Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Resumo

Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.

Resumo

Os pulmões são continuamente confrontados com insultos diretos e indiretos na forma de condições inflamatórias estéreis (partículas ou reativas) e infecciosas (bacterianas, virais ou fúngicas). Uma resposta esmagadora do hospedeiro pode resultar em respiração comprometida e lesão pulmonar aguda, que é caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos pulmonares como resultado da resposta imunológica, coagulativa e remodelagem de tecidos. Métodos microscópicos sensíveis para visualizar e quantificar adaptações celulares pulmonares murinas, em resposta ao ozônio de baixa dose (0,05 ppm), um potente poluente ambiental em combinação com lipopólise bacteriana, um agonista TLR4, são cruciais para entender os mecanismos inflamatórios e de reparo. Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar, perfusato vascular pulmonar, crioseções pulmonares esquerdas e perfusato de medula óssea severa. Mostramos danos de macrófagos alveolares, neutrófilos, tecido parenchímal pulmonar, bem como células de medula óssea em correlação com uma resposta imune retardada (até 36-72 h) que é marcada por gradientes de quimioterapia discretos nos compartimentos analisados. Além disso, apresentamos a matriz extracelular pulmonar e interações citosqueléticas celulares (actina, tubulina), espécies de oxigênio mitocondrial e reativa, plasminogen anticoagulativo, seu fragmento de peptídeo anti-angiogênico angiogenic, as subunidades do complexo de sintetizador ATP mitocondrial V, α e β. Esses marcadores substitutos, quando complementados com ensaios adequados em células in vitro e técnicas de imagem animal in vivo, como microscopia intravital, podem fornecer informações vitais para entender a resposta pulmonar a novos agentes imunomodulatórios.

Introdução

A lesão pulmonar aguda (ALI) é uma resposta patológica crucial dos pulmões a estímulos infecciosos ou outros prejudiciais que é marcada pela ativação simultânea dos sistemas imunológicos coagulativos, fibrinolíticos e inatos¹. Os neutrófilos detectam prontamente padrões microbianos, bem como padrões de danos intracelulares através da família receptor toll-like (TLR)^2,3,4. Os neutrófilos liberam citocinas pré-formadas e o conteúdo do grânulo citotóxico, que pode causar danos colaterais ao tecido. O dano alveolar resultante é marcado com a morte celular secundária levando à liberação de moléculas como o triptosfato de adenosina (ATP)⁵, estabelecendo-se assim em um ciclo vicioso de desregulação imunológica.

Um problema não resolvido na compreensão da ALI diz respeito à questão de como a lesão é iniciada dentro da membrana alveolar. O complexo de transporte de elétrons V, g1F0 ATP synthase, é uma proteína mitocondrial conhecida por ser expressa onipresentemente, na célula (incluindo membrana plasmática endotelial, leucócito, epitelial) durante a inflamação. O citoesqueleto celular, composto por actina e tubulina, abriga muitas formas e funções de células modulando, bem como proteínas mitocondriais, respectivamente. Recentemente mostramos que o bloqueio da synthase ATP por uma molécula endógena, angiostatina, silencia o recrutamento de neutrófilos, ativação e lipopólise (LPS) induzida inflamação pulmonar⁶. Assim, tanto os mecanismos bioquímicos (ATP synthase) quanto os imunológicos (TLR4) podem regular a barreira alveolar durante a inflamação pulmonar.

