant çıkarın ve metabolit ekstraksiyona başlamak için tüpü kuru buza yerleştirin veya ekstraksiyona kadar tüpü -80 ° C'de saklayın.

7. Metabolit ekstraksiyonu için reaktiflerin, labware'lerin ve ekipmanların hazırlanması

  1. Aşağıdakileri hazırlayın: 1) LC-MS sınıfı kloroform; 2) LC-MS sınıfı metanol; 3) LC sınıfı nano-saf su; 4) LC-MS notu (ACN); 5) cam boncuklar (asitle yıkanmış, 425-600 μm); 6) tutuculu köpük tüp tutucu kitli bir girdap; 7) Politetrafloroetilen astarlı kapaklara sahip 15 mL yüksek hızlı cam santrifüj tüpleri; 8) MS şişeleri; 9) kuru buz; ve 10) 1,5 mL tüpler bir kez etanol, bir kez ACN ve bir kez nano saf su ile yıkanır.
    NOT: Sadece organik çözücülere dayanıklı polipropilenden yapılmış mikropipette uçları ve tüpler kullanın.

8. Metabolit ekstraksiyonu

  1. Kuru buzda tutulan veya 6.7 adımından itibaren -80 °C tüpte depolanan metabolitlere aşağıdakileri ekleyin: 1) -20 °C'de depolanan 2 mL kloroform; 2) -20 °C'de depolanan 1 mL metanol; 3) 1 mL buz gibi nano-saf su; ve 4) 425-600 μm asitle yıkanmış cam boncukların 200 μL'si.
  2. Bir tüpün ağzını alüminyum folyo ile örtün ve kapatın. Metabolit ekstraksiyonu kolaylaştırmak için tüpleri tutucu ve girdaplı bir köpük tüp tutucu kitine orta hızda (yani 6'ya ayarlanmış bir hızda, 12 bir girdabın maksimum hızı olacak şekilde) 4 °C'ye yerleştirin.
  3. Protein yağışını ve üst sulunun alt organik fazdan ayrılmasını teşvik etmek için tüpü buzda 15 dakika (KURU BUZ Değİl!) kuluçkaya yatırın.
  4. Tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.000 x g'da klinik santrifüjde santrifüj edin. Bu santrifüjleme adımı, üst sulu fazın (suda çözünür metabolitler içeren) orta katmandan (hücre kalıntıları ve proteinler içeren) ve alt organik fazdan (çoğunlukla lipitler içeren) ayrılmasına izin verir.
  5. Üst sulu fazı (400 μL) -20 °C'de depolanan 800 μL ACN içeren yıkanmış ve etiketli 1,5 mL tüpe aktarmak için bir mikropipette kullanın.
    NOT: -20 °C'de tutulan ACN'ye üst sulu fazı ekledikten sonra beyaz bulut yağışı olacaktır.
  6. 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'da bir masa üstü santrifüjde numune ile tüpü santrifüj edin.
    NOT: Beyaz bulut yağışı santrifüjlemeden sonra kaybolacaktır.
  7. Tüpteki bir sıvının üst kısmından etiketli bir MS şişesine 800 μL aktarın. Numuneyi LC-MS/MS tarafından analiz edilene kadar 0 °C'de saklayın.

9. LC için reaktiflerin, labwarelerin ve ekipmanların hazırlanması

  1. Aşağıdakileri hazırlayın: 1) bir girdap; 2) ultrasonik sonicator; 3) MS cam şişeler; 4) bir ikili pompa, gaz giderici ve otosampler ile donatılmış bir LC sistemi; 5) Malzeme Tablosundaadı geçen bir zwitteriyonik faz kromatografi sütunu (5 μm polimer, 150 x 2,1 mm); 6) bir sütun ısıtıcı; ve 7) A fazı (5:95 ACN:su (v/v) 20 mM amonyum asetat, pH = 8.0) ve faz B (%100 ACN) dahil olmak üzere mobil aşamalar.

10. Çıkarılan metabolitlerin LC ile ayrılması

  1. MS şişesinin içeriğini 15 dakika boyunca ultrasonik sonication'a tabi edin.
  2. Oda sıcaklığında (RT) 10 saniye boyunca MS şişesi 3x girdap.
  3. MS şişesini kuyu plakasına yerleştirin.
  4. Kromatograf sırasında sütunu 45 °C'de ve 0,250 mL/dk akış hızında saklayın. Numuneyi kuyu plakasında 0 °C'de tutun. Kromatografi sırasında kullanılması gereken LC degradeleri için Tablo 1'e bakın.
    NOT: Wild-type strain BY4742 hücrelerinden çıkarılan suda çözünen metabolitlerin temsili toplam iyon kromatogramı Şekil 1'degösterilmiştir. LC ile ayrılan metabolitler, 11.

11. LC ile ayrılmış metabolitlerin kütle spektrometrik analizi

  1. LC ile ayrılan suda çözünen metabolitlerin tanımlanması ve niceliği için ısıtılmış elektrospray iyonizasyon (HESI) ile donatılmış bir kütle spektrometresi kullanın. MS1 iyonları için kütle spektrometresinin analizörünü ve MS2 iyonları için kütle spektrometresinin dedektörünü kullanın. Sırasıyla MS1 ve MS2 iyonlarının veriye bağımlı olarak alınması için Tablo 2 ve Tablo 3'te sağlanan ayarları kullanın.
  2. Hem ESI (+) hem de ESI (-) modlarında enjeksiyon için 10 μL'lik bir örnek hacim kullanın.

