JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен протокол идентификации и количественного определения основных классов водорастворимых метаболитов в дрожжевых Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод является универсальным, надежным и чувствительным. Позволяет отделить структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов друг от друга.

Аннотация

Метаболомика - это методология, используемая для идентификации и количественной оценки многих низкомолекулярных промежуточных продуктов и продуктов метаболизма в клетке, ткани, органе, биологической жидкости или организме. Метаболомика традиционно фокусируется на водорастворимых метаболитах. Водорастворимый метаболом является конечным продуктом сложной клеточной сети, которая объединяет различные геномные, эпигеномные, транскриптомные, протеомные и экологические факторы. Следовательно, метаболомический анализ непосредственно оценивает результат действия для всех этих факторов во множестве биологических процессов в различных организмах. Одним из таких организмов является почкование дрожжей Saccharomyces cerevisiae,одноклеточный эукариот с полностью секвенированным геномом. Поскольку S. cerevisiae поддастся всестороннему молекулярному анализу, он используется в качестве модели для препарирования механизмов, лежащих в основе многих биологических процессов в эукариотической клетке. Универсальный аналитический метод для надежной, чувствительной и точной количественной оценки водорастворимого метаболома обеспечит необходимую методологию для анализа этих механизмов. Здесь представлен протокол оптимизации условий гашения метаболической активности и извлечения водорастворимых метаболитов из клеток S. cerevisiae. Протокол также описывает использование жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа экстрагированных водорастворимых метаболитов. Описанный здесь метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно оценить более 370 водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами, включая различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов. Эти метаболиты включают различные молекулы-носители энергии, нуклеотиды, аминокислоты, моносахариды, промежуточные продукты гликолиза и промежуточные продукты трикарбоксового цикла. Метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS чувствителен и позволяет идентифицировать и количественно оценить некоторые водорастворимые метаболиты в концентрациях до 0,05 пмоль/мкл. Метод успешно используется для оценки водорастворимых метаболомов диких и мутантных дрожжевых клеток, культивированных в различных условиях.

Введение

Водорастворимые метаболиты представляют собой низкомолекулярные промежуточные продукты и продукты метаболизма, которые способствуют необходимым клеточным процессам. Эти эволюционно сохраненные процессы включают преобразование питательных веществ в пригодную для использования энергию, синтез макромолекул, клеточный рост и передачу сигналов, контроль клеточного цикла, регуляцию экспрессии генов, реакцию на стресс, посттрансляционную регуляцию метаболизма, поддержание функциональности митохондрий, везикулярный клеточный транспорт, аутофагию, клеточное старение и регулируемую гибель клеток1,2,3.

Многие из этих важных ролей водорастворимых метаболитов были обнаружены исследованиями в почковых дрожжах S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Этот одноклеточный эукариот является полезным модельным организмом для рассечения механизмов, с помощью которых водорастворимые метаболиты способствуют клеточным процессам благодаря своей податливости передовым биохимическим, генетическим и молекулярно-биологическим анализам23,24,25,26. Хотя методы нецелевой метаболомики LC-MS/MS были использованы для изучения роли водорастворимых метаболитов в почковых дрожжах3,18,22,27,этот тип анализа требует улучшения его универсальности, надежности, чувствительности и способности различать различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов.

Последние годы отмечены значительными успехами в применении методов нецелевой метаболомики LC-MS/MS для профилирования водорастворимых метаболитов in vivo. Тем не менее, многие проблемы в использовании этой методологииостаются2,28, 29,30, 31,32,33,34,35,36. Эти проблемы включают в себя следующее. Во-первых, внутриклеточные концентрации многих водорастворимых метаболитов ниже порога чувствительности для применяемых в настоящее время методов. Во-вторых, эффективность гашения метаболической активности слишком низка, а степень связанной с гашением клеточной утечки внутриклеточных метаболитов слишком высока для современных методов; следовательно, используемые в настоящее время методы недооценивают внутриклеточные концентрации водорастворимых метаболитов. В-третьих, существующие методы не могут дифференцировать структурные изомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой, но разной атомной связностью) или стереоизомеры (т.е. молекулы с одинаковой химической формулой и атомной связностью, но с разным расположением атомов в пространстве) конкретных метаболитов; это препятствует правильной аннотации некоторых метаболитов используемыми в настоящее время методами. В-четвертых, существующие масс-спектральные онлайн-базы данных родительских ионов (MS1) и вторичных ионов (MS2) являются неполными; это влияет на правильную идентификацию и количественное определение конкретных метаболитов с использованием необработанных данных LC-MS/MS, полученных с помощью современных методов. В-пятых, существующие методы не могут использовать один тип экстракции метаболитов для восстановления всех или большинства классов водорастворимых метаболитов. В-шестых, существующие методы не могут использовать один тип колонки LC для отделения друг от друга всех или большинства классов водорастворимых метаболитов.

Здесь мы оптимизировали условия для гашения метаболической активности в клетках S. cerevisiae, поддержания большинства водорастворимых метаболитов в этих клетках перед экстракцией и извлечения большинства классов водорастворимых метаболитов из дрожжевых клеток. Мы разработали универсальный, надежный и чувствительный метод идентификации и количественной оценки более 370 водорастворимых метаболитов, извлеченных из клеток S. cerevisiae на основе LC-MS/MS. Этот метод нецелевой метаболомики позволяет оценить внутриклеточные концентрации различных молекул-энергоносителей, нуклеотидов, аминокислот, моносахаридов, промежуточных продуктов гликолиза и промежуточных продуктов трикарбоксового цикла. Разработанный метод LC-MS/MS позволяет идентифицировать и количественно оценить различные структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами.

протокол

1. Изготовление и стерилизация среды для выращивания дрожжей

  1. Сделайте 180 мл полного дрожжевого экстракта со средой бактопептона (YP). Полная среда YP содержит 1% (мас./об.) дрожжевого экстракта и 2% (мас./об.) бактопептона.
  2. Распределите 180 мл среды YP поровну на четыре колбы Эрленмейера по 250 мл. Каждая из этих колбы содержит 45 мл среды YP.
  3. Стерилизуйте колбы средой YP путем автоклавирования при 15 psi/121 °C в течение 45 мин.

2. Штамм дрожжей дикого типа

  1. Используйте штамм BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Выращивание дрожжей в среде YP, содержащей 2% глюкозы

  1. Стерилизуют 20% (мас./об.) раствор глюкозы путем автоклавирования при 15 psi/121 °C в течение 45 мин.
  2. Добавьте 5 мл автоклавного 20% (мас./об.) раствора глюкозы в каждую из двух колбы Эрленмейера с 45 мл стерилизованной среды YP. Конечная концентрация глюкозы в среде YP составляет 2% (мас./об.).
  3. Используйте микробиологическую петлю для инокуляции дрожжевых клеток в каждую из двух колб Эрленмейера со средой YP, содержащей 2% глюкозы.
  4. Выращивайте дрожжевые клетки в течение ночи при 30 °C во вращательном шейкере, установленном при 200 оборотах в минуту.
  5. Возьмите аликвот дрожжевой культуры. Определите общее количество дрожжевых клеток на мл культуры. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.

4. Перенос клеток и клетка растет в среде YP с 2% глюкозы

  1. Добавьте 5 мл стерилизованного 20% (мас./об.) раствора глюкозы в каждую из оставшихся двух колбы Эрленмейера с автоклавной средой YP. Конечная концентрация глюкозы составляет 2% (мас./об.).
  2. Перенесите объем ночной культуры дрожжей в среде YP с 2% глюкозой, содержащей общее количество 5,0 х 107 клеток, в каждую из двух колб Эрленмейера со средой YP, содержащей 2% глюкозы. Используйте стерильную пипетку для переноса клеток.
  3. Выращивайте дрожжевые клетки в течение не менее 24 ч (или более, если требует эксперимент) при 30 °C во вращательном шейкере, установленном при 200 оборотах в минуту.

5. Изготовление реагентов, подготовка лабораторной посуды и установка оборудования для закалки клеток

  1. Приготовить следующее: 1) закалочный раствор (60% полноценный (>99,9%) метанол в буфере бикарбоната аммония (АВС) 155 мМ, рН = 8,0); 2) ледяной раствор ABC (рН = 8,0); 3) цифровой термометр, способный измерять до -20 °C; 4) большие бутылки-центрифуги объемом 500 мл; 5) предварительно охлаждаемая высокоскоростная центрифуга с предварительно охлаждаемым ротором и предварительно охлаждаемыми 500 мл центрифужными баллончиками для этого ротора, все при -5 °C; 6) экстракционные трубки для метаболитов (высокоскоростные стеклянные центрифужные трубки по 15 мл с крышками с полиэтиленовой футерильной подкладкой); и 7) сухой лед.

