使用液体色谱加上串联质谱法的 糖核 酸菌的定量元细胞学

摘要

我们提出了一个协议，用于识别和量化主要类别的水溶性代谢物在酵母 糖体中。所述方法通用、坚固且灵敏。它允许结构异构体和立体形式的水溶性代谢物彼此分离。

摘要

代谢学是一种用于识别和量化细胞、组织、器官、生物流体或生物体内许多低分子量中间体和代谢产物的方法。代谢学传统上侧重于水溶性代谢物。水溶性代谢体是综合细胞网络的最终产物，它集成了各种基因组、表观基因组、转录学、蛋白质组学和环境因素。因此，代谢分析直接评估了在各种生物体中过多的生物过程中对所有这些因素的行动结果。其中一种生物是初露头角的酵母 糖核酸，一种具有完全测序基因组的单细胞真核生物。由于 S.Cerevisiae 是适应综合分子分析，它被用作解剖真核细胞内许多生物过程背后的机制的模型。一种多功能的分析方法，用于对水溶性代谢体进行可靠、敏感和准确的定量评估，将为剖析这些机制提供基本方法。在这里，我们提出了一个协议，为代谢活性的优化条件淬火和水溶性代谢物提取从 S.Cerevisiae 细胞。该协议还描述了使用液相色谱加上串联质谱法（LC-MS/MS）对提取的水溶性代谢物进行定量分析。此处描述的非目标代谢学的 LC-MS/MS 方法用途广泛且坚固。它能够识别和量化370多种具有不同结构、物理和化学特性的水溶性代谢物，包括这些代谢物的不同结构异构体和立体体形式。这些代谢物包括各种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖解中间体和三碳循环中间体。非靶向代谢的LC-MS/MS方法非常敏感，允许在低至0.05pmol/μL的浓度下识别和量化某些水溶性代谢物。该方法已成功用于评估在不同条件下培养的野生型和突变酵母细胞的水溶性代谢体。

引言

水溶性代谢物是低分子量中间体和新陈代谢产物，有助于基本的细胞过程。这些进化保存的过程包括将营养转化为可用能量、大分子的合成、细胞生长和信号、细胞周期控制、基因表达的调节、应激反应、新陈代谢的转化后调节、线粒体功能的维持、车辆细胞贩运、自噬、细胞老化以及调节细胞死亡^1、2、3。

水溶性代谢物的许多基本作用是通过研究在萌芽酵母S.Cerevisiae1，3，4，7，9，14，15，16，17，18，19，20，21，22发现。这种单细胞真核生物是一个有用的模型有机体，通过解剖机制，水溶性代谢物有助于细胞过程，因为它的适应先进的生化，遗传和分子生物分析23，24，25，26。虽然非靶向代谢的LC-MS/MS方法已用于研究水溶性代谢物在萌芽酵母^{3、18、22、27}中的作用，但这种分析需要改进其多功能性、稳健性、灵敏度，以及区分这些代谢物的不同结构异构体和立体体形式的能力。

近年来，在将非靶向代谢物的LC-MS/MS方法应用于体内水溶性代谢物的分析方面取得了重大进展。然而，使用这种方法的许多挑战仍然是^{2，28，29，30，31，32，33，34，35，36。}这些挑战包括以下挑战。首先，许多水溶性代谢物的细胞内浓度低于目前使用的方法的敏感阈值。二是代谢活性淬火效率过低，细胞内代谢物淬火相关细胞泄漏程度过高，不适合现行方法:因此，目前使用的方法低估了水溶性代谢物的细胞内浓度。第三，现有方法不能区分特定代谢物的结构异构体（即具有相同化学公式但原子连接性的分子）或立体体（即具有相同化学公式和原子连接性的分子，但具有空间中不同的原子排列）:这防止了某些代谢物的正确注释，目前使用的方法。第四，现有的母离子（MS1）和二次离子（MS2）质量光谱在线数据库不完整:这会影响使用当前方法产生的原始 LC-MS/MS 数据对特定代谢物的正确识别和量化。第五，现有方法不能使用单一类型的代谢物提取来回收所有或大多数类型的水溶性代谢物。第六，现有方法不能使用单一类型的LC柱来分离所有或大多数类型的水溶性代谢物。

在这里，我们优化了在 S.cerevisiae 细胞内淬火的条件，在提取之前保持这些细胞内的大部分水溶性代谢物，并从酵母细胞中提取大多数类型的水溶性代谢物。我们开发了一种多功能、坚固和敏感的方法，用于基于LC-MS/MS的识别和量化从 S.Cerevisiae 细胞中提取的370多种水溶性代谢物。这种非靶向代谢方法能够评估各种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖解中间体和三碳基循环中间体的细胞内浓度。开发的LC-MS/MS方法允许识别和量化具有不同结构、物理和化学特性的不同结构异构体和立体形式的水溶性代谢物。

研究方案

1. 制造和消毒一种生长酵母的媒介

1. 用巴托普酮 （YP） 介质制作 180 mL 的完整酵母提取物。完整的 YP 介质包含 1% （w/v） 酵母提取物和 2% （w/v） 巴托普酮。
2. 将 180 mL 的 YP 介质均匀地分配到四个 250 mL 的埃伦迈尔烧瓶中。每个烧瓶都含有 45 mL 的 YP 介质。
3. 在 15 psi/121 °C 下自动包装 45 分钟，用 YP 介质对烧瓶进行消毒。

2. 野生型酵母菌株

1. 使用 BY4742（MAT+他 3 =1 leu2=0 lys2 =0 ura3+0） 应变。

3. 在含有2%葡萄糖的YP介质中生长酵母

1. 在 15 psi/121 °C 下自动夹紧 45 分钟，对 20% （w/v） 葡萄糖库存溶液进行消毒。
2. 将 5 mL 的自体 20% （w/v） 葡萄糖库存溶液添加到两个 Erlenmeyer 烧瓶中，并加入 45 mL 的消毒 YP 介质。YP 介质中的最终浓度葡萄糖为 2% （w/v）。
3. 使用微生物循环将酵母细胞接种到两个埃伦迈尔烧瓶中，YP介质含有2%葡萄糖。
4. 在200 rpm的旋转摇床中，在30°C下在夜间生长酵母细胞。
5. 以酵母文化为例。确定每 mL 培养物的酵母细胞总数。使用血细胞计计算细胞。

4. 细胞转移到YP介质中，细胞生长在2%的葡萄糖中

1. 将经过消毒的 20% （w/v） 葡萄糖库存溶液的 5 mL 加入到其余两个 Erlenmeyer 烧瓶中，并加入自动夹杂的 YP 介质。葡萄糖的最终浓度为2%（w/v）。
2. 将YP介质中含有5.0×10⁷ 细胞的2%葡萄糖的隔夜酵母培养物卷转移到两个Erlenmeyer烧瓶中，YP介质含有2%葡萄糖。使用无菌移液器进行细胞转移。
3. 在 200 rpm 的旋转摇床中，在 30 °C 下将酵母细胞生长至少 24 小时（如果实验需要，或更多）。

5. 制作试剂、准备实验室用具和设置细胞淬火设备

1. 准备以下: 1） 淬火溶液 （60% 高档 （>99.9%） 甲醇在 155 mM 碳酸氢铵 （ABC） 缓冲器， pH = 8.0）;2） 冰冷 ABC 溶液 （pH = 8.0）;3） 能够测量至 -20 °C 的数字温度计;4） 500 mL 大型离心机瓶:5） 预冷高速离心机，带有预冷却转子和预冷却的 500 mL 离心机瓶，均在 -5 °C;6） 代谢物提取管（15 mL高速玻璃离心机管，带聚四氟乙烯衬里盖）:和 7） 干冰。

6. 细胞淬火

1. 使用血细胞计确定每 ML YP 中含有 2% 葡萄糖培养物的酵母细胞数量。
2. 将含有 5.0 x 10⁸ 细胞的 2% 葡萄糖的 YP 介质培养体卷转移到预冷却的 500 mL 离心机瓶中。
3. 快速将装有细胞的离心机瓶填充至 200 mL 的淬火溶液，该溶液存储在 -20 °C 下。
4. 在 11，325 x g 的高速离心机中将瓶子离心，在 -5 °C 下 3 分钟离心。
5. 快速而温柔地从离心机中回收瓶子;轻轻拧开盖子，取出超高分子，而不会干扰颗粒。
6. 快速将细胞颗粒重新插入 10 毫升冰冷 ABC 缓冲器中，并将悬架转移到 15 mL 高速玻璃离心机管中，并配有聚四氟乙烯衬里盖，用于代谢物提取。
7. 在临床离心机中通过离心机在 3，000 x g 下收集细胞，在 0 °C 下采集 3 分钟。
8. 快速取出超高纳坦，将管子放在干冰上，开始代谢物提取或将管子储存在 -80 °C 下，直到提取。

7. 制备试剂、实验室用具和代谢物提取设备

1. 准备如下: 1） LC-MS 级氯仿:2） LC-MS级甲醇;3） LC级纳米纯净水:4） LC-MS 等级 （ACN）;5） 玻璃珠（酸洗，425-600μm）;6） 带带固定器的泡沫管支架套件的漩涡:7） 15 mL 高速玻璃离心机管，带聚四氟乙烯衬里盖;8） 小瓶女士;9） 干冰:10） 1.5 mL 管用乙醇洗一次，一次用 ACN 洗一次，用纳米纯净水洗一次。
   注:仅使用抗有机溶剂的聚丙烯制成的微管尖和管。

8. 代谢物提取

1. 要将代谢物保存在干冰上或从第 6.7 步储存在 -80 °C 管中，添加以下:1） 2 mL 氯仿储存在 -20 °C;2） 1 mL 甲醇储存在 -20 °C;3） 1mL 冰冷纳米纯净水:和 4） 200 μL 的 425-600 μm 酸洗玻璃珠。
2. 用铝箔盖住并关闭管子的口。将管子放在带固定器的泡沫管支架套件中，以中等速度（即设定为 6 的速度，其中 12 个是漩涡的最大速度）在 4 °C 下涡流 30 分钟，以方便代谢物提取。
3. 在冰上孵育管子15分钟（不是干冰！），促进蛋白质沉淀和上水与下有机相分离。
4. 在 3，000 x g 的临床离心机中离心管，在 4 °C 下 10 分钟。 此离心步骤允许将上水相（包含水溶性代谢物）与中间层（包含细胞碎片和蛋白质）和下部有机相（其中大部分含有脂质）分离。
5. 使用微管将上水相 （400 μL） 转移到洗过并标记为 1.5 mL 的管中，其中含有 800 μL 的 ACN，存储在 -20 °C 下。
   注:在将上水相添加到 ACN 后，将会有白云降水，保持在 -20 °C。
6. 将样品在桌面离心机中离心，在 13，400 x g 下离心 10 分钟，在 4 °C 下。
   注:离心后白云降水将消失。
7. 将 800 μL 从管中液体的上部转移到标记的 MS 小瓶。将样品存储在 0 °C 下，直到 LC-MS/MS 分析。

9. 为LC准备试剂、实验室用具和设备

1. 准备以下: 1） 漩涡:2） 超声波声波器:3） 玻璃瓶女士;4） 配备二进制泵、脱气器和自动采样器的 LC 系统;5） 材料 表中命名的 zwitterion 相色谱柱（5 μm 聚合物，150 x 2.1 毫米）:6） 柱加热器:和 7） 移动相，包括 A 相（5:95 ACN:水（v/v），含 20 mM 醋酸铵、pH = 8.0）和 B 相（100% ACN）。

10. LC提取代谢物分离

1. 将 MS 小瓶的内容置于超声波声波下 15 分钟。
2. 漩涡 MS 小瓶 3x 在室温下 10 秒 （RT） 。
3. 将 MS 小瓶放入井板中。
4. 在色谱仪期间，将柱保持在 45 °C，流量为 0.250 mL/min。将样品放在 0 °C 的井板中。 在色谱仪中需要使用的 LC 梯度请参阅表 1。
   注:从野生型菌株 BY4742 的细胞中提取的水溶性代谢物的代表性总离子色谱图见 图 1。通过正电离 [ESI （+） 模式执行的质谱分析，通过 LC 分离的代谢物进行识别和量化，如第 11 步所述。

11. LC分离的代谢物的质谱分析

1. 使用配备加热电喷雾电离 （HESI） 的质谱仪，对 LC 分离的水溶性代谢物进行识别和定量。使用质谱仪的分析仪用于MS1离子，将质谱仪的探测器用于MS2离子。分别使用 表 2 和表 3 中提供的设置进行依赖于数据的 MS1 离子和 MS2 离子的采集。
2. 在 ESI （+） 和 ESI （-） 模式下，使用 10 μL 的样本量进行注射。

12. 通过处理LC-MS/MS的原始数据来识别和量化不同的代谢物

1. 使用材料表中命名的软件，对原始LC-MS/MS文件中不同的水溶性代谢物进行识别和量化。本软件使用MS1进行代谢物定量，MS2用于代谢物鉴定。该软件利用最广泛策划的质量光谱碎片库，通过匹配MS光谱，使用LC-MS/MS原始数据对代谢物进行注释。该软件还使用MS1和同位素图案匹配的确切质量，使用在线数据库对代谢物进行注释。有关详细信息，请参阅图 2。
2. 使用可在线免费获得的数据库和光谱库（https://www.mzcloud.org），搜索原始数据的 MS2 光谱。

13. 通过碘化物（PI）染色和荧光显微镜对膜完整性进行检测

1. 按照第 6 步的描述进行细胞淬火后，用 15 mL 的 ABC 缓冲器彻底清洗淬火细胞，以去除淬火溶液。在 0 °C 下以 3，000 x g 的离心收集细胞 5 分钟。
2. 将细胞颗粒重新悬浮在 1 mL 的 ABC 缓冲器中，并添加 0.5 mL 的 PI 溶液（0.5 毫克/毫升）。
3. 漩涡管与样品3x为10s，并孵育它10分钟在黑暗和冰上。
4. 将样品在桌面离心机中离心，在 13，400 x g 下离心 10 分钟，在 4 °C 下。
5. 取出超高纳特，在 1 mL 的 ABC 缓冲器中重新使用颗粒。
6. 在 13，400 x g 下离心管，在 4 °C 下 10 分钟离心，并取出超高线。再重复此步骤 2 次，以删除绑定到细胞表面的 PI。
7. 将颗粒重新悬浮在 300 μL 的 ABC 缓冲器中。将悬浮的 10 μL 置于显微镜滑梯表面。
8. 用荧光显微镜捕捉差分干扰对比度 （DIC） 和荧光显微镜图像。使用在 593 nm 和 636 nm（分别）的激发和排放波长设置的过滤器。
9. 使用软件计算总细胞数（在 DIC 模式下）和荧光染色细胞的数量。此外，使用此软件确定单个细胞的染色强度。

结果

为了改进酵母细胞内水溶性代谢物的定量评估，我们优化了细胞淬火的条件，以便检测代谢物。为此目的的细胞淬火涉及快速逮捕细胞内的所有酶反应31，33，37，38。这种细胞代谢活性的抑制是任何方法在体内量化水溶性代谢物的重要步骤，因为它防止低估其细胞内浓?...

讨论

要成功使用此处描述的协议，请遵循下面描述的预防措施。氯仿和甲醇从实验室塑料制品中提取各种物质。因此，请谨慎处理。避免使用塑料的步骤，涉及接触这两种有机溶剂中的任何一个。使用硅酸盐玻璃移液器进行这些步骤。使用前用氯仿和甲醇将这些移液器升起。仅使用抗有机溶剂的聚丙烯制成的微管尖和管。在 LC-MS/MS 的样品准备过程中，在将气泡插入井板之前，先消除玻璃瓶中的所有气...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
L-histidine	Sigma	H8125
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Propidium iodide	Thermo Scientific	R37108
Uracil	Sigma	U0750
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles	Beckman	355664
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Beckman Coulter Centrifuge	Beckman	6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor	Beckman	JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Digital thermometer	Omega	HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer	Thermo Scientific	02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)	Sigma Milipore	150460
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Vortex	Fisher Scientific	2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm	Agilent Technologies	883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)	Sigma-Aldrich	G8772
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
Software
Compound Discoverer 3.1	Fisher Scientific	V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049