12. LC-MS/MS'ten ham verilerin işlenmesiyle farklı metabolitlerin tanımlanması ve nicelliği

  1. Ham LC-MS/MS dosyalarından farklı suda çözünen metabolitlerin tanımlanmasını ve nicelliğini yürütmek için Malzeme Tablosu'nda adı geçen yazılımı kullanın. Bu yazılım metabolit nicelliği için MS1 ve metabolit tanımlama için MS2 kullanır. Yazılım, MS spektrasını eşleştirerek LC-MS/MS ham verilerini kullanarak metabolitlere açıklama eklemek için en kapsamlı şekilde seçilmiş kütle spektral parçalanma kitaplığından yararlanır. Bu yazılım ayrıca ms1 ve izotop desen eşleşmesinin tam kütlesini kullanarak çevrimiçi veritabanlarını kullanarak metabolitlere açıklama eklemek için kullanır. Ayrıntılar için Şekil 2'ye bakın.
  2. Ham verilerin MS2 spektrumunu aramak için çevrimiçi olarak serbestçe kullanılabilen veritabanları ve spektrumlar kitaplığını (https://www.mzcloud.org) kullanın.

13. Propidium İyodür (PI) boyama ve floresan mikroskopisi ile membran bütünlüğü tahlilleri

  1. 6. adım için açıklandığı gibi hücre söndürme işleminden sonra, söndürme çözeltisini çıkarmak için söndürülen hücreleri 15 mL ABC arabelleği ile iyice yıkayın. Hücreleri 0 °C'de 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
  2. Hücre peletini 1 mL ABC arabelleğine yeniden kullanın ve PI çözeltisinin 0,5 mL'si (0,5 mg/mL) ekleyin.
  3. Vortex, 10 s için 3x örnekli bir tüp ve karanlıkta ve buzda 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'da bir masa üstü santrifüjde numune ile tüpü santrifüj edin.
  5. Üstnatant çıkarın ve peletin 1 mL ABC arabelleğine yeniden asın.
  6. Tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüj edin ve üst düğmeyi çıkarın. Hücre yüzeyine bağlı PI'yi çıkarmak için bu adımı 2 kez daha yineleyin.
  7. Peletin 300 μL ABC tamponunda yeniden süzülür. Süspansiyonun 10 μL'sini mikroskop kaydırağı yüzeyine yerleştirin.
  8. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve floresan mikroskopi görüntülerini floresan mikroskopla yakalayın. 593 nm ve 636 nm (sırasıyla) ekscitasyon ve emisyon dalga boylarında ayarlanmış bir filtre kullanın.
  9. Toplam hücre sayısını (DIC modunda) ve floresan lekeli hücrelerin sayısını saymak için bir yazılım kullanın. Ayrıca, tek tek hücreler için boyama yoğunluğunu belirlemek için bu yazılımı kullanın.

Sonuçlar

Bir maya hücresi içindeki suda çözünen metabolitlerin nicel değerlendirmesini iyileştirmek için, metabolit tespiti için hücre söndürme koşullarını optimize ettik. Bu amaçla hücre söndürme, bir hücre 31,33 ,37,38içindeki tüm enzymatic reaksiyonların hızlı bir şekilde tutuklanmasını içerir. Hücresel metabolik aktivitenin böyle bir ş...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokolü başarıyla kullanmak için aşağıda açıklanan önleyici tedbirleri izleyin. Kloroform ve metanol, laboratuvar plastik eşyalarından çeşitli maddeler çıkarır. Bu nedenle, bunları dikkatli bir şekilde ele alın. Bu iki organik çözücüden herhangi biriyle temas içeren adımlarda plastik kullanımından kaçının. Bu adımlar için borosilikat cam pipetler kullanın. Bu pipetleri kullanmadan önce kloroform ve metanol ile yükseltin. Sadece organik çözücülere dayanıklı po...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Titorenko laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine tartışmalar için minnettarız. Olağanüstü hizmetler için Kütle Spektrometresi Biyolojik Uygulamalar Merkezi, Yapısal ve Fonksiyonel Genomik Merkezi ve Mikroskopi ve Hücresel Görüntüleme Merkezi'ni (hepsi Concordia Üniversitesi'nde) kabul ediyoruz. Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) (RGPIN 2014-04482 ve CRDPJ 515900 - 17) tarafından desteklenmiştir. K.M. Concordia Üniversitesi Armand C. Archambault Bursu ve Concordia Üniversitesi Sanat ve Bilim Dekanı Mükemmellik Ödülü tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

Referanslar

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 167suda z nen metabolitlermetabolomik profillememetabolik aktivitenin s nd r lmesipropidium iyod r boyamafloresan mikroskopimetabolitlerin ekstraksiyonuenerji ta y c molek llern kleotitleramino asitlermonosankaritlers v kromatografisik tle spektrometresi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır