JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تظهر الفئران المتعرضة للأوزون والبكتيريا مجتمعة موت الخلايا واسع الانتشار، بما في ذلك موت العدلات. لاحظنا التكيفات الخلوية مثل تعطيل اللاميلبوديا الهيكل الخلوي، وزيادة التعبير الخلوي من وحدة فرعية V ATP synthase المعقدة β والأنجيوستاتين في الحمم الهوائية القصبية، وقمع الاستجابة المناعية الرئة وتأخير تجنيد العدلات.

Abstract

تواجه الرئتين باستمرار الإهانات المباشرة وغير المباشرة في شكل حالات التهابية معقمة (جزيئات أو سموم تفاعلية) ومعدية (بكتيرية أو فيروسية أو فطرية). قد تؤدي استجابة المضيف الساحقة إلى تعرض التنفس للخطر وإصابة الرئة الحادة ، والتي تتميز بتوظيف العدلات الرئوية نتيجة للاستجابة المناعية المضيفة المنطقية المرضية والتخثرية وإعادة عرض الأنسجة. تعتبر الطرق المجهرية الحساسة لتصور وقياس التكيفات الخلوية الرئوية المورينية ، استجابة للأوزون منخفض الجرعة (0.05 صفحة في المليون) ، وهو ملوث بيئي قوي بالاشتراك مع شحم الدهون البكتيري ، وهو ناهض TLR4 ، حاسمة من أجل فهم آليات الالتهاب والإصلاح المضيفة. نحن نصف تحليل مجهري فلوري شامل لمختلف مقصورات الرئة والجسم الجهازية ، وهي سائل الحمم الهوائية الحويصلات ، وثقب الأوعية الدموية الرئوية ، والتبريد الرئوي الأيسر ، وثقب نخاع العظم القصي. نظهر تلف الضامة السنفية ، العدلات ، الأنسجة الرئوية ، وكذلك خلايا نخاع العظام في ارتباط مع استجابة مناعية متأخرة (تصل إلى 36-72 ساعة) تتميز بتدرجات chemokine منفصلة في المقصورات التي تم تحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم مصفوفة الرئة خارج الخلية والتفاعلات الخلوية الخلوية الخلوية (أكتين، توبولين)، الميتوكوندريا وأنواع الأكسجين التفاعلية، البلازمينوجين المضادة للتخثر، وشظايا الببتيد المضادة للأجيوجين أنجيوستاتين، والميتوكوندريا ATP synthase مجمع V الوحدات الفرعية، α β. هذه العلامات البديلة، عندما تستكمل مع المقايسات الكافية في المختبر القائم على الخلايا وتقنيات التصوير الحيواني في الجسم الحي مثل المجهر داخل الجسم، يمكن أن توفر معلومات حيوية نحو فهم استجابة الرئة لعوامل المناعة الجديدة.

Introduction

إصابة الرئة الحادة (ALI) هي استجابة مرضية حاسمة للرئتين للمحفزات المعدية أو غيرها من المحفزات الضارة التي تتميز بالتنشيط المتزامن للجهاز المناعي التخثري والشظي والفطري1. العدلات الشعور على الفور الميكروبات وكذلك أنماط الضرر داخل الخلايا من خلال مستقبلات مثل حصيلة (TLR) الأسرة2،3،4. تطلق العدلات السيتوكينات مسبقة التشكيل ومحتويات الحبيبات السامة للخلايا ، والتي يمكن أن تسبب بعد ذلك تلفا جانبيا في الأنسجة. ويشوب الضرر السنفي الذي أعقب ذلك مع موت الخلايا الثانوية مما يؤدي إلى إطلاق جزيئات مثل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)5، وبالتالي وضع في حلقة مفرغة من خلل التنظيم المناعي.

مشكلة لم تحل في فهم ALI تتعلق بمسألة كيفية بدء الإصابة داخل الغشاء الحويصلي. مجمع نقل الإلكترون V، F1F0 ATP synthase، هو بروتين الميتوكوندريا المعروف أن أعرب في كل مكان، على الخلية (بما في ذلك البطانية، الكريات البيض، الظهارية) غشاء البلازما أثناء الالتهاب. هيكل الخلية الخلوي الذي يتكون من أكتين وتوبولين، يؤوي العديد من شكل الخلية وتعديل الوظائف وكذلك البروتينات الميتوكوندريا، على التوالي. لقد أظهرنا مؤخرا أن الحصار المفروض على SYNTHASE ATP بواسطة جزيء داخلي، أنجيوستاتين، يسكت تجنيد العدلات، والتنشيط وlipopolysaccharide (LPS) الناجم عن التهاب الرئة6. وهكذا، قد تنظم كل من الآليات الكيميائية الحيوية (ATP synthase) والمناعة (TLR4) حاجز الحويصلات أثناء التهاب الرئة.

التعرض للأوزون (O3)،وهو ملوث بيئي، يضعف وظائف الرئة، ويزيد من التعرض للالتهابات الرئوية، ومستويات منخفضة قصيرة من التعرض O3 تزيد من خطر الوفيات في أولئك الذين يعانون من أمراض القلب والجهاز التنفسي الكامنة7،8،9،10،11،12،13،14. وهكذا، والتعرض لتركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من O3 يوفر نموذجا ذا مغزى من ALIلدراسةالآليات الأساسية للالتهاب 7،8. وقد أنشأت مختبرنا مؤخرا نموذج مورين من جرعة منخفضة O3 المستحثة ALI15. بعد إجراء جرعة والاستجابة الزمنية لتركيزات O3 منخفضة، لاحظنا أن التعرض ل0.05 ppm O3 لمدة 2 ساعة، يؤدي إلى إصابة الرئة الحادة التي تتميز الرئة ATP synthase مجمع β الفرعي الخامس (ATPа) والتعبير أنجيوستاتين، على غرار نموذج LPS. كشف التصوير الرئوي داخل الفيتية عدم تنظيم ال أكتين الحويصلات الدقيقة التي تشير إلى تلف الرئة، واجتثاث من أنواع الأكسجين التفاعلي الحاجز السني (ROS) مستويات (مما يدل على إلغاء إشارات الخلايا الأساسية) وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (مما يشير إلى موت الخلايا الحادة) بعد التعرض 2 ساعة إلى 0.05 جزء في المليون O315 التي ترتبط مع الرئة غير المتجانسة 18FDG الاحتفاظ16،تجنيد العدلات وإطلاق السيتوكين، أبرزها IL-16 و SDF-1α. الرسالة التي تحظى بها دراساتنا الحديثة هي أن O 3 ينتجسمية عالية بشكل كبير عند التعرض بتركيزات أقل من الحدود المسموح بها البالغة 0.063 جزء في المليون أكثر من 8 ساعة (يوميا) للتعرض البشري. الأهم من ذلك ، لا يوجد فهم واضح حول ما إذا كانت هذه التعرضات دون السريرية O3 يمكن أن تعدل الآليات بوساطة TLR4 مثل السموم الداخلية البكتيرية17. وهكذا، درسنا نموذج التعرض O3 وLPS مزدوجة الضرب ولاحظنا التكيفات الخلوية المناعية وغير المناعية.

نحن نصف تحليل مجهري فلوري شامل لمختلف مقصورات الرئة والجسم الجهازية ، وهي سائل الحمم الهوائية الهوائية (أي ، BAL) الذي عينات من المساحات السنفية، وتغلغل الأوعية الدموية الرئة (أي LVP) أن عينات الأوعية الدموية الرئوية وانترستيتيوم الحاجز السنفي في حالة وجود حاجز البطانية للخطر، والتبريد الرئة اليسرى، للنظر في الكريات البيض parenchymal المقيمين وأتباع اليسار في أنسجة الرئة المحمى ، الدم المحيطي الذي يمثل الكريات البيض المتداولة ونخاع عظم القص والفخذ التي تتذوق المواقع القريبة والبادئة لتعبئة الخلايا الدموية أثناء الالتهاب ، على التوالي.

Protocol

وقد وافق مجلس أخلاقيات البحوث الحيوانية في جامعة ساسكاتشوان على تصميم الدراسة والتزم بالمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان للاستخدام الإنساني للحيوانات. تم شراء الفئران الذكور C57BL/6J البالغ من العمر ستة أسابيع. ملاحظة: القتل الرحيم أي الحيوانات التي تتطور الخمول الشديد، والضائقة التنفسية أو غيرها من علامات الضيق الشديد قبل نقطة النهاية المقررة.

ملاحظة: إعداد ما يلي: 27-18 G إبرة حادة (سوف تعتمد على قطر القصبة الهوائية الماوس)، أنابيب PE الحجم المناسب لتناسب الإبرة حادة (جعل قنية PE لكل فأر)، قنية، 2 مقص حاد، 2 ملقط حاد (صغير)، 1 ملقط حاد (صغير)، 3 1 مل المحاقن، وأنابيب الميكروفوغ المسمى (لBAL، الدم، الأوعية الدموية وجمع نخاع العظام perfusate) وقوارير وصفت (لتثبيت الأنسجة)، أكياس العينة / cryovials لجمع الأنسجة، لفة خيط القطن الجزار (مقطعة إلى أربطة الحجم الكافي). جميع المواد الكيميائية المستخدمة في التجارب مبينة في جدول المواد.

1. التعرض للأوزون وLPS لتحريض إصابة الرئة مورين

  1. التعرض للأوزون
    1. إعداد مربع تعريف O3 مخصص. إضافة تغذية الماوس وزجاجة المياه ولعب التخصيب والفراش نظيفة من أجل وتقليد البيئة السكنية الفئران.
      ملاحظة: هذه الخطوات سوف تضمن أن الفئران لديها حرية الوصول إلى الغذاء والماء عندما يسكن في مربع التعريفي مخصص وسيساعد على تخفيف الإجهاد لا مبرر له.
    2. قم بتبديل جهاز المعايرة/المولد O3 "ON" (الموضوع باتجاه منفذ المدخل) لتثبيت مصباح الأشعة فوق البنفسجية قبل اليد (حوالي 15 دقيقة قبل التعرض) والاتصال بشاشة O3 في الخط.
      ملاحظة: يجب أن تقرأ شاشة O3 ما متوسطه 0.05 جزء في المليون، كما تم أخذ عينات من المنفذ في درجة حرارة هواء الغرفة الثابتة (72 ±3 درجة فهرنهايت) والرطوبة النسبية (50±15٪).
    3. بالنسبة لتعرض O3 ، ضع الفئران برفق في مربع التعريفي المخصص وعرض الفئران باستمرار إلى 0.05 ppm O3 لمدة 2 ساعة.
  2. التخدير وإدارة LPS داخل الرحم
    1. إعداد 10 ملغ / مل الأسهم للكيتامين والإكسيلازين, بشكل منفصل.
    2. إعداد كوكتيل عن طريق خلط 20 أجزاء من الكيتامين وجزء واحد من الزيلازين. إذا كان الفأر يزن X g، قم بحقن (X/200) مل من كوكتيل الكيتامين / الإكسيلازين في تجويف الصفاق. لفأر واحد، وإعداد 1 مل من كوكتيل تتألف من 1000 ميكرولتر من المخزون 10 ملغ / مل الكيتامين و 50 ميكرولتر من المخزون xylazine. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في أنبوب microfuge.
      ملاحظة: يمكن إعداد مخزون الكيتامين والإكسيلازين قبل أسبوع.
    3. تخدير الفئران تحت ضوء داخل الصفاق (IP) الكيتامين (50 ملغم / كغ) / xylazine (1 ملغ / كغ) مزيج (على سبيل المثال، ل25 غرام الماوس، وحقن 0.125 مل من الكوكتيل).
    4. إعداد محلول 1 ملغ / مل من LPS، في المالحة، وملء 50 ميكرولتر من الحل في ماصة.
    5. عقد الماوس تستقيم مع ظهره / الجانب الظهري على النخيل، وعقد الأذنين بنفس اليد. الآن ، ضع 50 ميكرولتر من محلول LPS18 بلطف خارج الخياشيم (أي 25 ميكرولتر على كل منخر أو 50 ميكرولتر في فتحة أنف واحدة ؛ لا يهم طالما أن الإجراء سريع) والسماح للفئران باستنشاق محلول LPS.
    6. غرس الفئران السيطرة مع 50 ميكرولتر من المالحة المعقمة.
      تحذير:لا تتجاوز أكثر من 100 ميكرولتر لغرس، والتي يمكن أن تكون قاتلة. أقل من حجم (أي <50 ميكرولتر) وهناك خطر ترسب الأنف فقط.
    7. بعد إدارة LPS ، وضع الفئران بلطف ، إما على بطنهم أو ظهورهم على كومة الفراش مع رؤوسهم الزاوية إلى أسفل قليلا.
      ملاحظة: هذا التوجه يطيل الاحتفاظ بالمحلول في تجويف الأنف19.
    8. في 0, 2, 4, 24, 36 و 72 ح بعد التعرض, تخدير الفئران أي p. مع جرعة كاملة من الكيتامين (200 ملغ /كغ)/xylazine (4 ملغ/كغ) مزيج (أي, X/50 مل من الكوكتيل, حيث X هو وزن الماوس في غرام أو 0.50 مل ل25 غرام الماوس).
    9. مراقبة الماوس حتى يفقد وعيه ومنعكس الحق (أي، لا يعود عندما وضعت في موقف supine). الآن، تحقق من الماوس لعمق التخدير، من خلال رصد التنفس (الرحلات الصدر الإيقاعي) ومعدل ضربات القلب، والتي ينبغي أن تنخفض بشكل ملحوظ، بعد 1-2 دقيقة.
    10. بعد ذلك ، تحقق من ردود الفعل دواسة أي قرصة أي من الأرقام في الأطراف الخلفية ومراقبة للتراجع عن الطرف ، كرد فعل. إذا كان الماوس يستجيب، أعلى المتابعة مع حقن إضافية 0.1 مل أو أكثر، كما هو مطلوب.
      ملاحظة: لتحقيق التخدير العميق، نضع في اعتبارنا أن بعض السلالات أو الفئران البدينة وعادة ما يكون حجم أكبر من التوزيع، وبالتالي يمكن بسهولة الإفراط في مداواة، إذا كان الوقت الكافي إذا لم يسمح للتخدير الكامل (والتي يمكن أن تكون حوالي 10 دقيقة أو أكثر). وبناء على ذلك، يمكن أن تكون بعض السلالات مقاومة للتخدير وبالتالي تتطلب المزيد من الأعلى المنبثقة. يتم الحصول على هذه المعرفة بعد العديد من الملاحظات العملية والخبرة مع الفئران من سلالات مختلفة والعمر. كما تم إجراء عدد قليل من التجارب التجريبية أيضا مباشرة بعد التعرض O3 وLPS (أي في 2 ساعة نقطة زمنية)، أدرجنا أيضا بعض تحليل الخلية BAL في وقت مبكر جدا من تلك التجارب لتسليط الضوء على الآثار المباشرة للتعرض O3وLPS مجتمعة.

2. جمع العينات

  1. ضع الماوس على صينية جراحية. الآن، وضع بلطف مرهم العين التشحيم على كلتا العينين لتجنب فقدان السوائل وتطهير الماوس مع رذاذ الإيثانول 70٪.
    1. إجراء تخفيضات صغيرة من خلال أغشية الجلد العلوي والسفلي مع مقص، لفضح القصبة الهوائية والصدر.
    2. جعل قطع فقط تحت القص وفضح القلب.
  2. ثقب القلب
    1. ضع إبرة 25G تعلق على حقنة الهيباريني في البطين الأيمن ورسم الدم عن طريق ثقب القلب.
      ملاحظة: عادة ما يسحب الدم مع الحد الأدنى من رسم المكبس، إذا كان الوقت من تعريض القلب لثقب القلب أقل من دقيقة. بعد جمع حوالي 0.4-0.5 مل، قد يحتاج المرء إلى وقفة لبضع ثوان قبل جمع الدم المتبقي. ويتم ذلك للسماح للقلب ضخ أي حجم المتبقية في غرفة البطين الأيمن. في نهاية جمع الدم، يتوقف القلب عن الضخ.
    2. جمع الدم وتخزينها في أنابيب microfuge لمزيد من المعالجة.
  3. فغر القصبة الهوائية
    1. استخدام ملاقط بعناية / ملقط حادة لمسح قبالة منطقة القصبة الهوائية من الأنسجة المفرطة. استخدام قفاز اليدين أكثر من الأدوات الجراحية لتجنب النزيف. إذا كان الكثير من الدم ناز، وهناك خطر تلويث عينات BAL. استخدام مسحات القطن، إذا لزم الأمر، على الرغم من عدم تفضيل. كيمويب هي بدائل أفضل.
    2. الآن، قطع من خلال القفص الصدري لفضح الرئتين. مرة أخرى، يجب توخي الحذر من قطع القص والشرايين الوربية أو الشريان الأورطي الصاعد. إجراء تخفيضات أصغر أثناء التقدم من خلال القفص الصدري)
    3. تمرير ربط القطن تحت قصاصة القصبة الهوائية وترك على هذا النحو في الوقت الحاضر.
    4. قص القصبة الهوائية في مكان مناسب فيالجزء الثالث من النزال ، مشيرا نحو الرئتين ، للسماح بالوصول إلى قنية القصبة الهوائية 28 G.
    5. أدخل قنية PE 28 G (طول الحد الأدنى من 3-5 مم ونهاية البعيدة قلصت لسهولة الإدراج) في القصبة الهوائية. احترس من نهاية القصبة الهوائية قبل التشعب ثم سحب حوالي مم مرة أخرى لتجنب أخذ العينات فص واحد فقط.
    6. بحزم، ربط ربطة القطن لعقد القنية في مكانها. لا تنهار القنية.
  4. حمم برونشو الحويصلات الهوائية (BAL)
    1. ملء 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في حقنة 1 مل.
    2. الآن حقن تدريجيا 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في القنية بمساعدة حقنة 1 مل.
    3. بعد حقن برنامج تلفزيوني، يستنشق المحقنة طالما أنها لا تقاوم الشفط.
      ملاحظة: إذا كان هناك مقاومة أثناء قرصنة السائل BAL بها، وهذا يشير إلى انهيار الأنسجة الهوائية أو الشعب الهوائية. في هذه الحالة، سحب القنية بواسطة صغير لفصل القنية شكل جدران الأنسجة.
    4. جمع السائل يستنشق في أنبوب microfuge وصفت ومكان على الجليد.
    5. أداء اثنين من أكثر lavages بطريقة مماثلة جمع في نفس القارورة (أي ما مجموعه 0.5 × 3 = 1.5 مل lavage).
    6. قياس حجم السائل بال التي تم جمعها. Lavage الانتعاش ينبغي أن تكون قريبة من 90 ٪.
  5. تغلغل الأوعية الدموية الرئوية (LVP)
    1. قطع الشريان الأورطي الصدري التنازلي في موقع بين أنصاف الصدر والبطن، لتجنب أي احتياطية من perfusate في الرئتين في حين تتغلغل من خلال البطين الأيمن.
    2. لطخة تجويف بالقرب من نهاية الشريان الأورطي قطع، خالية من الدم.
    3. بعد ذلك، يتغلغل في الرئتين مع 0.5 مل من درجة حرارة الغرفة المالحة حقن من خلال البطين الأيمن.
    4. جمع perfusate الأوعية الدموية من تجويف في نهاية قطع الشريان الأورطي الصدري تنازلي، في أنبوب microfuge، وضعت على الجليد وقياس حجمه.
    5. Ligate الشعب الهوائية الحق قريبة من تفريعها من القصبة الهوائية (مع خيط القطن).
  6. تثبيت الرئة اليسرى في الموقع
    1. قم بتوصيل حقنة 1 مل بقنية القصبة الهوائية، وهي طويلة بما يكفي لإدخالها من خلال شق القصبة الهوائية السابق.
    2. سحب الهواء مرة أخرى في حقنة تصل إلى 0.6 مل علامة.
    3. ثم، ملء المحاقن المتبقية (حتى النهاية) مع 2٪ paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن المكبس على استعداد لموسيقى البوب دون امتصاص أي هواء من القنية.
    4. الآن، لصق المحقنة مع شريط سكوتش، إلى حاوية تستقيم، تقاس تصل إلى 20 سم الارتفاع.
    5. بلطف، رسم المكبس للسماح تدفق مثبت نحو القصبة الهوائية. في حالة وجود عدد قليل من فقاعات الهواء في القنية ، ضع المكبس برفق فوق الحقنة وسيبدأ السائل في التدفق بعد بضع ثوان.
    6. دع الرئة اليسرى تتضخم إلى طاقتها الإجمالية في الموقع، لمدة 5 دقائق ، من ارتفاع 20 سم تشكيل عمود الماء 20 سم.
    7. خلال هذا الإجراء، تأكد من حماية فصوص الرئة اليمنى من الحصول على اتصال مع paraformaldehyde لأن هذا سوف يؤثر على المقايسات المصب.
    8. ضع أنسجة مختبرية مطوية لامتصاص أي بارافورمالديهايد قد تلامس فصوص الرئة اليمنى.
      تنبيه: البارافورمالديهايد شديد السمية. لذلك، لا تستنشق أو تضع الاتصال بأي أجزاء مكشوفة من الجسم. توخي الحذر الشديد أثناء التعامل معها.
    9. خلال فترة غرس البارافورمالديهيد ، تعقيم البطن.
    10. قطع فصوص الرئة اليمنى من القصبة الهوائية التأكد من إزالة أي خيط ووضع الفصوص على الفور في cryovial وصفت وإسقاطه في النيتروجين السائل لتحليل السيتوكين الجزيئية / الكيميائية الحيوية المصب / RT-PCR / تحليل لطخة الغربية من تجانس الرئة.
    11. تقليم بعناية الرئة اليسرى لأي النسيج الضام أو الأغشية الجنبية وتراجع في 2٪ paraformaldehyde لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
    12. تضمين الرئة الثابتة في البارافين وفقا لبروتوكول تضمين القياسية.
      تحذير: لا تبالغ في تسخين عينات الرئة.
    13. قطع جزء البطن وإزالة الجلد من الحوض (الورك) العظام.
    14. فصل عظام عظم الفخذ الأيسر والأيمن من الجزء الحوض، في طبق بتري مملوءة المالحة أبقى على الجليد.
  7. جمع عظم عظم القص ونخاع الفخذ
    1. تنظيف الأنسجة والعضلات من العظام باستخدام الأنسجة المختبرية.
    2. جمع القفص الصدري البطني والقص في طبق بيتري مملوءة المالحة أبقى على الجليد.
    3. قطع النصائح البعيدة والقربة من عظام القص وعظم الفخذ.
    4. Perfuse العظام 4 مرات مع 0.5 مل من المالحة، وذلك باستخدام الإبر المجهزة جيدا (24 إلى 28 G) على إلى 1 مل المحاقن، وجمع الكسور من كل عظمة في أنابيب وصفت مزودة مرشحات ووضعها على الجليد.
      ملاحظة: يختلف مقياس الإبرة بين حجم الحيوان. بعد التنظيف ، يجب أن تظهر عظمة الفخذ شفافة.
    5. وبمجرد جمع العينات، ضع الفأر في كيس بلاستيكي ووضع في ثلاجة جثث الحيوانات للتخلص منها بشكل صحيح، وفقا للمبادئ التوجيهية للمرفق الحيواني المؤسسي.

3. معالجة العينات

  1. مجموع (TLC) والتفاضلي (DLC) عدد الكريات البيض
    1. أجهزة الطرد المركزي الدم المحيطي، BAL، الرئة الأوعية الدموية وثقب نخاع العظم (القص وعظم الفخذ) عينات لمدة 10 دقيقة في 500 غرام.
    2. جمع supernatants ، فلاش تجميدها وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
    3. إعادة تشكيل الخلايا في الحد الأدنى من 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    4. أداء TLC عن طريق عد BAL, دم, الرئة الأوعية الدموية perfusate وخلايا نخاع العظام على مقياس الدم.
    5. وصمة عار أخرى 9 ميكرولتر aliquot من BAL مع مزيج 1 ميكرولتر من كالسين الأخضر والأحمر ethidium homodimer-1 لقياس الخلايا الحية (الخضراء) بسبب نشاط استراز داخل الخلية وأي خلايا BAL التالفة (باللون الأحمر) بسبب فقدان سلامة غشاء البلازما.
    6. إضافة 2٪ حمض الخليك إلى الليس RBCs، في نسبة 1:10 لTLC الدم و 1:2 نسبة لTLC الأوعية الدموية الرئة.
      تنبيه: ضبط تركيزات الخلايا عن طريق التخفيف في برنامج تلفزيوني إذا كان التركيز أكثر من 1x106 خلايا لكل مل (مهم جدا لعينات نخاع العظام).
    7. الطرد المركزي الخلايا لإعداد السيتوسبينات على الشرائح والبقع كما هو موضح أدناه لDLCs. عد ما لا يقل عن 100 خلية لأعداد خلايا الكريات البيض التفاضلية (DLCs).
      ملاحظة: عادة، يمكن للمرء تحضير اثنين من السيتوسبينات على شريحة واحدة. وبعد 10-15 دقيقة من تجفيف الهواء، والمضي قدما في خطوة تلطيخ.
    8. تقسيم BAL التي تم جمعها من ثلاثة فئران التجريبية لكل مجموعة إلى اثنين من السيتوسبينات لكل منهما ووصمة عار للactin / توبولين والميتوكوندريا مع الفوسفور التأكسدي النشط (انخفاض mitotracker). الاستفادة من BAL من ثلاثة فئران أخرى لتقسيمها إلى اثنين من السيتوسبينات لكل منهما، لNK1.1/Gr1/CX3CR1 و ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin الشرائح الملون. تقسيم BAL من ثلاثة فئران أخرى إلى اثنين من السيتوسبينات لكل وصمة عار ل ATPα/Ly6G وCX3CR1/Siglec-F.
  2. الحمم الهوائية (BAL) والرئة الأوعية الدموية Perfusate (LVP) مجموع البروتين الكمي
    1. من أجل تحديد كميا O3 وLPS الاضطرابات الناجمة عن حاجز الأوعية الدموية أو الضغط العائي النسبي في المقصورتين الرئويتين (أي الحاجز الحويصلات الهوائية (الخلالي) والرئة الأوعية الدموية perfusate (الأوعية الدموية) المقصورات)، وقياس إجمالي محتوى البروتين في السوائل التي تم جمعها.
    2. تحليل الكسور الفائقة المذابة لتركيز البروتين الكلي باستخدام معيار قياس الألوان المقاوم للمنظفات.
    3. حمم القصبات الهوائية (BAL) وتحليل التشوش الوعائي الرئوي (LVP) chemokine
      1. بعد ذلك ، قم بتحليل الكيموكينات في BAL ومضادات الحشرات الوعائية الرئوية (LVP) باستخدام اختبار مناعي مغناطيسي قائم على حبة 33. وهذا سوف يبلغ عن اتجاه مجرى الهواء / إنترستيتيوم مقابل التدرجات chemokine الأوعية الدموية التي أنشئت بعد التعرض مجتمعة.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory بروتين-3 بيتا)، RANTES (ينظم على التنشيط، الخلية T العادية المعرب عنها والإفراز (CCL5)) ، CXCL-16 ، CXCL-12/SDF-1alpha (عامل الخلايا النجمية المشتقة 1) ، TARC (الصعترية والتنشيط chemokine المنظمة (TARC)) ، TECK (Thymus-Expressed Chemokine (CCL25)) و TNFα (عامل نخر الورم ألفا).

4. تلطيخ السيتوسبين والأنسجة الرئة

  1. تلطيخ السيتوسبين الكيميائي الحيوي
    1. تطويق السيتوسبينات بقلم كاره للماء لاحتواء المواد الكيميائية لاحتضانها أثناء الإجراء.
    2. إعادة ترطيب السيتوسبينات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    3. إصلاح عينات السيتوسبين في 2٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق، يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. Permeabilize مع الجليد الباردة 70٪ الأسيتون لمدة 7 دقائق وغسل مرة أخرى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. وصمة عار للأكتين والتوبيولين أو انخفاض Mitotracker (حضانة مع مزيج من 2 ميكروغرام / 50 ميكرولتر من اليكسا 488 phalloidin المقترنة هو مبين باللون الأخضر، و 2 ميكروغرام / ميكرولتر من اليكسا 555 الماوس المقترنة المضادة α التوبولين أو انخفاض ميتوتراكر هو مبين باللون الأحمر، على التوالي) لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: استخدام الماوس IgG1 isotype التحكم الأجسام المضادة, في cytospin منفصلة, للتحقق من صحة بروتوكول تلطيخ أنبوبولين. تنفيذ نفس الخطوات كما هو موضح من 4.1.1 إلى 4.1.8 ولكن لعناصر التحكم متساوية النمط.
    6. إزالة البقع عن طريق ترجيح بلطف المزيج من الشريحة. احتضان الشرائح مع DAPI (4'، 6-diamidino-2-phenylindole) لمدة 5-10 دقيقة وصمة عار النوى.
    7. غسل السيتوسبينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، coverslip مع وسائل الإعلام تصاعد المضادة للتلاشي وتخزينها بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.
    8. الحصول على الصور تحت المجهر تستقيم واسعة المجال مجهزة كاميرا علمية. تأكد من ضبط أوقات تعرض الكاميرا بشكل متناسق للقنوات الفلورية المختلفة عند عرض الشرائح التصويرية.
  2. تلطيخ الفلورسنت المناعي Cytospin:
    1. تطويق السيتوسبينات بقلم كاره للماء لاحتواء المواد الكيميائية لاحتضانها أثناء الإجراء. إعادة ترطيب السيتوسبينات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    2. إصلاح عينات السيتوسبين عن طريق احتضان في 2٪ paraformaldehyde لمدة 10 دقائق، وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. Permeabilize مع 0.1٪ بارد تريتون X-100 لمدة 2 دقيقة، يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. بعد ذلك ، FC block لمدة 15 دقيقة عن طريق احتضان السيتوسبين مع تخفيف 1:50 من مخزون الأجسام المضادة Fc Block (لضمان عدم تفاعل جسم الماوس الأساسي المضاد بشكل غير محدد مع الأجسام المضادة Fc الماوس).
    5. قم بقلب الشرائح لإزالة كتلة Fc وتغييرها إلى 1٪ BSA لسيتوسبين واحتضانه بمزيج من 3 أجسام مضادة أولية ذات أهمية (راجع الجدول 1 للتوليفات المختلفة) لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من تشغيل الأجسام المضادة للتحكم isotype (احتضان مع مزيج الماوس IgG1 والجرذ IgG2b كابا الأجسام المضادة الأولية عن طريق تنفيذ الخطوات 4.2.1 إلى 4.2.9 واستبدال الأجسام المضادة مع عناصر التحكم isotype) بالتوازي مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة كما نوقش في دراستنا الأخيرة20.
    6. غسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان السيتوسبينات بمزيج من الأجسام المضادة الثانوية المصممة بشكل مناسب (يرجى الرجوع إلى الجدول 1 للحصول على التفاصيل).
    7. إزالة البقع عن طريق ترجيح بلطف المزيج من الشريحة، واحتضان مع DAPI (4′، 6-diamidino-2-phenylindole) لمدة 5-10 دقيقة وصمة عار النوى. غسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    8. Coverslip مع وسائل الإعلام المضادة للتلاشي تصاعد وتخزينها بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.
    9. الحصول على الصور تحت المجهر تستقيم واسعة المجال مجهزة كاميرا علمية. تأكد من ضبط أوقات تعرض الكاميرا بشكل متناسق لجميع قنوات الفلوروفور عند عرض الشرائح التصويرية.
  3. هيماتوكسيلين و إيوزين (H &؛ E) الأنسجة
    1. إجراء تعديل H & Eتلطيخ 3 على الرئة التبريد المقاطع لجميع المجموعات.
  4. تحليل الصور
    1. معالجة وتحليل بيانات الصور (.tiff) الملفات في فيجي ImageJ البرمجيات المفتوحة (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. تحقق من المعلمات المطلوبة (المنطقة، المحيط، الكثافة المتكاملة، واصفات الشكل، قطر Feret، التعميم، تسمية العرض) ليتم تسجيلها تحت علامة التبويب تحليل وتعيين القياسات.
    3. باستخدام مدير عائد الاستثمار، مخطط يدويا حول 50-200 خلية في لوحة الصور المدمجة باستخدام أداة "التحديدات الحرة". احفظ مناطق الاهتمام (ROI) باستخدام أمر Ctrl+T وانسخ ROIs المحفوظة لكل خلية إلى جميع قنوات الفلوروفور.
    4. اضغط بعد ذلك Ctrl +M لقياس المعلمات المحددة مسبقا لجميع القنوات الفلورية (على سبيل المثال، 405 نانومتر (DAPI أو ATPβ باللون الأزرق)، و488 نانومتر (أكتين أو NK1.1 أو Ki-67 باللون الأخضر)، و568 نانومتر (توبولين أو Gr1 أو CD61 باللون الأحمر) و633 نانومتر (CX3CR1 أو angiostatin باللون الأرجواني)).
    5. حفظ النتائج كملف .csv تحت اسم مناسب يمثل التحليل الخاص بك. نسخ النتائج من ملف .csv إلى جدول بيانات وتقسيم كثافة الفلورسينس (FI) (وهو عمود الكثافة المتكاملة الخام من ملف النتائج) من جزيء ملون من قبل أن من DAPI أو CD61 FI، وفقا لتصميم تلطيخ. و يطلق على هذه النسب "DAPI أو CD61 نسب FI العادية".
    6. بعد ذلك ، رسم هذه النسب العادية ، والتعميم ، ومحيط الخلية وقطر Feret ، لتقييم أي تغيير في حجم الخلية بعد التعرض المشترك O3 وLPS.
    7. استخدام البرامج الإحصائية المناسبة للتحقق من طبيعة البيانات التي تم جمعها واختبار الفرضية الخالية (يرجى الرجوع إلى قسم التحليل الإحصائي أدناه).
  5. التحليل الإحصائي
    1. نتائج صريحة كمعني ± SEM. تم استخدام ما لا يقل عن ثلاثة فئران لكل مجموعة.
    2. لتحليل بيانات chemokine ، وضبط اتجاه واحد ANOVA ف القيم لمعدل اكتشاف كاذبة وفقا لتصحيح بنياميني وهوشبرغ.
    3. تحليل معلمات الصورة، الخلوية، قطر فيريت، محيط، DAPI أو CD61 تطبيع نسب كثافة الفلورية من قبل مان ويتني U اختبار (لمقارنة مجموعتين) أو اختبار كروسكال واليس (لمقارنة مجموعات متعددة) كما لم يتم توزيع هذه البيانات عادة.
    4. بالنسبة لبقية تجارب التصوير، قم بتحليل النتائج باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين متبوعا بمقارنات Sidak المتعددة. واعتبرت القيم p <0.05 كبيرة.

النتائج

يؤدي التعرض المشترك ل O3 وLPS إلى التهاب جهازي وتعبئة نخاع العظم عند 72 ساعة: كشفت أعداد الخلايا في مقصورات مختلفة عن تغييرات كبيرة في الدم المحيطي وإجمالي عدد خلايا نخاع عظم الفخذ عند التعرض المشترك ل O3 و LPS. علىالرغم من أن التعرض مجتمعة O 3 وLP...

Discussion

الأساليب المعروضة في الدراسة الحالية تسليط الضوء على فائدة تحليل مقصورة متعددة لدراسة الأحداث الخلوية متعددة أثناء التهاب الرئة. وقد لخصنا النتائج في الجدول 2. وقد درسنا نحن والعديد من المختبرات على نطاق واسع استجابة المورين لغرس LPS داخل الجهاز الداخلي ، والذي يتميز بالتوظيف الس...

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح أو إفصاحات.

Acknowledgements

يتم تمويل البحث الذي أجري من خلال منحة الرئيس NSERC بالإضافة إلى أموال بدء التشغيل من مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي. يتم تمويل مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي من قبل الابتكار ساسكاتشوان. تم إجراء التصوير الفلوري في مركز التصوير WCVM ، الذي تموله NSERC. تم تمويل جيسيكا بروكوس (طالبة MSc) وManpreet Kaur (طالبة MSc) من أموال بدء التشغيل من مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
33-plex Bioplex chemokine panelBiorad12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectivesLeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11002
Alexa 488 conjugated phalloidinInvitrogenA12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)InvitrogenA21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)InvitrogenA11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)InvitrogenA21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL/6 J MiceJackson Laboratories64
Confocal laser scanning microscopeLeicaLeica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)InvitrogenD1306aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscopeOlympusOlympus IX83
Ketamine (Narketan)Vetoquinol100 mg/mlDilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kitInvitrogenL3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)Invitrogen459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)InvitrogenA-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)Invitrogen16-5941-82
Pierce 660 nm protein assayThermoscientific22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgGAbcamab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)Invitrogen14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappaInvitrogen14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)Invitrogen16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)Invitrogen53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)BD Pharmingen553142
Reduced mitotracker orangeInvitrogenM7511
Xylazine (Rompun)Bayer20 mg/mlDilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169 LPS F1F0 ATP synthase V IL 16

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved