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  • Résumé
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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Résumé

La métabolomique est une méthodologie utilisée pour l’identification et la quantification de nombreux intermédiaires et produits de faible poids moléculaire du métabolisme dans une cellule, un tissu, un organe, un fluide biologique ou un organisme. La métabolomique se concentre traditionnellement sur les métabolites solubles dans l’eau. Le métabolome soluble dans l’eau est le produit final d’un réseau cellulaire complexe qui intègre divers facteurs génomiques, épigénomiques, transcriptomiques, protéomiques et environnementaux. Par conséquent, l’analyse métabolomique évalue directement le résultat de l’action pour tous ces facteurs dans une pléthore de processus biologiques au sein de divers organismes. L’un de ces organismes est la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, un eucaryote unicellulaire avec le génome entièrement séquencé. Parce que S. cerevisiae se prête à des analyses moléculaires complètes, il est utilisé comme modèle pour disséquer les mécanismes sous-jacents à de nombreux processus biologiques au sein de la cellule eucaryote. Une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise du métabolome soluble dans l’eau fournirait la méthodologie essentielle pour disséquer ces mécanismes. Nous présentons ici un protocole pour les conditions optimisées de trempe de l’activité métabolique et d’extraction des métabolites solubles dans l’eau des cellules de S. cerevisiae. Le protocole décrit également l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des métabolites solubles dans l’eau extraits. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée décrite ici est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques, y compris différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de ces métabolites. Ces métabolites comprennent diverses molécules porteuses d’énergie, des nucléotides, des acides aminés, des monosaccharides, des intermédiaires de la glycolyse et des intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS de métabolomique non ciblée est sensible et permet l’identification et la quantification de certains métabolites solubles dans l’eau à des concentrations aussi faibles que 0,05 pmol/μL. La méthode a été utilisée avec succès pour évaluer les métabolomes solubles dans l’eau de cellules de levure de type sauvage et mutantes cultivées dans différentes conditions.

Introduction

Les métabolites solubles dans l’eau sont des intermédiaires de faible poids moléculaire et des produits du métabolisme qui contribuent aux processus cellulaires essentiels. Ces processus conservés de manière évolutionnaire comprennent la conversion des nutriments en énergie utilisable, la synthèse de macromolécules, la croissance et la signalisation cellulaires, le contrôle du cycle cellulaire, la régulation de l’expression des gènes, la réponse au stress, la régulation post-traductionnelle du métabolisme, le maintien de la fonctionnalité mitochondriale, le trafic cellulaire vésiculaire, l’autophagie, le vieillissement cellulaire et la mort cellulaire régulée1,2,3.

Beaucoup de ces rôles essentiels des métabolites solubles dans l’eau ont été découverts par des études dans la levure bourgeonnante S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Cet eucaryote unicellulaire est un organisme modèle utile pour disséquer les mécanismes par lesquels les métabolites solubles dans l’eau contribuent aux processus cellulaires en raison de son aptitude aux analyses biochimiques, génétiques et biologiques moléculairesavancées23,24,25,26. Bien que les méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée aient été utilisées pour étudier les rôles des métabolites solubles dans l’eau dans les levures bourgeonnantes3,18,22,27, ce type d’analyse nécessite l’amélioration de sa polyvalence, de sa robustesse, de sa sensibilité et de sa capacité à distinguer les différents isomères structurels et les formes stéréoisomériques de ces métabolites.