6. Закалка ячеек

  1. Используйте гемоцитометр для определения количества дрожжевых клеток на мл YP с 2% культурой глюкозы.
  2. Переложите объем культуры в YP-среде с 2% глюкозой, содержащей общее количество 5,0 х 108 клеток, в предварительно охлажденные бутылки центрифуги объемом 500 мл.
  3. Быстро наполните бутылку центрифуги, содержащую ячейки объемом до 200 мл, закалочным раствором, хранящимся при -20 °C.
  4. Центрифугировать флаконы в высокоскоростной центрифуге при 11,325 х г в течение 3 мин при -5 °C.
  5. Быстро и нежно извлеките бутылку из центрифуги; аккуратно открутите крышку и удалите супернатант, не нарушая гранулу.
  6. Быстро повторно суспендировать ячейку гранулы в 10 мл ледяного abc-буфера и перенести суспензию в 15 мл высокоскоростной стеклянной центрифужированной трубки с политетрафторэтиленовым футериленовым колпачком для экстракции метаболитов.
  7. Собирают клетки путем центрифугирования в клинической центрифуге при 3000 х г в течение 3 мин при 0 °C.
  8. Быстро удалите супернатант и поместите трубку на сухой лед, чтобы начать экстракцию метаболита, или храните трубку при -80 °C до экстракции.

7. Подготовка реагентов, лабораторной посуды и оборудования для экстракции метаболитов

  1. Приготовить следующее: 1) хлороформ марки ЛК-МС; 2) метанол марки ЛК-МС; 3) наночистая вода марки LC; 4) класс ЛК-МС (АКН); 5) стеклянные шарики (кислотно-промытые, 425-600 мкм); 6) вихрь с комплектом держателей пенопластовых трубок с фиксатором; 7) высокоскоростные стеклянные центрифужные трубки емкостью 15 мл с крышками с полиэтиленовой футериной; 8) флаконы MS; 9) сухой лед; и 10) пробирки по 1,5 мл промывали один раз этанолом, один раз с ACN и один раз с наночистой водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только наконечники микропипеток и трубки из полипропилена, устойчивого к органическим растворителям.

8. Извлечение метаболитов

  1. К метаболитам, хранящимся на сухом льду или хранящимся при -80°С в пробирке со ступени 6.7, добавляют следующее: 1) 2 мл хлороформа, хранящегося при -20°С; 2) 1 мл метанола хранят при -20 °C; 3) 1 мл ледяной наночистой воды; и 4) 200 мкл стеклянных шариков 425-600 мкм, промытых кислотой.
  2. Накройте и закройте горловую часть трубки алюминиевой фольгой. Поместите трубки в комплект держателей пенопластовых трубок с ретейнером и вихрьте их в течение 30 мин на средней скорости (т.е. со скоростью, которая установлена на уровне 6, причем 12 является максимальной скоростью вихря) при 4 °C для облегчения экстракции метаболита.
  3. Инкубируйте трубку в течение 15 минут на льду (НЕ сухом льду!), чтобы способствовать осаждению белка и отделению верхней водной от нижней органической фазы.
  4. Центрифугировать трубку в клинической центрифуге при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Эта стадия центрифугирования позволяет отделить верхнюю водную фазу (содержащую водорастворимые метаболиты) от среднего слоя (содержащего клеточный мусор и белки) и от нижней органической фазы (содержащей в основном липиды).
  5. Используйте микропипетку для переноса верхней водной фазы (400 мкл) в промытую и маркированную трубку 1,5 мл, содержащую 800 мкл ACN, которая хранилась при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления верхней водной фазы в ACN будут осаждены белые облака, удерживая при -20 °C.
  6. Центрифугировать трубку с образцом в настольной центрифуге при 13 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осадки белого облака исчезнут после центрифугирования.
  7. Переложите 800 мкл из верхней части жидкости в пробирке в меченый флакон MS. Храните образец при 0 °C до тех пор, пока он не будет проанализирован LC-MS/MS.

9. Подготовка реагентов, лабораторной посуды и оборудования для ЛК

  1. Подготовьте следующее: 1) вихрь; 2) ультразвуковой ультразвуковой аппарат; 3) Флаконы из стекла MS; 4) LC-система, оснащенная бинарным насосом, дегассером и автосамплером; 5) цвиттерионно-фазовая хроматографическая колонка (полимер 5 мкм, 150 х 2,1 мм), названная в Таблице материалов; 6) колонный нагреватель; и 7) подвижные фазы, включая фазу А (5:95 ACN:вода (v/v) с 20 мМ ацетата аммония, рН = 8,0) и фазу B (100% ACN).

10. Разделение экстрагированных метаболитов по ЛК

  1. Подвергать содержание флакона MS ультразвуковой ультразвуковой энергии в течение 15 мин.
  2. Вихрь флакона MS 3x в течение 10 секунд при комнатной температуре (RT).
  3. Поместите флакон MS в пластину колодца.
  4. Во время хроматографа поддерживайте колонку при 45 °C и расходе 0,250 мл/мин. Держите образец в пластине скважины при 0 °C. Обратитесь к таблице 1 для градиентов LC, которые необходимо использовать во время хроматографии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативная общая ионная хроматограмма водорастворимых метаболитов, которые были извлечены из клеток штамма дикого типа BY4742, показана на фиг.1. Метаболиты, разделенные LC, были идентифицированы и количественно определены масс-спектрометрическим анализом, который проводили в режиме положительной ионизации [ESI (+)], как описано для этапа 11.

11. Масс-спектрометрический анализ метаболитов, разделенных ЛК

  1. Используйте масс-спектрометр, оснащенный нагретой электрораспрозреванием (HESI) для идентификации и количественного определения водорастворимых метаболитов, которые были разделены LC. Используйте анализатор масс-спектрометра для ионов MS1 и детектор масс-спектрометра для ионов MS2. Используйте параметры, приведенные в Таблицах 2 и 3 для получения ионов MS1 и MS2 в зависимости от данных соответственно.
  2. Используйте объем образца 10 мкл для инъекции в режимах ESI (+) и ESI (-).

12. Идентификация и количественное определение различных метаболитов путем обработки исходных данных из LC-MS/MS

  1. Используйте программное обеспечение, названное в Таблице материалов, для проведения идентификации и количественного определения различных водорастворимых метаболитов из необработанных файлов LC-MS/MS. Это программное обеспечение использует MS1 для количественного определения метаболитов и MS2 для идентификации метаболитов. Программное обеспечение использует наиболее широко курируемую библиотеку масс-спектральной фрагментации для аннотирования метаболитов с использованием необработанных данных LC-MS / MS путем сопоставления спектров MS. Это программное обеспечение также использует точную массу MS1 и соответствие изотопного паттерна для аннотирования метаболитов с использованием онлайн-баз данных. Подробности см. на рисунке 2.
  2. Используйте библиотеку баз данных и спектров, которая находится в свободном доступе онлайн (https://www.mzcloud.org), для поиска MS2 спектров необработанных данных.

13. Анализ целостности мембраны с помощью окрашивания и флуоресцентной микроскопии йодида пропидия (PI)

  1. После закалки клеток, выполненной, как описано на этапе 6, тщательно промыть закаленные клетки 15 мл буфера ABC для удаления закалочного раствора. Собирают клетки центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин при 0 °С.
  2. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл АВС-буфера и добавляют 0,5 мл раствора PI (0,5 мг/мл).
  3. Вихрь пробирку с образцом 3х в течение 10 с и высиживая ее в течение 10 мин в темноте и на льду.
  4. Центрифугировать трубку с образцом в настольной центрифуге при 13 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  5. Удалите супернатант и повторно суспендируют гранулу в 1 мл буфера ABC.
  6. Центрифугируют трубку при 13 400 х г в течение 10 мин при 4 °C и удаляют супернатант. Повторите этот шаг еще 2 раза, чтобы удалить PI, привязанный к поверхности ячейки.
  7. Повторно суспендируют гранулу в 300 мкл АВС-буфера. Поместите 10 мкл суспензии на поверхность слайда микроскопа.
  8. Захват изображений дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентной микроскопии с помощью флуоресцентного микроскопа. Используйте фильтр, настроенный на длинах волн возбуждения и излучения 593 нм и 636 нм (соответственно).
  9. Используйте программное обеспечение для подсчета общего числа клеток (в режиме DIC) и количества флуоресцентно окрашенных клеток. Кроме того, используйте это программное обеспечение для определения интенсивности окрашивания для отдельных клеток.

Результаты

Чтобы улучшить количественную оценку водорастворимых метаболитов в дрожжевой клетке, мы оптимизировали условия закалки клеток для обнаружения метаболитов. Закалка клеток для этой цели включает в себя быструю остановку всех ферментативных реакций внутри клетки

Обсуждение

Чтобы успешно использовать описанный здесь протокол, следуйте профилактическим мерам, описанным ниже. Хлороформ и метанол извлекают различные вещества из лабораторной пластичной посуды. Поэтому относитесь к ним с осторожностью. Избегайте использования пластмасс на этапах, которые в?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы выражаем признательность Центру биологических применений масс-спектрометрии, Центру структурной и функциональной геномики и Центру микроскопии и клеточной визуализации (все в Университете Конкордия) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482 и CRDPJ 515900 - 17). K.M. был поддержан стипендией Арманда К. Аршамбо Университета Конкордия и премией декана университета Конкордия за выдающиеся достижения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

Ссылки

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

167

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены