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Resumen

Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

Resumen

La metabolómica es una metodología utilizada para la identificación y cuantificación de muchos productos intermedios de bajo peso molecular y productos del metabolismo dentro de una célula, tejido, órgano, fluido biológico u organismo. La metabolómica se centra tradicionalmente en los metabolitos solubles en agua. El metaboloma soluble en agua es el producto final de una compleja red celular que integra varios factores genómicos, epigenómicos, transcriptómicos, proteómicos y ambientales. Por lo tanto, el análisis metabolómico evalúa directamente el resultado de la acción para todos estos factores en una gran cantidad de procesos biológicos dentro de varios organismos. Uno de estos organismos es la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae,un eucariota unicelular con el genoma completamente secuenciado. Debido a que S. cerevisiae es susceptible de análisis moleculares exhaustivos, se utiliza como modelo para diseccionar los mecanismos subyacentes a muchos procesos biológicos dentro de la célula eucariota. Un método analítico versátil para la evaluación cuantitativa robusta, sensible y precisa del metaboloma soluble en agua proporcionaría la metodología esencial para diseccionar estos mecanismos. Aquí presentamos un protocolo para las condiciones optimizadas de enfriamiento de la actividad metabólica y la extracción de metabolitos solubles en agua de las células de S. cerevisiae. El protocolo también describe el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis cuantitativo de los metabolitos solubles en agua extraídos. El método LC-MS/MS de metabolómica no dirigida descrito aquí es versátil y robusto. Permite la identificación y cuantificación de más de 370 metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas, incluidos diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de estos metabolitos. Estos metabolitos incluyen varias moléculas portadoras de energía, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos, intermediarios de la glucólisis e intermedios del ciclo tricarboxílico. El método LC-MS/MS de metabolómica no dirigida es sensible y permite la identificación y cuantificación de algunos metabolitos solubles en agua a concentraciones tan bajas como 0,05 pmol/μL. El método se ha utilizado con éxito para evaluar metabolomas solubles en agua de células de levadura mutantes y de tipo silvestre cultivadas en diferentes condiciones.

Introducción

Los metabolitos solubles en agua son intermedios de bajo peso molecular y productos del metabolismo que contribuyen a los procesos celulares esenciales. Estos procesos conservados evolutivamente incluyen la conversión de nutrientes en energía utilizable, síntesis de macromoléculas, crecimiento celular y señalización, control del ciclo celular, regulación de la expresión génica, respuesta al estrés, regulación post-tralacional del metabolismo, mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial, tráfico celular vesicular, autofagia, envejecimiento celular y muerte celular regulada1,2,3.

Muchos de estos papeles esenciales de los metabolitos solubles en agua han sido descubiertos por estudios en la levadura en ciernes S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Este eucariota unicelular es un organismo modelo útil para diseccionar mecanismos a través de los cuales los metabolitos solubles en agua contribuyen a los procesos celulares debido a su capacidad para realizar análisis bioquímicos, genéticos y biológicos moleculares avanzados23,24,25,26. Aunque los métodos LC-MS/MS de metabolómica no dirigida se han utilizado para estudiar las funciones de los metabolitos solubles en agua en la levadura en ciernes3,18,22,27,este tipo de análisis requiere la mejora de su versatilidad, robustez, sensibilidad y capacidad para distinguir entre diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de estos metabolitos.

Los últimos años están marcados por avances significativos en la aplicación de los métodos LC-MS/MS de metabolómica no dirigida al perfil de metabolitos solubles en agua in vivo. Sin embargo, muchos desafíos en el uso de esta metodología siguensiendo 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Estos desafíos incluyen los siguientes. En primer lugar, las concentraciones intracelulares de muchos metabolitos solubles en agua están por debajo de un umbral de sensibilidad para los métodos utilizados actualmente. En segundo lugar, la eficiencia del enfriamiento de la actividad metabólica es demasiado baja, y el grado de fuga celular asociada al enfriamiento de metabolitos intracelulares es demasiado alto para los métodos actuales; por lo tanto, los métodos utilizados actualmente subestiman las concentraciones intracelulares de metabolitos solubles en agua. En tercer lugar, los métodos existentes no pueden diferenciar los isómeros estructurales (es decir, moléculas con la misma fórmula química pero diferente conectividad atómica) o estereoisómeros (es decir, moléculas con la misma fórmula química y conectividad atómica, pero con la diferente disposición atómica en el espacio) de metabolitos específicos; esto impide la correcta anotación de ciertos metabolitos por los métodos utilizados actualmente. Cuarto, las bases de datos en línea espectrales de masas existentes de iones padres (MS1) e iones secundarios (MS2) están incompletas; esto afecta a la correcta identificación y cuantificación de metabolitos específicos utilizando los datos brutos de LC-MS/MS producidos con la ayuda de los métodos actuales. En quinto lugar, los métodos existentes no pueden utilizar un solo tipo de extracción de metabolitos para recuperar todas o la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua. En sexto lugar, los métodos existentes no pueden utilizar un solo tipo de columna LC para separar entre sí todas o la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua.

Aquí, optimizamos las condiciones para apagar la actividad metabólica dentro de las células de S. cerevisiae, manteniendo la mayoría de los metabolitos solubles en agua dentro de estas células antes de la extracción y extrayendo la mayoría de las clases de metabolitos solubles en agua de las células de levadura. Desarrollamos un método versátil, robusto y sensible para la identificación y cuantificación basada en LC-MS/MS de más de 370 metabolitos solubles en agua extraídos de células de S. cerevisiae. Este método de metabolómica no dirigida permite evaluar las concentraciones intracelulares de varias moléculas portadoras de energía, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos, intermediarios de la glucólisis e intermedios del ciclo tricarboxílico. El método LC-MS/MS desarrollado permite la identificación y cuantificación de diferentes isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua con diversas propiedades estructurales, físicas y químicas.

Protocolo

1. Hacer y esterilizar un medio para el cultivo de levadura

  1. Hacer 180 ml de un extracto de levadura completo con medio de bactopeptona (YP). El medio YP completo contiene 1% (p/v) de extracto de levadura y 2% (p/v) de bactopeptona.
  2. Distribuya 180 ml del medio YP por igual en cuatro matraces Erlenmeyer de 250 ml. Cada uno de estos matraces contiene 45 ml del medio YP.
  3. Esterilizar los matraces con medio YP en autoclave a 15 psi/121 °C durante 45 min.

2. Cepa de levadura de tipo salvaje

  1. Utilice la cepa BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Cultivo de levadura en el medio YP que contiene 2% de glucosa

  1. Esterilizar una solución de glucosa al 20% (p/v) mediante autoclave a 15 psi/121 °C durante 45 min.
  2. Añadir 5 ml de la solución de glucosa al 20% (p/v) en autoclave a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer con 45 ml del medio YP esterilizado. La concentración final de glucosa en el medio YP es del 2% (p/v).
  3. Utilice un asa microbiológica para inocular las células de levadura en cada uno de los dos matraces de Erlenmeyer con el medio YP que contiene 2% de glucosa.
  4. Cultive las células de levadura durante la noche a 30 °C en un agitador rotacional a 200 rpm.
  5. Tome una alícuota de cultivo de levadura. Determinar el número total de células de levadura por ml de cultivo. Cuente las células con un hemocitómetro.

4. Transferencia celular y crecimiento celular en el medio YP con 2% de glucosa

  1. Añadir 5 ml de la solución de glucosa esterilizada al 20% (p/v) a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer restantes con el medio YP en autoclave. La concentración final de glucosa es del 2% (p/v).
  2. Transfiera un volumen del cultivo de levadura durante la noche en medio YP con 2% de glucosa que contenga el número total de 5.0 x 107 células en cada uno de los dos matraces Erlenmeyer con el medio YP que contenga 2% de glucosa. Use una pipeta estéril para la transferencia celular.
  3. Cultive las células de levadura durante al menos 24 h (o más, si el experimento lo requiere) a 30 °C en un agitador rotacional a 200 rpm.

5. Fabricación de reactivos, preparación de material de laboratorio y configuración de equipos para el enfriamiento celular

  1. Prepare lo siguiente: 1) una solución de enfriamiento (60% de metanol de alto grado (>99.9%) en tampón de bicarbonato de amonio (ABC) de 155 mM, pH = 8.0); 2) una solución ABC helada (pH = 8.0); 3) un termómetro digital capaz de medir hasta -20 °C; 4) botellas de centrífuga grandes de 500 ml; 5) una centrífuga de alta velocidad preenfriada con un rotor preenfriado y botellas de centrífuga de 500 ml preenfriadas para este rotor, todo a -5 °C; 6) tubos de extracción de metabolitos (tubos de centrífuga de vidrio de alta velocidad de 15 ml con tapas revestidas de politetrafluoroetileno); y 7) hielo seco.

6. Enfriamiento celular

  1. Use un hemocitómetro para determinar el número de células de levadura por ml de YP con cultivo de glucosa al 2%.
  2. Transfiera un volumen del cultivo en medio YP con 2% de glucosa que contenga el número total de 5.0 x 108 células en botellas de centrífuga preenfriadas de 500 ml.
  3. Llene rápidamente el frasco de centrífuga que contiene las células hasta el volumen de 200 ml con una solución de enfriamiento almacenada a -20 °C.
  4. Centrifugar las botellas en una centrífuga de alta velocidad a 11.325 x g durante 3 min a -5 °C.
  5. Recupere rápida y tiernamente la botella de la centrífuga; Desenrosque suavemente la tapa y retire el sobrenadante sin molestar el pellet.
  6. Resuspeda rápidamente el pellet celular en 10 ml de tampón ABC helado y transfiera la suspensión a un tubo centrífuga de vidrio de alta velocidad de 15 ml con una tapa revestida de politetrafluoroetileno para la extracción de metabolitos.
  7. Recoger células por centrifugación en una centrífuga clínica a 3.000 x g durante 3 min a 0 °C.
  8. Retire rápidamente el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo seco para comenzar la extracción del metabolito o guarde el tubo a -80 °C hasta la extracción.

7. Preparación de reactivos, material de laboratorio y equipos para la extracción de metabolitos

  1. Prepare lo siguiente: 1) cloroformo de grado LC-MS; 2) Metanol de grado LC-MS; 3) Agua nano-pura de grado LC; 4) Grado LC-MS (ACN); 5) perlas de vidrio (lavadas con ácido, 425-600 μm); 6) un vórtice con un kit de soporte de tubo de espuma con retenedor; 7) Tubos centrífugos de vidrio de alta velocidad de 15 ml con tapas revestidas de politetrafluoroetileno; 8) viales de EM; 9) hielo seco; y 10) tubos de 1,5 ml lavados una vez con etanol, una vez con ACN y una vez con agua nano-pura.
    NOTA: Use solo puntas y tubos de micropipetas hechos de polipropileno que sea resistente a los solventes orgánicos.

8. Extracción de metabolitos

  1. A los metabolitos mantenidos en hielo seco o almacenados a -80 °C del tubo a partir de la etapa 6.7, añádase lo siguiente: 1) 2 ml de cloroformo almacenado a -20 °C; 2) 1 ml de metanol almacenado a -20 °C; 3) 1 ml de agua nano-pura helada; y 4) 200 μL de perlas de vidrio lavadas con ácido de 425-600 μm.
  2. Cubra y cierre la boca de un tubo con papel de aluminio. Coloque los tubos en un kit de soporte de tubo de espuma con retenedor y vórtice durante 30 minutos a velocidad media (es decir, a una velocidad que se establece en 6, siendo 12 la velocidad máxima de un vórtice) a 4 ° C para facilitar la extracción de metabolitos.
  3. Incubar el tubo durante 15 minutos en hielo (¡NO hielo seco!) para promover la precipitación de proteínas y la separación de la fase orgánica superior de la inferior.
  4. Centrifugar el tubo en una centrífuga clínica a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C. Este paso de centrifugación permite separar la fase acuosa superior (que contiene metabolitos solubles en agua) de la capa media (que contiene restos celulares y proteínas) y de la fase orgánica inferior (que contiene principalmente lípidos).
  5. Utilice una micropipeta para transferir la fase acuosa superior (400 μL) a un tubo lavado y etiquetado de 1,5 ml que contenga 800 μL de ACN que se almacenó a -20 °C.
    NOTA: Habrá precipitación de nubes blancas después de agregar la fase acuosa superior a ACN mantenida a -20 ° C.
  6. Centrifugar el tubo con la muestra en una centrífuga de mesa a 13.400 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: La precipitación de nubes blancas desaparecerá después de la centrifugación.
  7. Transfiera 800 μL de la porción superior de un líquido en el tubo a un vial de EM etiquetado. Conservar la muestra a 0 °C hasta que sea analizada por LC-MS/MS.

9. Preparación de reactivos, artículos de laboratorio y equipos para LC

  1. Prepare lo siguiente: 1) un vórtice; 2) un sonicador ultrasónico; 3) viales de vidrio MS; 4) un sistema LC equipado con una bomba binaria, desgasificador y muestreador automático; 5) una columna de cromatografía en fase zwitteriónica (polímero de 5 μm, 150 x 2,1 mm) nombrada en la Tabla de Materiales; 6) un calentador de columna; y 7) fases móviles, incluyendo la fase A (5:95 ACN:agua (v/v) con 20 mM de acetato de amonio, pH = 8,0) y la fase B (100% ACN).

10. Separación de metabolitos extraídos por LC

  1. Sometá el contenido del vial de EM a sonicación ultrasónica durante 15 min.
  2. Vórtice el vial de MS 3x durante 10 segundos a temperatura ambiente (RT).
  3. Coloque el vial de EM en la placa del pozo.
  4. Durante el cromatógrafo, mantenga la columna a 45 °C y un caudal de 0,250 ml/min. Mantenga la muestra en la placa del pozo a 0 °C. Consulte la Tabla 1 para conocer los gradientes lc que deben utilizarse durante la cromatografía.
    NOTA: En la Figura 1se muestra un cromatograma iónico total representativo de metabolitos solubles en agua que se extrajeron de células de la cepa de tipo salvaje BY4742. Los metabolitos separados por LC se identificaron y cuantificaron mediante análisis espectrométrico de masas que se realizó en modo de ionización positiva [ESI (+)], como se describe para el paso 11.

11. Análisis espectrométrico de masas de metabolitos separados por LC

  1. Utilice un espectrómetro de masas equipado con ionización por electrospray calentada (HESI) para la identificación y cuantificación de metabolitos solubles en agua que fueron separados por LC. Utilice el analizador del espectrómetro de masas para los iones MS1 y el detector del espectrómetro de masas para los iones MS2. Utilice la configuración proporcionada en la Tabla 2 y la Tabla 3 para la adquisición dependiente de datos de iones MS1 y MS2, respectivamente.
  2. Utilice un volumen de muestra de 10 μL para la inyección en los modos ESI (+) y ESI (-).

12. Identificación y cuantificación de diferentes metabolitos mediante el tratamiento de datos brutos de LC-MS/MS

  1. Utilice el software nombrado en la Tabla de materiales para llevar a cabo la identificación y cuantificación de diferentes metabolitos solubles en agua a partir de archivos LC-MS/MS sin procesar. Este software utiliza MS1 para la cuantificación de metabolitos y MS2 para la identificación de metabolitos. El software explota la biblioteca de fragmentación espectral de masas más ampliamente seleccionada para anotar los metabolitos utilizando los datos brutos LC-MS / MS haciendo coincidir los espectros MS. Este software también utiliza la masa exacta de MS1 y la coincidencia de patrones de isótopos para anotar metabolitos utilizando bases de datos en línea. Consulte la Figura 2 para obtener más información.
  2. Utilice la biblioteca de bases de datos y espectros, que está disponible gratuitamente en línea (https://www.mzcloud.org), para buscar espectros MS2 de los datos sin procesar.

13. Ensayo de integridad de membrana mediante tinción de yoduro de propidio (PI) y microscopía de fluorescencia

  1. Después de que el enfriamiento de celdas se realice como se describe para el paso 6, lave bien las celdas apagadas con 15 ml de búfer ABC para eliminar la solución de enfriamiento. Recoger las células por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a 0 °C.
  2. Resuspónda el pellet celular en 1 ml de tampón ABC y agregue 0,5 ml de la solución PI (0,5 mg /ml).
  3. Vórtice un tubo con la muestra 3x durante 10 s e incube durante 10 min en la oscuridad y en hielo.
  4. Centrifugar el tubo con la muestra en una centrífuga de mesa a 13.400 x g durante 10 min a 4 °C.
  5. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en 1 ml de tampón ABC.
  6. Centrifugar el tubo a 13.400 x g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces más para quitar el PI unido a la superficie celular.
  7. Resuspend el pellet en 300 μL de tampón ABC. Coloque 10 μL de la suspensión en la superficie de un portaobjetos de microscopio.
  8. Capture las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. Utilice un filtro configurado en las longitudes de onda de excitación y emisión de 593 nm y 636 nm (respectivamente).
  9. Utilice un software para contar el número total de células (en el modo DIC) y el número de células teñidas fluorescentemente. Además, utilice este software para determinar la intensidad de la tinción para células individuales.

Resultados

Para mejorar una evaluación cuantitativa de los metabolitos solubles en agua dentro de una célula de levadura, optimizamos las condiciones de enfriamiento celular para la detección de metabolitos. El enfriamiento celular para este propósito implica una detención rápida de todas las reacciones enzimáticas dentro de una célula31,33,37,38. Tal detención de...

Discusión

Para utilizar con éxito el protocolo descrito aquí, siga las medidas preventivas que se describen a continuación. El cloroformo y el metanol extraen diversas sustancias de los artículos de plástico de laboratorio. Por lo tanto, manejarlos con precaución. Evite el uso de plásticos en pasos que impliquen contacto con cualquiera de estos dos disolventes orgánicos. Use pipetas de vidrio de borosilicato para estos pasos. Levante estas pipetas con cloroformo y metanol antes de su uso. Use solo puntas de micropipeta y t...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Titorenko por las discusiones. Reconocemos al Centro de Aplicaciones Biológicas de espectrometría de masas, al Centro de Genómica Estructural y Funcional y al Centro de Microscopía e Imágenes Celulares (todos en la Universidad de Concordia) por sus excelentes servicios. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá (RGPIN 2014-04482 y CRDPJ 515900 - 17). K.M. fue apoyado por la Beca Armand C. Archambault de la Universidad de Concordia y el Premio a la Excelencia del Decano de Artes y Ciencias de la Universidad de Concordia.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Ammonium acetateFisher ScientificA11450
Ammonium bicarbonateSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlucoseFisher ScientificD16-10
L-histidineSigmaH8125
L-leucineSigmaL8912
L-lysineSigmaL5501
MethanolFisher ScientificA4564
MethanolFisher ScientificA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Yeast extractFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottlesBeckman355664
Agilent 1100 series LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugeBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuge RotorBeckmanJA-10
Centra CL2 clinical centrifugeThermo Scientific004260F
Digital thermometerOmegaHH509
Foam Tube Holder Kit with RetainerThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Ultrasonic sonicatorFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µmAgilent Technologies883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined capsFisher Scientific60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined capsPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742DharmaconYSC1049

Referencias

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