Ces dernières années sont marquées par des progrès significatifs dans l’application des méthodes LC-MS/MS de métabolomique non ciblée au profilage des métabolites solubles dans l’eau in vivo. Cependant, de nombreux défis dans l’utilisation decetteméthodologierestent 2,28 , 29,30,31,32,33,34,35,36. Ces défis sont les suivants. Premièrement, les concentrations intracellulaires de nombreux métabolites solubles dans l’eau sont inférieures à un seuil de sensibilité pour les méthodes actuellement utilisées. Deuxièmement, l’efficacité de la trempe de l’activité métabolique est trop faible et l’étendue des fuites cellulaires associées à la trempe des métabolites intracellulaires est trop élevée pour les méthodes actuelles; par conséquent, les méthodes actuellement utilisées sous-estiment les concentrations intracellulaires de métabolites solubles dans l’eau. Troisièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas différencier les isomères structuraux (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique mais une connectivité atomique différente) ou les stéréoisomères (c’est-à-dire des molécules ayant la même formule chimique et la même connectivité atomique, mais avec un arrangement atomique différent dans l’espace) de métabolites spécifiques; cela empêche l’annotation correcte de certains métabolites par les méthodes actuellement utilisées. Quatrièmement, les bases de données en ligne sur le spectral de masse des ions parents (MS1) et des ions secondaires (MS2) sont incomplètes; cela affecte l’identification et la quantification correctes de métabolites spécifiques à l’aide des données brutes LC-MS/MS produites à l’aide des méthodes actuelles. Cinquièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type d’extraction de métabolites pour récupérer toutes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau. Sixièmement, les méthodes existantes ne peuvent pas utiliser un seul type de colonne LC pour séparer les unes des autres toutes les classes ou la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau.

Ici, nous avons optimisé les conditions pour la trempe de l’activité métabolique dans les cellules de S. cerevisiae, en maintenant la plupart des métabolites solubles dans l’eau dans ces cellules avant l’extraction et en extrayant la plupart des classes de métabolites solubles dans l’eau des cellules de levure. Nous avons développé une méthode polyvalente, robuste et sensible pour l’identification et la quantification basées sur LC-MS/MS de plus de 370 métabolites solubles dans l’eau extraits de cellules de S. cerevisiae. Cette méthode de métabolomique non ciblée permet d’évaluer les concentrations intracellulaires de diverses molécules porteuses d’énergie, nucléotides, acides aminés, monosaccharides, intermédiaires de glycolyse et intermédiaires du cycle tricarboxylique. La méthode LC-MS/MS développée permet l’identification et la quantification de différents isomères structuraux et formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau ayant diverses propriétés structurelles, physiques et chimiques.

Protocole

1. Fabrication et stérilisation d’un milieu de culture de levure

  1. Faire 180 mL d’un extrait de levure complet avec un milieu de bactopéptone (YP). Le milieu YP complet contient 1% (p / v) d’extrait de levure et 2% (w / v) de bactopéptone.
  2. Répartir 180 mL du milieu YP également dans quatre flacons d’Erlenmeyer de 250 mL. Chacune de ces fioles contient 45 mL du milieu YP.
  3. Stériliser les flacons avec un milieu YP par autoclavage à 15 psi/121 °C pendant 45 min.

2. Souche de levure de type sauvage

  1. Utilisez la souche BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Cultiver de la levure dans le milieu YP contenant 2% de glucose

  1. Stériliser une solution stock de glucose à 20 % (p/v) par autoclavage à 15 psi/121 °C pendant 45 min.
  2. Ajouter 5 mL de la solution trapue autoclavée à 20 % (p/v) de glucose dans chacune des deux fioles d’Erlenmeyer avec 45 mL du milieu YP stérilisé. La concentration finale de glucose dans le milieu YP est de 2% (p / v).
  3. Utilisez une boucle microbiologique pour inoculer des cellules de levure dans chacune des deux fioles d’Erlenmeyer avec le milieu YP contenant 2% de glucose.
  4. Cultivez les cellules de levure pendant la nuit à 30 °C dans un agitateur rotatif réglé à 200 tr/min.
  5. Prenez une aliquote de culture de levure. Déterminer le nombre total de cellules de levure par mL de culture. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

4. Transfert cellulaire et croissance cellulaire dans le milieu YP avec 2% de glucose

  1. Ajouter 5 mL de la solution stock stérilisée à 20 % (p/v) de glucose à chacune des deux fioles d’Erlenmeyer restantes avec le milieu YP autoclavé. La concentration finale de glucose est de 2% (p / v).
  2. Transférer un volume de la culture de levure pendant la nuit dans un milieu YP avec 2% de glucose contenant le nombre total de 5,0 x 107 cellules dans chacune des deux fioles d’Erlenmeyer avec le milieu YP contenant 2% de glucose. Utilisez une pipette stérile pour le transfert de cellules.
  3. Cultivez les cellules de levure pendant au moins 24 h (ou plus, si l’expérience l’exige) à 30 °C dans un agitateur rotatif réglé à 200 tr/min.

5. Fabrication de réactifs, préparation de matériel de laboratoire et mise en place d’équipements pour la trempe des cellules

  1. Préparer ce qui suit : 1) une solution de trempe (60 % de méthanol de haute qualité (>99,9 %) dans un tampon de 155 mM de bicarbonate d’ammonium (ABC), pH = 8,0); 2) une solution ABC glacée (pH = 8,0); 3) un thermomètre numérique capable de mesurer jusqu’à -20 °C; 4) grandes bouteilles de centrifugeuse de 500 mL; 5) une centrifugeuse à grande vitesse pré-refroidie avec un rotor pré-refroidi et des bouteilles de centrifugeuse pré-refroidies de 500 mL pour ce rotor, le tout à -5 °C; 6) tubes d’extraction de métabolites (tubes centrifuges en verre à grande vitesse de 15 mL avec bouchons doublés de polytétrafluoroéthylène); et 7) la glace carbonique.

6. Trempe des cellules

  1. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules de levure par mL de YP avec une culture de glucose à 2%.
  2. Transférer un volume de la culture dans un milieu YP avec 2% de glucose contenant le nombre total de 5,0 x 108 cellules dans des bouteilles de centrifugeuse pré-refroidies de 500 mL.
  3. Remplissez rapidement le flacon de centrifugeuse contenant les cellules jusqu’à un volume de 200 mL avec une solution de trempe stockée à -20 °C.
  4. Centrifuger les bouteilles dans une centrifugeuse à grande vitesse à 11 325 x g pendant 3 min à -5 °C.
  5. Récupérer rapidement et tendrement la bouteille de la centrifugeuse; dévissez doucement le couvercle et retirez le surnageant sans déranger la pastille.
  6. Remettez rapidement en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de tampon ABC glacé et transférez la suspension dans un tube de centrifugeuse en verre à grande vitesse de 15 mL avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène pour l’extraction des métabolites.
  7. Prélever des cellules par centrifugation dans une centrifugeuse clinique à 3 000 x g pendant 3 min à 0 °C.
  8. Retirez rapidement le surnageant et placez le tube sur de la glace carbonique pour commencer l’extraction des métabolites ou stockez le tube à -80 °C jusqu’à l’extraction.

7. Préparation des réactifs, du matériel de laboratoire et de l’équipement pour l’extraction des métabolites

  1. Préparer ce qui suit : 1) chloroforme de qualité LC-MS; 2) méthanol de qualité LC-MS; 3) eau nano-pure de qualité LC; 4) Grade LC-MS (ACN); 5) perles de verre (lavées à l’acide, 425-600 μm); 6) un vortex avec un kit de support de tube en mousse avec dispositif de retenue; 7) tubes centrifuges en verre à grande vitesse de 15 mL avec bouchons revêtus de polytétrafluoroéthylène; 8) flacons de SEP; 9) glace carbonique; et 10) des tubes de 1,5 mL lavés une fois à l’éthanol, une fois avec de l’ACN et une fois avec de l’eau nano-pure.
    REMARQUE: Utilisez uniquement des embouts de micropipette et des tubes en polypropylène résistant aux solvants organiques.

8. Extraction des métabolites

  1. Aux métabolites conservés sur de la glace carbonique ou stockés à -80 °C à partir de l’étape 6.7, ajouter ce qui suit : 1) 2 mL de chloroforme stockés à -20 °C ; 2) 1 mL de méthanol stocké à -20 °C; 3) 1 mL d’eau nano-pure glacée; et 4) 200 μL de 425 à 600 μm de billes de verre lavées à l’acide.
  2. Couvrir et fermer la bouche d’un tube avec du papier d’aluminium. Placez les tubes dans un kit de porte-tubes en mousse avec dispositif de retenue et vortexez-les pendant 30 minutes à vitesse moyenne (c.-à-d. à une vitesse fixée à 6, 12 étant la vitesse maximale d’un vortex) à 4 °C pour faciliter l’extraction des métabolites.
  3. Incuber le tube pendant 15 min sur de la glace (PAS de la glace carbonique !) pour favoriser la précipitation des protéines et la séparation de l’aqueux supérieur de la phase organique inférieure.
  4. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Cette étape de centrifugation permet de séparer la phase aqueuse supérieure (qui contient des métabolites solubles dans l’eau) de la couche intermédiaire (qui contient des débris cellulaires et des protéines) et de la phase organique inférieure (qui contient principalement des lipides).
  5. Utilisez une micropipette pour transférer la phase aqueuse supérieure (400 μL) dans un tube lavé et étiqueté de 1,5 mL contenant 800 μL d’ACN qui a été stocké à -20 °C.
    REMARQUE: Il y aura des précipitations nuageuses blanches après l’ajout de la phase aqueuse supérieure à ACN maintenue à -20 ° C.
  6. Centrifuger le tube avec l’échantillon dans une centrifugeuse de table à 13 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE: Les précipitations nuageuses blanches disparaîtront après centrifugation.
  7. Transférer 800 μL de la partie supérieure d’un liquide dans le tube vers un flacon MS étiqueté. Conservez l’échantillon à 0 °C jusqu’à ce qu’il soit analysé par LC-MS/MS.

9. Préparation des réactifs, des articles de laboratoire et de l’équipement pour la LC

  1. Préparez ce qui suit : 1) un vortex; 2) un sonicateur à ultrasons; 3) flacons en verre MS; 4) un système LC équipé d’une pompe binaire, d’un dégazeur et d’un échantillonneur automatique; 5) une colonne de chromatographie en phase zwitterionique (polymère de 5 μm, 150 x 2,1 mm) nommée dans la table des matériaux; 6) un chauffe-colonne; et 7) les phases mobiles, y compris la phase A (5:95 ACN:eau (v/v) avec 20 mM d’acétate d’ammonium, pH = 8,0) et la phase B (100 % ACN).

10. Séparation des métabolites extraits par LC

  1. Soumettre le contenu du flacon MS à une sonication par ultrasons pendant 15 min.
  2. Vortex le flacon MS 3x pendant 10 secondes à température ambiante (RT).
  3. Placez le flacon de SEP dans la plaque du puits.
  4. Pendant le chromatographe, maintenir la colonne à 45 °C et un débit de 0,250 mL/min. Conserver l’échantillon dans la plaque du puits à 0 °C. Reportez-vous au tableau 1 pour connaître les gradients LC qui doivent être utilisés pendant la chromatographie.
    REMARQUE : Un chromatogramme ionique total représentatif des métabolites solubles dans l’eau qui ont été extraits de cellules de la souche de type sauvage BY4742 est illustré à la figure 1. Les métabolites séparés par LC ont été identifiés et quantifiés par spectrométrie de masse qui a été réalisée en mode d’ionisation positive [ESI (+)], comme décrit pour l’étape 11.

11. Analyse par spectrométrie de masse des métabolites séparés par LC

  1. Utilisez un spectromètre de masse équipé d’une ionisation par électropulvérisation chauffée (HESI) pour l’identification et la quantification des métabolites solubles dans l’eau qui ont été séparés par LC. Utilisez l’analyseur du spectromètre de masse pour les ions MS1 et le détecteur du spectromètre de masse pour les ions MS2. Utilisez les paramètres fournis dans les tableaux 2 et 3 pour l’acquisition en fonction des données des ions MS1 et MS2, respectivement.
  2. Utilisez un volume d’échantillon de 10 μL pour l’injection dans les modes ESI (+) et ESI (-).

12. Identification et quantification des différents métabolites par le traitement des données brutes de LC-MS/MS

  1. Utilisez le logiciel nommé dans la Table des matériaux pour effectuer l’identification et la quantification de différents métabolites solubles dans l’eau à partir de fichiers LC-MS/MS bruts. Ce logiciel utilise MS1 pour la quantification des métabolites et MS2 pour l’identification des métabolites. Le logiciel exploite la bibliothèque de fragmentation spectrale de masse la plus organisée pour annoter les métabolites à l’aide des données brutes LC-MS/MS en faisant correspondre les spectres MS. Ce logiciel utilise également la masse exacte de MS1 et la correspondance des modèles isotopiques pour annoter les métabolites à l’aide de bases de données en ligne. Voir la figure 2 pour plus de détails.
  2. Utilisez la bibliothèque de bases de données et de spectres, disponible gratuitement en ligne (https://www.mzcloud.org), pour rechercher des spectres MS2 des données brutes.

13. Dosage de l’intégrité de la membrane par coloration à l’iodure de propidium (PI) et microscopie à fluorescence

  1. Après la trempe des cellules effectuée comme décrit à l’étape 6, lavez soigneusement les cellules trempées avec 15 mL de tampon ABC pour éliminer la solution de trempe. Prélever les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min à 0 °C.
  2. Resuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon ABC et ajoutez 0,5 mL de la solution PI (0,5 mg/mL).
  3. Vortex un tube avec l’échantillon 3x pendant 10 s et l’incuber pendant 10 min dans l’obscurité et sur la glace.
  4. Centrifuger le tube avec l’échantillon dans une centrifugeuse de table à 13 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
  5. Retirez le surnageant et ressuspendez la pastille dans 1 mL de tampon ABC.
  6. Centrifuger le tube à 13 400 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez cette étape 2 fois de plus pour supprimer le PI lié à la surface de la cellule.
  7. Resuspendez la pastille dans 300 μL de tampon ABC. Placez 10 μL de la suspension sur la surface d’une lame de microscope.
  8. Capturez les images de contraste d’interférence différentielle (DIC) et de microscopie à fluorescence avec un microscope à fluorescence. Utilisez un filtre configuré aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 593 nm et 636 nm (respectivement).
  9. Utilisez un logiciel pour compter le nombre total de cellules (en mode DIC) et le nombre de cellules colorées par fluorescence. Utilisez également ce logiciel pour déterminer l’intensité de la coloration pour les cellules individuelles.

Résultats

Pour améliorer une évaluation quantitative des métabolites solubles dans l’eau dans une cellule de levure, nous avons optimisé les conditions de trempe cellulaire pour la détection des métabolites. La trempe cellulaire à cette fin implique un arrêt rapide de toutes les réactions enzymatiques au seind’unecellule31,33,37,38. Un tel arrêt de l’activ...

Discussion

Pour utiliser avec succès le protocole décrit ici, suivez les mesures préventives décrites ci-dessous. Le chloroforme et le méthanol extraient diverses substances de la matière plastique de laboratoire. Par conséquent, manipulez-les avec prudence. Évitez l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent un contact avec l’un de ces deux solvants organiques. Utilisez des pipettes en verre borosilicate pour ces étapes. Augmentez ces pipettes avec du chloroforme et du méthanol avant utilisation. Utili...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous reconnaissons le Centre pour les applications biologiques de la spectrométrie de masse, le Centre de génomique structurale et fonctionnelle et le Centre de microscopie et d’imagerie cellulaire (tous de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CNSR) du Canada (RGPIN 2014-04482 et CRDPJ 515900 - 17). K.M. a été soutenu par la bourse Armand C. Archambault de l’Université Concordia et le Prix d’excellence du doyen des arts et des sciences de l’Université Concordia.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

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