A exposição ao ozônio (O_3),poluente ambiental, prejudica a função pulmonar, aumenta a suscetibilidade a infecções pulmonares, e os baixos_níveis curtos de exposições de O 3 aumentam o risco de mortalidade naqueles com condições cardiorrespiratórias subjacentes^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Assim, a exposição a concentrações fisiologicamente relevantes de O₃ fornece um modelo significativo de ALI para estudar mecanismos fundamentais de inflamação^7,8. Nosso laboratório estabeleceu recentemente um modelo murino de baixa dose O₃ induzido ALI¹⁵. Após a realização de uma dose e uma resposta ao tempo-resposta às baixas concentrações de O_3, observamos que a exposição a 0,05 ppm O₃ por 2 h, induz lesão pulmonar aguda que é marcada pela subunidade V do complexo de synthase do pulmão Β (ATPβ) e expressão de angiostatina, semelhante ao modelo LPS. Imagens pulmonares intravitais revelaram a desorganização de microfilamentos de actina alveolar indicando danos pulmonares, e ablação dos níveis de oxigênio reativo septal alveolar (ROS) (indicando revogação da sinalização celular de base) e potencial de membrana mitocondrial (indicando morte celular aguda) após 2 h de exposição a 0,05 ppm O₃¹⁵ que se correlacionava com um pulmão heterogêneo ¹⁸retenção FDG^16,recrutamento de neutrófilos e liberação de citocinas, liberação, mais notavelmente IL-16 e SDF-1α. A mensagem de nossa última opinião é que O₃ produz toxicidade exponencialmente alta quando exposto em concentrações abaixo dos limites permitidos de 0,063 ppm acima de 8h (por dia) para exposição humana. É importante ressaltar que não existe uma compreensão clara sobre se essas exposições sub-clínicas O₃ podem modular mecanismos mediados pelo TLR4, como pela endotoxina bacteriana¹⁷. Assim, estudamos um modelo de exposição de O₃ e LPS de duplo sucesso e observamos as adaptações celulares imunes e não imunes.

Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar (ou seja, BAL) que amostra os espaços alveolares, o perfusato vascular pulmonar (i.e., LVP) que amostra a vasculatura pulmonar e o interstício septal alveolar no caso de uma barreira endotelial comprometida, crioseções pulmonares esquerdas, para olhar para leucócitos parnchímicos e aderentes deixados no tecido pulmonar lavado , sangue periférico que representa os leucócitos circulantes e os perfusados da medula óssea sternal e do fêmur que amostram os locais proximais e distais da mobilização de células hematopoiéticas durante a inflamação, respectivamente.

Protocolo

O desenho do estudo foi aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade de Saskatchewan e aderiu ao Conselho Canadense de Orientações de Cuidados Com Animais para uso humano de animais. Foram adquiridos camundongos C57BL/6J masculinos de seis semanas. NOTA: Eutanize todos os animais que desenvolvem letargia grave, dificuldade respiratória ou outros sinais de grave angústia antes do ponto final programado.

NOTA: Prepare o seguinte: 27-18 G de agulha-blunted (vai depender do diâmetro traqueal do rato), tubos de PE de tamanho adequado para caber a agulha cega (fazer uma cânula pe para cada rato), cânula, 2 tesouras afiadas, 2 fórceps contundentes (pequenos), 1 fórceps afiados (pequenos), 3 1 mL de seringas, tubos de microfuge rotulados (para BAL, coleta de perfusato de sangue, vascular e medula óssea) e frascos rotulados (para fixação de tecidos), sacos de amostra/criovials para coleta de tecido, rolo de fio de algodão do açougueiro (cortado em ligaduras adequadas). Todos os produtos químicos utilizados para os experimentos estão indicados na Tabela de Materiais.

1. Exposições de ozônio e LPS para indução de lesão pulmonar murina

1. Exposição ao ozônio
   1. Prepare uma caixa de indução O₃ personalizada. Adicione ração de rato, garrafa de água, brinquedos de enriquecimento e roupas de cama limpas em ordem e imite o ambiente de habitação dos ratos.
      NOTA: Essas etapas garantirão que os ratos tenham livre acesso a alimentos e água quando alojados na caixa de indução personalizada e ajudarão a aliviar o estresse indevido.
   2. Alterne o calibrador/gerador O₃ "ON" (colocado em direção à porta de entrada) para estabilizar a lâmpada UV antes (cerca de 15 minutos antes das exposições) e conecte-se com o monitor O₃ em linha.
      NOTA: O monitor O₃ deve ler uma média de 0,05 ppm, como amostrado da tomada a temperatura constante do ar da câmara (72 ±3 °F) e umidade relativa (50±15%).
   3. Para exposições O_3, coloque suavemente ratos na caixa de indução personalizada e exponha continuamente os ratos a 0,05 ppm O₃ por 2 h.
2. Administração de Anestesia e LPS intranasal
   1. Prepare 10 mg/mL para cetamina e xilazina, separadamente.
   2. Prepare um coquetel misturando 20 partes de cetamina e 1 parte de xilazina. Se o mouse pesa X g, injete (X/200) mL de coquetel de cetamina/xilazina na cavidade peritoneal. Para um rato, prepare 1 mL de coquetel composto por 1000 μL do estoque de cetamina de 10 mg/mL e 50 μL do estoque de xilazina. Misture bem por pipetting para cima e para baixo em um tubo de microfuça.
      NOTA: As ações de cetamina e xilazina podem ser preparadas com uma semana de antecedência.
   3. Anestesiar os camundongos sob cetamina intraperitoneal leve (IP) (50 mg/kg)/xylazine (1 mg/kg) (por exemplo, para um rato de 25 g, injete 0,125 mL do coquetel).
   4. Prepare uma solução de 1 mg/mL de LPS, em soro fisiológico, e encha 50 μL da solução em uma pipeta.
   5. Segure o mouse ereto com a parte traseira/dorsal na palma da mão, segurando as orelhas com a mesma mão. Agora, coloque 50 μL da solução LPS¹⁸ delicadamente externa das narinas (ou seja, 25 μL em cada narina ou 50 μL em uma narina; não importa enquanto o procedimento for rápido) e permita que os ratos inalem a solução LPS.
   6. Incutir camundongos de controle com 50 μL de soro fisiológico estéril.
      Atenção: Não exceda mais de 100 μL para instilação, o que pode ser fatal. Muito menos volume (ou seja, <50 μL) e há risco de apenas deposição nasal.
   7. Após a administração do LPS, deita suavemente os ratos, seja de barriga para baixo ou de costas sobre o monte de cama com a cabeça ligeiramente inclinada para baixo.
      NOTA: Esta orientação prolonga a retenção da solução na cavidade nasal¹⁹.
   8. Às 0, 2, 4, 24, 36 e 72 h após a exposição, anestesiar os camundongos i.p. com dose completa de cetamina (200 mg/kg)/xylazine (4 mg/kg) mistura (ou seja, X/50 mL do coquetel, onde X é o peso do rato em gramas ou 0,50 mL para um rato de 25 g).
   9. Observe o mouse até que ele perca a consciência e o reflexo certo (ou seja, não volte quando colocado em posição supina). Agora, verifique se o mouse está em busca de profundidade de anestesia, monitorando a respiração (excursões rítmicas do peito) e a frequência cardíaca, que deve cair visivelmente, após 1-2 minutos.
   10. Em seguida, verifique se há reflexos do pedal, ou seja, belisque qualquer um dos dígitos do membro traseiro e observe se há retração do membro, como reflexo. Se o mouse responder, retoe com injeções adicionais de 0,1 mL ou mais, conforme necessário.
       NOTA: Para alcançar anestesia profunda, tenha em mente que certas cepas ou camundongos obesos geralmente têm um volume maior de distribuição e, portanto, podem ser facilmente superdos, se não for permitido tempo suficiente para anestesia completa (que pode ser em torno de 10 minutos ou mais). Assim, algumas cepas podem ser resistentes à anestesia e, portanto, requerem mais recargas. Esse conhecimento é adquirido após muitas observações práticas e experiência com camundongos de diferentes cepas e idade. Como alguns experimentos piloto também foram realizados imediatamente após as exposições de O₃ e LPS (ou seja, no ponto de tempo de 2h), também incluímos algumas análises de células BAL muito precoces desses experimentos para destacar os efeitos imediatos da exposição combinada de O₃^{e LPS.}

2. Coleta de amostras

1. Coloque o mouse na bandeja cirúrgica. Agora, coloque suavemente a pomada lubrificante nos olhos para evitar a perda de fluidos e higienize o mouse com 70% de spray de etanol.
   1. Faça pequenos cortes nas membranas superiores e inferiores da pele com tesouras, para expor a traqueia e o tórax.
   2. Faça um corte logo abaixo do esterno e exponha o coração.
2. Punção cardíaca
   1. Coloque uma agulha 25G presa à seringa heparinizada no ventrículo direito e tire sangue por punção cardíaca.
      NOTA: O sangue geralmente se desenha com o mínimo de êmbolo, se o tempo de expor o coração à punção cardíaca for inferior a um minuto. Depois de coletar cerca de 0,4-0,5 mL, pode-se precisar parar por alguns segundos antes de coletar o sangue restante. Isso é feito para deixar o coração bombear qualquer volume restante para a câmara ventricular direita. No final da coleta de sangue, o coração pára para bombear.
   2. Colete o sangue e armazene em tubos de microfuça para posterior processamento.
3. Traqueostomia
   1. Use cuidadosamente pinças/fórceps contundentes para limpar a região traqueal do tecido sobrelado. Use as mãos enluvadas mais do que os instrumentos cirúrgicos para evitar sangramento. Se muito sangue está escorrendo, há risco de contaminar as amostras de BAL. Use cotonetes de algodão, se necessário, embora não preferenciais. Kimwipes são alternativas melhores.
   2. Agora, corte a caixa torácica para expor os pulmões. Novamente, tenha cuidado para não cortar o esterno e as artérias intercostal ou a aorta ascendente; fazer cortes menores enquanto avança pela caixa torácica)
   3. Passe uma ligadura de algodão abaixo do corte traqueal e deixe como tal por enquanto.
   4. Corte a traqueia em um local adequado na parte distal 1/3, apontando para os pulmões, para permitir o acesso a uma cânula traqueal de 28 G.
   5. Insira uma cânula pe de 28 G (um comprimento mínimo de 3-5 mm e extremidade distal aparada para facilitar a inserção) na traqueia. Cuidado com o fim da traqueia antes da bifurcação e, em seguida, puxe cerca de um mm para trás para evitar a amostragem apenas de lobo único.
   6. Com firmeza, amarre a ligadura de algodão para manter a cânula no lugar. Não destrua a cânula.
4. Lavage broncho-alveolar (BAL)
   1. Encha 0,5 mL de PBS em uma seringa de 1 mL.
   2. Agora, injete gradualmente 0,5 mL de PBS na cânula com a ajuda de 1 mL de seringa.
   3. Depois de injetar PBS, aspire a seringa desde que não resista à sucção.
      NOTA: Se houver resistência ao aspirar o fluido BAL, isso indica o colapso do tecido alveolar ou brônquico. Nesse caso, puxe a cânula por um minúsculo para desprender a cânula formar as paredes do tecido.
   4. Colete o fluido aspirado em um tubo de microfuça rotulado e coloque no gelo.
   5. Realizar mais duas lavages de forma semelhante coletando no mesmo frasco (ou seja, um total de 0,5 X 3 = 1,5 mL lavage).
   6. Meça o volume do fluido BAL coletado. A recuperação da lavage deve ser próxima de 90%.
5. Perfusato vascular pulmonar (LVP)
   1. Corte a aorta torácica descendente em um local entre as metades torácica e abdominal, para evitar qualquer recuo de perfusado nos pulmões enquanto perfusa através do ventrículo direito.
   2. Borrida a cavidade perto da extremidade da aorta cortada, livre de sangue.
   3. Em seguida, perprendo os pulmões com 0,5 mL de solução salina heparinizada heparinizada injetada através do ventrículo direito.
   4. Recolher o perfusato vascular da cavidade na extremidade cortada da aorta torácica descendente, em um tubo de microfuge, colocado no gelo e medir seu volume.
   5. Ligate o bronco direito proximal à sua ramificação da traqueia (com fio de algodão).
6. In situ fixação pulmonar esquerda
   1. Conecte uma seringa de 1 mL à cânula traqueal, que é longa o suficiente para inserir através da incisão traqueal anterior.
   2. Desenhe o ar na seringa até 0,6 mL de marca.
   3. Em seguida, encha a seringa restante (até o final) com 2% de paraformaldeído à temperatura ambiente. Certifique-se de que o êmbolo está pronto para sair sem sugar qualquer ar da cânula.
   4. Agora, afixe a seringa com uma fita adesiva, em um recipiente vertical, medido até 20 cm de altura.
   5. Suavemente, desenhe o êmbolo para deixar o fluxo fixador em direção à traqueia. Caso haja algumas bolhas de ar na cânula, coloque suavemente o êmbolo em cima da seringa e o fluido começará a fluir após alguns segundos.
   6. Deixe o pulmão esquerdo inflar até sua capacidade total in situ, por 5 minutos, a partir de uma altura de 20 cm formando uma coluna de água de 20 cm.
   7. Durante este procedimento, certifique-se de proteger os lóbulos pulmonares certos de entrar em contato com paraformaldeído, pois isso afetará os ensaios a jusante.
   8. Coloque tecidos de laboratório dobrados para absorver qualquer paraformaldeído que possa entrar em contato com os lóbulos pulmonares certos.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é altamente tóxico. Portanto, não inspire ou coloque contato com quaisquer partes expostas do corpo. Tenha extrema cautela durante o manuseio.
   9. Durante o tempo de instilação de paraformaldeído, higienize o abdômen.
   10. Corte os lóbulos pulmonares certos da traqueia certificando-se de remover qualquer rosca e imediatamente coloque os lóbulos em um criovial rotulado e solte-o em nitrogênio líquido para análise de citocinas moleculares/bioquímicas a jusante/RT-PCR/análise de manchas ocidentais de homogeneizar o pulmão.
   11. Corte cuidadosamente o pulmão esquerdo para qualquer tecido conjuntivo ou membranas pleurais e mergulhe-o em 2% de paraformaldeído por 24 h a 4 °C.
   12. Incorpore o pulmão fixo em parafina de acordo com o protocolo padrão de incorporação.
       Atenção: Não aqueça demais as amostras de pulmão.
   13. Corte a parte abdominal e desefo-a do osso pélvico (quadril).
   14. Separe os ossos do fêmur esquerdo e direito da porção pélvica, em uma placa de petri cheia de soro fisiológico mantida no gelo.
7. Coleção de aspiração de medula óssea de sternal e fêmur
   1. Limpe o tecido e os músculos dos ossos usando tecidos de laboratório.
   2. Colete a caixa torácica ventral e o esterno em uma placa de Petri cheia de soro fisiológico mantida no gelo.
   3. Corte as pontas distal e proximal dos ossos de esterno e fêmur.
   4. Perfunda os ossos 4 vezes com 0,5 mL de soro fisiológico, usando agulhas bem equipadas (24 a 28 G) em seringas de 1 mL, e colete as frações de cada osso em tubos rotulados equipados com filtros e colocados no gelo.
      NOTA: O medidor de agulha varia entre o tamanho do animal. Após a descarga, o osso do fêmur deve aparecer transparente.
   5. Uma vez coletadas as amostras, ensace o rato em um saco plástico e coloque em um freezer de carcaça animal para o descarte adequado, conforme orientações da instalação institucional de animais.

3. Processamento de amostras

1. Contagem total (TLC) e diferencial (DLC) de leucócitos
   1. Centrífuga de sangue periférico, BAL, perfusato vascular pulmonar e medula óssea (sternal e fêmur) amostras por 10 min a 500 g.
   2. Colete os supernantes, congele-os e armazene-os a -80 °C até uma análise mais aprofundada.
   3. Reconstituir as células em um mínimo de 200 μL de PBS.
   4. Realize o TLC contando células bal, sangue, perfusato vascular pulmonar e medula óssea em um hemótmetro.
   5. Manche outra alíquota de 9 μL de BAL com uma mistura de 1 μL de ethidium homodimer-1 verde e vermelho para quantificar células vivas (verdes) devido à atividade de esterásse intracelular e quaisquer células BAL danificadas (em vermelho) devido à perda da integridade da membrana plasmática.
   6. Adicione 2% de ácido acético aos RBCs de lise, em uma proporção de 1:10 para TLC sanguíneo e proporção de 1:2 para TLC vascular vascular pulmonar.
      ATENÇÃO: Ajuste as concentrações celulares diluindo-se em PBS se a concentração for superior a 1x10⁶ células por mL (muito importante para as amostras de medula óssea).
   7. Centrifugar as células para preparar citospinas em lâminas e manchas como explicado abaixo para DLCs. Conte um mínimo de 100 células para contagem diferencial de células leucócitos (DLCs).
      NOTA: Normalmente, pode-se preparar dois citospins em um slide. E depois de 10-15 minutos de secagem de ar, prossiga com a etapa de coloração.
   8. Divida o BAL coletado de três ratos-piloto por grupo em dois citospins cada e colora para actina/tubulina e mitocôndrias com fosforilação oxidativa ativa (mitotracker reduzido). Utilize o BAL de mais três ratos para dividir em dois citospins cada, para slides manchados NK1.1/Gr1/CX3CR1 e ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin. Divida o BAL de mais três ratos em dois citospões cada para coloração para ATPα/Ly6G e CX3CR1/Siglec-F.
2. Lavage de broncoalveolar (BAL) e Perfusato Vascular Pulmonar (LVP) quantificação total de proteínas
   1. A fim de quantificar os compartimentos induzidos por O₃ e LPS da barreira vascular ou da pressão oncótica relativa nos dois compartimentos pulmonares (ou seja, os compartimentos septo alveolar (intersticial) e perfusato vascular pulmonar (vascular), medem o teor total de proteínas nos fluidos coletados.
   2. Analise as frações supernacas descongeladas para sua concentração total de proteínas usando um assisay colorimétrico resistente ao detergente padrão.
   3. Análise de quimiocina de lavagem de broncoalveolar (BAL) e perfusato vascular pulmonar (LVP)
      1. Em seguida, analise as quimiocinas em refusão vascular de BAL e perfusato pulmonar (LVP) usando um imunoensaio à base de contas magnéticas de 33 plex. Isso informará sobre a direcionalidade das vias aéreas/interstitium vs gradientes de quimiocina vascular estabelecidos após exposições combinadas.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (regulado na ativação, célula T normal expressa e secretado (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (fator derivado de células estroma), TARC (timo e ativação regulada quimiócina (TARC)), TECK (Thymus-ExpressEd Chemokine (CCL25)) e TNαF (fator de necrose tumoral).

4. Mancha de citospin e histologia pulmonar

1. Manchas bioquímicas de citospin
   1. Cerque os citospins com uma caneta hidrofóbica para conter os produtos químicos para incubação durante o procedimento.
   2. Reidratar os citospins na PBS por 5 minutos.
   3. Fixar as amostras de citospin em 2% de paraformaldeído por 10 minutos, lavar três vezes com PBS por 5 minutos cada.
   4. Permeabilize com frio frio 70% acetona por 7 minutos e lave novamente três vezes com PBS por 5 minutos cada.
   5. Mancha para actina e tubulina ou Mitotracker reduzida (incubar com uma mistura de 2 μg/50 μL de Alexa 488 fábula conjugada mostrada em verde, e 2 μg/μL de Alexa 555 camundongo conjugado anti-α tubulina ou mitotracker reduzido mostrado em vermelho, respectivamente) por 15 minutos.
      NOTA: Use anticorpo de controle isótipo IgG1 do mouse, em um citospina separado, para validar o protocolo de coloração da tubulina. Executar os mesmos passos que explicados de 4.1.1 para 4.1.8, mas para controles isótipos.
   6. Remova as manchas derrubando suavemente a mistura do slide. Incubar os slides com DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilôndole) por 5-10 min para coloração de núcleos.
   7. Lave os citospins 3 vezes com PBS por 5 minutos cada, cubra com mídia de montagem anti-fade e armazene durante a noite no escuro à temperatura ambiente antes da imagem.
   8. Adquira imagens sob um microscópio vertical de campo largo equipado com uma câmera científica. Certifique-se de tempos consistentes de exposição da câmera definidos para os diferentes canais fluorescentes ao deslizar imagens.
2. Manchas imuno-fluorescentes de citospin:
   1. Cerque os citospins com uma caneta hidrofóbica para conter os produtos químicos para incubação durante o procedimento. Reidratar os citospins na PBS por 5 minutos.
   2. Fixar as amostras de citospin incubando em 2% paraformaldeído por 10 minutos, lave três vezes com PBS por 5 minutos cada.
   3. Permeabilize com tritão 0,1% frio X-100 por 2 minutos, lave três vezes com PBS por 5 min cada.
   4. Em seguida, bloco Fc por 15 minutos incubando o citospin com diluição de 1:50 do estoque de anticorpos do bloco Fc (para garantir que o anticorpo do rato primário não reagem não especificamente com os anticorpos fc do mouse).
   5. Incline os slides para remover o bloco Fc e mude para 1% BSA para e incubar o citospin com uma mistura de 3 anticorpos primários de interesse (consulte a Tabela 1 para as várias combinações) por 30 minutos.
      NOTA: Certifique-se de executar anticorpos de controle de isótipo (incubar com um mix de anticorpos primários IgG1 e rat IgG2b kappa realizando etapas 4.2.1 a 4.2.9 e substituindo os anticorpos por controles isótipos) em paralelo com anticorpos secundários correspondentes, como discutido em nosso estudo recente²⁰.
   6. Lave 3 vezes com PBS por 5 minutos cada. Incubar os citospins com uma mistura de anticorpos secundários devidamente projetados (consulte a Tabela 1 para obter os detalhes).
   7. Remova as manchas derrubando suavemente a mistura do slide, incubar com DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) por 5-10 min para colorir núcleos. Lave 3 vezes com PBS por 5 minutos cada.
   8. Tampar com mídia de montagem anti-fade e armazenar durante a noite no escuro à temperatura ambiente antes da imagem.
   9. Adquira imagens sob um microscópio vertical de campo largo equipado com uma câmera científica. Certifique-se de tempos consistentes de exposição da câmera definidos para todos os canais fluorforeiro quando a imagem deslizar.
3. Histologia de hematoxilina e eosina (H&E)
   1. Realize a coloração modificada de H&E³ em crio-seções pulmonares para todos os grupos.
4. Análise de imagem
   1. Processar e analisar os arquivos de dados de imagem (.tiff) no software aberto Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Verifique os parâmetros necessários (Área, Perímetro, Densidade Integrada, Descritores de forma, diâmetro de Feret, Circularidade, Etiqueta display) a serem registrados sob a guia Analisar e Definir Medidas.
   3. Usando o gerenciador de ROI,delineie manualmente cerca de 50-200 células no painel de imagem mesclado usando a ferramenta "seleções à mão livre". Salve as regiões de interesse (ROI) com o comando Ctrl+T e copie os ROIs salvos para cada célula em todos os canais fluorforeiro.
   4. Em seguida, pressione Ctrl+M para medir os parâmetros pré-definidos para todos os canais fluorescentes (por exemplo, 405 nm (DAPI ou ATPβ em azul), 488 nm (actin ou NK1.1 ou Ki-67 em verde), 568 nm (tubulina ou Gr1 ou CD61 em vermelho) e 633 nm (CX31 ou angiostatin em magenta)).
   5. Salve os Resultados como .csv arquivo sob um nome apropriado que represente sua análise. Copie os resultados do arquivo .csv para uma planilha e divida a intensidade de fluorescência (FI) (que é a coluna Densidade Integrada Bruta do arquivo Resultados) da molécula manchada pela da DAPI ou CD61 FI, conforme o desenho de coloração. Essas proporções são denominadas como "razões FI normalizadas de DAPI ou CD61".
   6. Em seguida, plote essas relações normalizadas, circularidade, perímetro celular e diâmetro de Feret, para avaliar qualquer alteração no tamanho da célula após a exposição combinada de O₃ e LPS.
   7. Use software estatístico adequado para verificar a normalidade dos dados coletados e testar a hipótese nula (consulte a seção de análise estatística abaixo).
5. análise estatística
   1. Expresse resultados como ± SEM. Foram utilizados no mínimo três camundongos por grupo.
   2. Para análise de dados de quimiocina, ajuste os valores p de ANOVA unidirecional para taxa de descoberta falsa de acordo com a correção de Benjamini e Hoshberg.
   3. Analisar parâmetros de imagem, celularidade, diâmetro de Feret, perímetro, DAPI ou CD61 normalizados razões de intensidade de fluorescência pelo teste Mann-Whitney U (para comparar dois grupos) ou teste de Kruskal Wallis (para comparar vários grupos) como esses dados normalmente não foram distribuídos.
   4. Para o resto dos experimentos de imagem, analise os resultados usando uma análise unidirecência de variância seguida das múltiplas comparações de Sidak. p-valores <0,05 foram considerados significativos.

Resultados

A exposição combinada o₃ e LPS leva à inflamação sistêmica e à mobilização da medula óssea em 72 h: A contagem de células em diferentes compartimentos revelou alterações significativas no sangue periférico e a célula total da medula óssea do fêmur conta com exposições combinadas de O₃ e LPS. Embora as exposições combinadas de O₃ e LPS não tenham induzido alterações nas contagens totais de células BAL (<...

Discussão

Os métodos apresentados no presente estudo destacam a utilidade da análise de múltiplos compartimentos para estudar múltiplos eventos celulares durante a inflamação pulmonar. Resumimos os resultados na Tabela 2. Nós e muitos laboratórios estudamos extensivamente a resposta murina à instilação intranasal do LPS, que é marcada pelo rápido recrutamento de neutrófilos pulmonares, que atinge o pico entre 6-24 h após o qual, a resolução começa. E recentemente, temos demonstrado que a sub-clí...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock