결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

요약

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

초록

폐는 멸균 (입자 또는 반응성 독소) 및 전염성 (세균성, 바이러스 또는 곰팡이) 염증 조건의 형태로 직접적이고 간접적인 모욕에 지속적으로 직면합니다. 압도적인 숙주 반응은 병리학적 숙주 면역, 응압 및 조직 리모델링 반응의 결과로 폐 호중구 모집을 특징으로 하는 손상된 호흡 및 급성 폐 손상을 초래할 수 있습니다. 소뇨폐 세포 적응을 시각화하고 정량화하는 민감한 현미경 방법은 저용량(0.05 ppm) 오존에 대응하여, TLR4 작용제인 세균성 리포폴리사카라이드와 함께 강력한 환경 오염물질로 숙주 염증 및 수리 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지-폐포라 라베지 액체, 폐 혈관 난투, 좌측 폐 극저섹션 및 흉골 골수 투과구의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다. 당사는 분석된 구획에서 이산 케모킨 그라데이션에 의해 표시되는 지연(최대 36-72h) 면역 반응과 상관되는 골수 세포뿐만 아니라 폐포성 대식세포의 손상을 보여줍니다. 또한 폐 세포 외 매트릭스 및 세포 세포 종편 상호 작용 (액틴, 튜룰린), 미토콘드리아 및 반응성 산소 종, 항 응고 성 플라스미노겐, 항 혈관 신생 펩타이드 단편 혈관 산기 세포 혈관, 미토콘드리아 ATP 시네시아 복합 V 서브 유닛, α 및 β 제시합니다. 이러한 대리 마커는 적절한 체외 세포 기반 분석술및 생체 내 미생물 현미경 검사법과 같은 생체 내 동물 이미징 기술로 보충될 때, 새로운 면역 조절제에 대한 폐 반응을 이해하는 쪽으로 중요한 정보를 제공할 수 있다.

서문

급성 폐 손상(ALI)은 응고, 섬유성 및 선천성 면역 계통^1의동시 활성화에 의해 표시되는 전염성 또는 기타 유해한 자극에 대한 폐의 중요한 병리학 반응이다. 호중구는 즉시 톨과 같은 수용체 (TLR) 패밀리^2,3,4를통해 미생물 및 세포 내 손상 패턴을 감지합니다. Neutrophils는 그 때 부수적인 조직 손상을 일으키는 원인이 될 수 있는 미리 형성된 사이토카인 및 세포독성 과립 내용을 풀어 놓습니다. 이어지는 폐포 손상은 아데노신 삼위산염 (ATP)^5와같은 분자의 방출로 이어지는 이차 세포 죽음으로 손상되어 면역 dysregulation의 악순환에서 설정됩니다.

ALI의 이해에 해결되지 않은 문제는 발포막 내에서 부상이 어떻게 시작되는지에 대한 문제와 관련이 있습니다. 전자 수송 복합체 V, F1F0 ATP 신타제는 염증 중 세포(내피, 백혈구, 상피 포함)에서 유비쿼터스로 발현되는 것으로 알려진 미토콘드리아 단백질이다. 액틴과 튜룰린으로 구성된 세포 골격은 미토콘드리아 단백질뿐만 아니라 많은 세포 모양과 기능 변조를 각각 항구합니다. 우리는 최근에 내인성 분자, 혈관 스타틴, 침묵 호중구 모집, 활성화 및 리포 폴리사카라이드 (LPS)에 의해 ATP synthase의 봉쇄가 폐 염증^6을유도하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 생화학적(ATP synthase)과 면역(TLR4) 메커니즘은 폐 염증 시 폐포 장벽을 조절할 수 있다.

오존(O3)에 노출되면 환경 오염물질, 폐 기능 저하, 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키고,_O3 노출의 짧은 저수준은 근기 심폐질환^{7,8,9,10,11,12, 13,14의}기초심률을 가진 이들의 사망률 위험을 증가시킨다. 따라서,_O3의 생리학적관련 농도에 노출되면 염증^7,8의근본적인 기전을 연구하기 위한 ALI의 의미 있는 모델을 제공한다. 우리 실험실은 최근 저용량 O₃ 유도 ALI 15의 뮤린 모델을^{설립했다.} 낮은_O3 농도에 대한 투여량 및 시간 반응을 수행한 후, LPS 모델과 유사한 폐 ATP 신타제 복합 V 서브유닛 β(ATPβ) 및 혈관스타틴 발현에 의해 표시되는 급성 폐 손상을 유도하는 것을 관찰하였다. 인트라바이탈 폐 이미징은 폐 손상을 나타내는 폐포액소균의 해체를 밝혀, 및 폐포 중격 반응성 산소 종(ROS) 수준(기준세포 신호의 변색을 나타내는) 및 미토콘드리아 막 전위(급성 세포 사멸을 나타내는)의 절제는 이질성 폐 ¹⁸FDG 보존^16,중성구 모집 및 사이토메16-16, 중성구 모집 및 사이토메킨 방출과 상관관계가 있는 0.05 ppm O₃^15에 2시간 노출 후 우리의 최근 연구에서 테이크 홈 메시지는 O₃ 인간의 노출에 대 한 8 시간 (하루) 허용 된 한계 아래 농도에 노출 될 때 기하 급수적으로 높은 독성을 생산. 중요하게도, 이러한 하위 임상_O3 노출이 세균성 내독소(17)에 의한 TLR4 매개메커니즘을 조절할 수 있는지에 대해서는 명확한 이해가 존재하지 않는다. 따라서, 우리는 이중 히트 O₃ 및 LPS 노출 모델을 공부하고 면역 및 비 면역 세포 적응을 관찰했다.

우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지 폐포 라베지 액체의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다 (즉,, BAL) 폐포 공간을 샘플링하는, 폐 혈관 난간 (즉, LVP)은 폐 혈관 과 폐 막증을 시료하고 폐경 벽이 손상된 경우 폐 극저섹션을 남기고, 상주 피렌자피 및 부착 된 leuks좌를 들여다 보는 , 순환백혈구체와 흉골 및 대퇴골골수를 나타내는 말초 혈액은 각각 염증 중 조혈 세포 동원의 근해 및 말단 부위를 시료하는 양상동맥 및 대퇴골 골수와 이복된다.

프로토콜

연구 디자인은 서스 캐처 원 대학의 동물 연구 윤리 위원회에 의해 승인되었으며 인도적 인 동물 사용을위한 동물 관리 지침에 대한 캐나다 위원회에 준수되었습니다. 6-8주 된 남성 C57BL/6J 마우스가 조달되었다. 참고: 예정된 종점 전에 심한 혼수, 호흡 곤란 또는 심각한 고통의 다른 징후를 개발하는 동물을 안락사시하십시오.

참고 : 다음을 준비 : 27-18 G 바늘 무딘 (마우스 기관 직경에 따라 달라집니다), 무딘 바늘에 맞게 적절하게 크기의 PE 튜브 (모든 마우스에 대한 PE 캐뉼라만들기), 캐뉼라, 날카로운 가위 2개, 무딘 집게 2개(소형), 날카로운 집게(소형), 31mL 주사기, 라벨이 부착된 미세푸지 튜브(BAL, 혈액, 혈관 및 골수 난투 수집용) 및 라벨이 부착된 바이알(조직 고정용), 티슈 수집용 샘플 백/냉동, 정육점면의 면실 롤(적절한 결합체로 절단). 실험에 사용되는 모든 화학 물질은 재료 표에표시됩니다.

1. 오존과 LPS 는 뮤린 폐 부상의 유도에 대한 노출

1. 오존 노출
   1. 사용자 지정 O₃ 유도 상자를 준비합니다. 마우스 사료, 물병, 농축 장난감, 깨끗한 침구를 순서대로 추가하고 마우스의 주거 환경을 모방하십시오.
      참고: 이 단계는 마우스가 사용자 지정 유도 상자에 보관할 때 음식과 물에 무료로 접근할 수 있도록 보장하고 과도한 스트레스를 완화하는 데 도움이 됩니다.
   2. O₃ 교정기/발전기 "ON"(입구 포트쪽으로 배치)을 전환하여 손 전(노출 15분 전) UV 램프를 안정화하고 인라인 O₃ 모니터와 연결합니다.
      참고: O₃ 모니터는 일정한 챔버 공기 온도(72 ±3°F) 및 상대 습도(50±15%)에서 콘센트에서 샘플링한 바와 같이 평균 0.05 ppm을 읽어야 합니다.
   3. O₃ 노출의 경우 마우스를 사용자 지정 유도 상자에 부드럽게 배치하고 마우스를 0.05 ppm O_3에 지속적으로 노출시 2h.
2. 마취 및 비강 내 LPS 관리
   1. 케타민과 자일라진에 대해 10 mg/mL 주식을 별도로 준비합니다.
   2. 케타민 20부분과 자일라진 1부를 섞어 칵테일을 준비한다. 마우스의 무게가 X g인 경우 케타민/자일라진 칵테일을 복막 구멍에 넣습니다. 마우스 1개의 경우 10 mg/mL 케타민 스톡의 10mg/mL 케타민 스톡의 10μL과 자일라진 재고의 50 μL로 구성된 칵테일 1mL를 준비하십시오. 마이크로퍼지 튜브에서 위아래로 파이프를 통해 잘 섞습니다.
      참고: 케타민과 자일라진 주식은 일주일 전에 준비할 수 있습니다.
   3. 가벼운 인트라피오날(IP) 케타민(50 mg/kg)/자일라진(1 mg/kg) 믹스(예: 25g 마우스의 경우 0.125mL의 칵테일을 주입)에서 마우스를 마취시한다.
   4. LPS의 1 mg/mL 용액을 식염수에 준비하고 용액의 50 μL을 파이펫에 채웁니다.
   5. 손바닥에 등/등쪽 면으로 마우스를 똑바로 잡고 귀를 같은 손으로 잡습니다. 이제 LPS 용액의 50^{μL(18μL)을} 콧구멍 바깥쪽(예: 각 콧구멍에 25 μL 또는 콧구멍에 50 μL) 한 콧구멍에 배치하고 마우스가 LPS 용액을 흡입할 수 있도록 합니다.
   6. 멸균 식염수 50 μL로 제어 마우스를 주입합니다.
      주의: 치명적일 수 있는 주입을 위해 100 μL 이상을 초과하지 마십시오. 부피(예: <50 μL)가 너무 적고 비강 증착의 위험이 있습니다.
   7. LPS 투여 후, 부드럽게 마우스를 내려 놓고, 그들의 위 또는 그들의 머리가 약간 아래쪽으로 기울어진 침구의 마운드에 그들의 등.
      참고: 이 방향은^{비강(19)에서}용액의 유지를 연장합니다.
   8. 0, 2, 4, 24, 36 및 72 h에서, 케타민 (200 mg/kg)/자일라진 (4 mg/kg) 믹스 (즉, X는 그램 또는 0.50 mL)의 마우스 무게인 칵테일의 전체 복용량으로 마우스 i.p.를 마취시킵니다.
   9. 그것은 의식과 오른쪽 반사를 잃을 때까지 마우스를 관찰 (즉, supine 위치에 누워있을 때 다시 설정하지 않습니다). 지금, 마취의 깊이를 마우스를 확인, 호흡을 모니터링하여 (리듬 가슴 여행) 및 심박수, 이는 눈에 띄게 떨어질 한다, 후 1-2 분.
   10. 다음으로, 페달 반사 신경, 즉, 뒷다리 자릿수 중 하나를 꼬집고 반사로 사지의 후퇴를 관찰하십시오. 마우스가 반응하는 경우 필요에 따라 추가 0.1 mL 주사 이상을 가진 상향 식.
       참고: 깊은 마취를 달성하기 위하여는, 특정 긴장 또는 뚱뚱한 마우스는 일반적으로 분포의 더 큰 양을 가지고 있고 이렇게 쉽게 과잉 투약될 수 있다는 것을 명심하십시오, 전체 마취를 위해 허용되지 않는 경우에 충분한 시간이 있는 경우에 (약 10 분 이상이 될 수 있습니다). 따라서, 일부 균주는 마취에 저항할 수 있고 따라서 더 많은 탑업을 요구할 수 있습니다. 이 지식은 다른 긴장과 나이의 마우스를 가진 많은 실제적인 관측 그리고 경험 후에 취득됩니다. O₃ 및 LPS 노출 직후에 몇 가지 파일럿 실험이 수행되었기 때문에 (즉, 2 시간 시점에서), 우리는 또한 결합 된 O₃및 LPS 노출의 즉각적인 효과를 강조하기 위해 그 실험에서 매우 초기 BAL 세포 분석을^{포함시켰습니다.}

2. 샘플 컬렉션

1. 수술 트레이에 마우스를 놓습니다. 이제 유체 손실을 피하고 70 % 에탄올 스프레이로 마우스를 살균하기 위해 두 눈에 윤활 눈 연고를 부드럽게 넣습니다.
   1. 가위로 상부및 하부 피부 막을 통해 작은 상처를 만들어 기관지와 흉부를 노출시킵니다.
   2. 흉골 바로 아래에 상처를 만들고 마음을 노출하십시오.
2. 심장 펑크
   1. 25G 바늘을 오른쪽 심실로 부착한 25G 바늘을 오른쪽 심실로 넣고 심장 펑크로 혈액을 그립니다.
      참고 : 심장구멍을 노출에서 심장 펑크에 시간이 1 분 미만인 경우 혈액은 일반적으로 최소한의 플런저 무승부로 그립니다. 약 0.4-0.5 mL를 수집 한 후, 하나는 나머지 혈액을 수집하기 전에 몇 초 동안 일시 중지해야 할 수 있습니다. 이것은 심장이 오른쪽 심실 챔버로 남아있는 볼륨을 펌핑 할 수 있도록 수행됩니다. 혈액 수집이 끝날 때까지 심장이 펌프를 멈춥니다.
   2. 혈액을 수집하고 추가 처리를 위해 미세 분리 튜브에 보관하십시오.
3. 기관 절제술
   1. 핀셋/무딘 집게를 조심스럽게 사용하여 조직 과열된 조직에서 기관 영역을 제거하십시오. 출혈을 피하기 위해 수술 기구보다 장갑을 낀 손을 더 많이 사용하십시오. 혈액이 많이 스며들면 BAL 샘플을 오염시킬 위험이 있습니다. 필요한 경우 면봉을 사용하셔야 하지만 바람직하지는 않습니다. 킴 와이프는 더 나은 대안입니다.
   2. 이제 흉곽을 잘라 폐를 노출하십시오. 다시 말하지만, 흉골과 늑간 동맥 또는 오름차순 대동맥을 자르지 않도록주의하십시오. 리브 케이지를 통과하는 동안 작은 컷을 만듭니다)
   3. 회자 스닙 아래에 면 합자를 전달하고 당분간 그대로 둡니다.
   4. 폐를 가리키는 1/3^rd 부분의 적절한 위치에서 기관을 잘라 28 G 기관 캐뉼라에 대한 액세스를 허용합니다.
   5. 기관체에 28 G PE 캐뉼라(최소 길이 3-5mm 및 삽입용 다산 단종)를 삽입합니다. 분기전에 기관의 끝을 조심한 다음 다시 mm를 당겨 단일 로브만 샘플링하지 않도록 하십시오.
   6. 단단히, 제자리에 캐뉼라를 개최하는 면 합자 묶는다. 캐뉼라를 붕괴시키지 마십시오.
4. 기관지 알베올라 라베이지 (BAL)
   1. 1 mL 주사기에 PBS의 0.5 mL을 채웁니다.
   2. 이제 점차적으로 1 mL 주사기의 도움으로 캐뉼라에 PBS의 0.5 mL을 주입합니다.
   3. PBS를 주입 한 후, 흡입에 저항하지 않는 한 주사기를 흡인.
      참고: BAL 유체를 흡입하는 동안 저항이 있는 경우 폐포 또는 기관지 조직의 붕괴를 나타냅니다. 이 경우, 조직의 벽을 형성하는 캐뉼라를 분리하기 위해 작은 캐뉼라에 의해 캐뉼라를 다시 당깁니다.
   4. 라벨이 부착된 미세 분리 튜브에서 흡인된 액체를 수집하고 얼음 위에 놓습니다.
   5. 동일한 바이알에서 유사한 방식으로 두 개의 라브를 더 수행하십시오(즉, 총 0.5 X 3 = 1.5 mL 라베이지).
   6. 수집된 BAL 유체의 부피를 측정합니다. 라베지 회수는 90%에 가깝습니다.
5. 폐 혈관 난투 (LVP)
   1. 투심실을 통해 침투하는 동안 폐에서 난파의 백업을 피하기 위해, 흉부와 복부 반쪽 사이의 위치에서 내림차순 흉부 대동맥을 잘라.
   2. 상처된 대오르타 끝 근처에 구멍을 뚫고 피가 없는 구멍을 뚫는다.
   3. 다음으로, 오른쪽 심실을 통해 주입 된 방 온도 헤파린화 된 식염수의 0.5 mL로 폐를 퍼펙드합니다.
   4. 내림차순 흉부 대동맥의 절단 끝에 있는 구멍에서 혈관 분리를 수집하고, 마이크로후지 튜브에 넣고 얼음 위에 놓고 그 부피를 측정합니다.
   5. 오른쪽 기관지 근위를 기관지(면실)에서 분기로 리게이트합니다.
6. 좌측 폐 고정
   1. 1mL 주사기를 기관 캐뉼라에 연결하면 이전 기관 절개를 통해 삽입할 수 있을 만큼 충분히 길다.
   2. 최대 0.6mL 마크까지 주사기에 공기를 다시 그립니다.
   3. 그런 다음, 실온에서 2 %의 파라 포름알데히드로 나머지 주사기 (끝까지)를 채웁니다. 캔눌라에서 공기를 빨지 않고 플런저가 튀어 나올 준비가 되어 있는지 확인하십시오.
   4. 이제 주사기를 스카치 테이프로 부착하고 최대 20cm 높이의 직립 용기에 부착합니다.
   5. 부드럽게 플런저를 꺼내 서 고정 된 흐름을 기관쪽으로 합니다. 캐뉼라에 몇 개의 기포가있는 경우, 주사기 위에 플런저를 부드럽게 놓고 유체가 몇 초 후에 흐르기 시작합니다.
   6. 왼쪽 폐가 20cm 의 물 기둥을 형성하는 20cm 높이에서 5 분동안, 그 자리에서 총 용량으로 팽창하자.
   7. 이 절차 도중, 이것이 다운스트림 분석에 영향을 미치기 때문에 paraformaldehyde와 접촉에서 적당한 폐 엽을 보호하십시오.
   8. 접힌 실험실 조직을 배치하여 올바른 폐 엽과 접촉할 수 있는 파라포름알데히드를 흡수하십시오.
      주의: 파라포름알데히드는 매우 독성이 있습니다. 따라서 신체의 노출 부위에 흡입하거나 접촉하지 마십시오. 취급 하는 동안 극단적인 주의 하 고 있습니다.
   9. 파라포름알데히드 주입 시간 동안 복부를 살균하십시오.
   10. 기관에서 올바른 폐 엽을 잘라 내어 어떤 실도 제거하고 즉시 라벨극에 로브를 넣고 폐 호모전의 다운스트림 분자 / 생화학 사이토카인 분석 / RT-PCR / 서부 블롯 분석을위한 액체 질소에 떨어 뜨립니다.
   11. 모든 결합 조직 또는 흉막에 대 한 왼쪽 폐를 신중 하 게 손질 하 고 4°C에서 24 시간 동안 2% paraformaldehyde에 찍어.
   12. 표준 포함 프로토콜에 따라 파라핀에 고정 폐를 포함.
       주의: 폐 샘플을 과도하게 가열하지 마십시오.
   13. 복부 부분을 잘라 골반 (엉덩이) 뼈에서 피부를 제거합니다.
   14. 왼쪽과 오른쪽 대퇴골 뼈를 골반 부분에서 분리하고, 얼음 위에 보관된 식염수 채워진 페트리 접시에 담아 낸다.
7. 흉골과 대퇴골 골수 흡인 컬렉션
   1. 실험실 조직을 사용하여 뼈에서 조직과 근육을 청소하십시오.
   2. 복부 흉곽과 흉골을 얼음 위에 보관한 식염수 채워진 페트리 접시에 넣습니다.
   3. 흉골과 대퇴골 뼈의 단부및 근위 팁을 잘라냅니다.
   4. 뼈를 0.5mL의 식염수로 4회 퍼퓨즈하고, 잘 맞는 바늘(24~28G)을 1mL 주사기에 사용하고, 각 뼈의 분획을 필터가 장착하고 얼음 위에 놓는 라벨이 부착된 튜브로 수집합니다.
      참고: 바늘 게이지는 동물의 크기마다 다릅니다. 플러시 후, 대퇴골 뼈는 투명하게 나타나야 한다.
   5. 샘플을 채취하면 기관 동물 시설의 지침에 따라 마우스를 비닐 봉지에 넣고 동물 용 시체 냉동고에 넣어 적절한 폐기를하십시오.

3. 샘플 처리

1. 총(TLC) 및 차동(DLC) 백혈구 개수
   1. 원심분리기 말초 혈액, BAL, 폐 혈관 두반및 골수(흉골 및 대퇴골) 시료는 500g에서 10분 동안 샘플링합니다.
   2. 초월제를 수집하고 플래시를 얼리고 추가 분석이 될 때까지 -80 °C에 저장하십시오.
   3. PBS의 최소 200 μL에서 세포를 재구성합니다.
   4. BAL, 혈액, 폐 혈관 배반 및 골수 세포를 혈전계에 계산하여 TLC를 수행합니다.
   5. 또 다른 9 μL 알리쿼트는 칼신 그린과 적색 에모디듐 호모이머-1의 1 μL 혼합을 혼합하여 세포 내 에스트라아제 활성 및 손상된 BAL 세포(빨간색)로 인해 살아있는(녹색) 세포를 정량화한다.
   6. 혈액 TLC에 대한 1:10 비율과 폐 혈관 persatsate TLC에 대한 1:2 비율로, 2 % 아세트 산을 LCC를 lyse에 추가합니다.
      주의: 농도가 mL당 1x10⁶ 세포(골수 샘플에 매우 중요한 경우)가 PBS에서 희석하여 세포 농도를 조정합니다.
   7. DlCs에 대해 아래에 설명된 대로 슬라이드 및 얼룩에 세포 스핀을 준비하는 세포를 원심분리합니다.
      참고: 일반적으로 한 슬라이드에서 두 개의 사이토스핀을 준비할 수 있습니다. 그리고 10-15분간의 공기 건조 후 염색 단계를 진행합니다.
   8. 수집된 BAL을 그룹당 3마리의 파일럿 마우스에서 각각 2개의 사이토스핀으로 나누고 활성 산화 인산화(감소된 미토트래커)를 사용하여 액틴/튜룰린 및 미토콘드리아에 얼룩을 두게 한다. NK1.1/Gr1/CX3CR1 및 ATPβ/Ki-67/CD61/혈관스타틴 스테인드 슬라이드에 대해 각각 3마리의 마우스에서 BAL을 두 개의 사이토스핀으로 나눕다. BAL을 3마리 이상의 마우스에서 ATPα/Ly6G 및 CX3CR1/시글렉-F에 얼룩이 두 개 더 넣습니다.
2. 기관지알알라 라베이지(BAL) 및 폐 혈관 퍼서막 (LVP) 총 단백질 정량화
   1. 두 개의 폐 구획(즉, 폐포 중격(interstitial) 및 폐 혈관 배관(혈관) 구획에서 혈관 장벽 또는 상대적 온코틱 압력의 O₃ 및 LPS 유도 된 혼란을 정량화하기 위해, 수집된 유체의 총 단백질 함량을 측정한다.
   2. 표준 세제 내성 색소측정 분석을 사용하여 총 단백질 농도에 대한 해동 된 상피 분획을 분석하십시오.
   3. 기관지알알포라 라베이지(BAL) 및 폐 혈관 두반 (LVP) 케모킨 분석
      1. 다음으로, 33플렉스 자기 비드 계 면역분석제를 사용하여 BAL 및 폐 혈관 난투(LVP) 주퍼나티제에서 케모키네를 분석한다. 이것은 결합된 노출 후에 확립된 기도/막시티움 대 혈관 chemokine 그라데이션의 방향성에 관하여 알려줄 것입니다.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory 단백질-3 베타), 란테(활성화에 규제됨, 통상T세포 발현 및 분비(CCL5)), CXCL-12/SDF-1알파(기질세포 유래 인자 1), TARC(흉구 및 활성화 조절 케모키네(TARC), TECK(흉구 발현 케모키네(CCL25α) 및 TF).

4. 사이토스핀 염색 및 폐 히스토로지

1. 사이토스핀 생화학 적 염색
   1. 시술 중에 인큐베이션용 화학 물질을 함유하기 위해 소수성 펜으로 사이토스핀을 둘러싸는다.
   2. PBS에서 사이토스핀을 5분간 재수화합니다.
   3. 사이토스핀 샘플을 2% 파라포름알데히드로 10분간 수정하고, PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분간 세척합니다.
   4. 7분 간 얼음 냉기 70% 아세톤으로 페메아빌레를 만들고, PBS로 각각 5분간 3회 세척합니다.
   5. 액틴 및 튜룰린 또는 감소된 미토트래커에 대한 스테인(알렉사 488 개의 공주 된 남근의 2 μg/50 μL의 혼합으로 배양하고, 알렉사 555 개의 공주 마우스 반 α 튜룰린 또는 감소 된 미토 트래커의 2 μg /μL을 15 분 동안 각각 빨간색으로 표시하십시오.
      참고: 마우스 IgG1 등색 조절 항체를 별도의 사이토스핀에서 사용하여 튜룰린 염색 프로토콜을 검증합니다. 설명된 것과 동일한 단계를 수행 4.1.1 ~ 4.1.8, 하지만 등류형 컨트롤에 대 한.
   6. 슬라이드에서 믹스를 부드럽게 팁으로써 얼룩을 제거합니다. DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)와 슬라이드를 5-10 분 동안 스테인 핵으로 배양하십시오.
   7. 싸이토스핀을 PBS로 3회 세척하고, 페이드 방지 마운팅 미디어로 커버슬립을 하고, 이미징 전에 실온에서 밤새 어두운 시간에 보관하십시오.
   8. 과학 카메라가 장착된 넓은 수직 현미경으로 이미지를 획득합니다. 이미징 슬라이드시 다양한 형광 채널에 대해 일관된 카메라 노출 시간을 설정합니다.
2. 세포스핀 면역 형광 염색:
   1. 시술 중에 인큐베이션용 화학 물질을 함유하기 위해 소수성 펜으로 사이토스핀을 둘러싸는다. PBS에서 사이토스핀을 5분간 재수화합니다.
   2. 사이토스핀 샘플을 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 배양하여 수정하고, PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분간 세척합니다.
   3. 2분 동안 0.1% 콜드 트리톤 X-100으로 페메아빌리징, PBS로 3회 3회 세척하여 5분간 세척합니다.
   4. 다음으로, Fc 블록은 1:50의 Fc 블록 항체 스톡의 희석으로 사이토스핀을 배양하여 15분 동안 차단한다(1차 마우스 항체가 마우스 Fc 항체와 구체적으로 비반응하지 않도록 하기 위해).
   5. 슬라이드를 팁으로 슬라이드를 제거하고 1% BSA로 변경하고 관심 있는 3가지 주요 항체(다양한 조합의 표 1참조)를 30분 동안 혼합하여 사이토스핀을 배양한다.
      참고: 최근^연구에서논의된 바와 같이 해당 이차 항체와 병행하여 4.2.1 ~4.2.9단계를 수행하여 동종형 대조군(혼합 마우스 IgG1 및 rat IgG2b kappa 1차 항체를 배양하여 배양하고 항체를 동위형 대조군으로 대체)을 실행해야 한다.
   6. PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분 동안 세척합니다. 시토스핀을 적절히 설계된 이차 항체의 혼합으로 배양하십시오(자세한 내용은 표 1을 참조하십시오).
   7. 슬라이드에서 믹스를 부드럽게 팁하여 얼룩을 제거하고 DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)로 5-10 분 동안 스테인 핵을 제거하십시오. PBS로 3회 3회 세척하여 각각 5분 동안 세척합니다.
   8. 페이드 방지 마운팅 미디어가 있는 커버슬립과 이미징 전에 실온에서 밤새 어두운 시간에 보관하십시오.
   9. 과학 카메라가 장착된 넓은 수직 현미경으로 이미지를 획득합니다. 이미징 슬라이드시 모든 불소 채널에 일관된 카메라 노출 시간을 설정합니다.
3. 헤마톡클린과 에오신(H&E) 히스토로지
   1. 모든 그룹에 대해 폐 저온 섹션에 수정 된 H&E 염색^3을 수행하십시오.
4. 이미지 분석
   1. 피지 ImageJ 오픈 소프트웨어(https://imagej.net/Fiji/Downloads)에서 이미지 데이터(.tiff) 파일을 처리하고 분석합니다.
   2. 필요한 매개 변수(영역, 둘레, 통합 밀도, 셰이프 설명자, Feret의 지름, 원형, 표시 레이블)를 분석 탭 및 설정 측정아래에 기록합니다.
   3. ROI 관리자를사용하여 "프리핸드 선택" 도구를 사용하여 병합된 이미지 패널에서 약 50-200개의 셀을 수동으로 간략하게 설명합니다. Ctrl+T 명령으로 관심 영역(ROI)을 저장하고 각 셀에 대해 저장된 ROI를 모든 플루오로포어 채널에 복사합니다.
   4. 다음 프레스 Ctrl+M모든 형광 채널에 대한 사전 설정 매개 변수를 측정 (예를 들어, 405 nm (파란색DAPI 또는 ATPβ), 488 nm (액틴 또는 NK1.1 또는 녹색기-67), 568 nm (튜룰린 또는 Gr1 또는 CD61 빨간색) 및 633 nm (CCR).
   5. 분석을 나타내는 적절한 이름으로 결과를 .csv 파일로 저장합니다. .csv 파일에서 스프레드시트에 결과를 복사하고 염색된 분자의 형광 강도(FI)(결과 파일의 원시 통합 밀도 컬럼)를 염색 설계에 따라 DAPI 또는 CD61 FI로 분할합니다. 이러한 비율은 "DAPI 또는 CD61 정규화 된 FI 비율"이라고합니다.
   6. 다음으로, 이러한 정규화된 비율, 원형, 세포 둘레 및 페렛 직경을 플롯하여 결합된 O₃ 및 LPS 노출 후 세포 크기의 변화를 평가한다.
   7. 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 수집된 데이터의 정상성을 확인하고 null 가설을 테스트합니다(아래 통계 분석 섹션을 참조하십시오).
5. 통계 분석
   1. 결과를 평균 ± SEM으로 표현합니다. 최소 3마리의 마우스가 그룹당 사용되었다.
   2. chemokine 데이터 분석을 위해, Benjamini 및 Hoshberg 보정에 따라 거짓 발견 속도에 대 한 단방향 ANOVA p-값을 조정.
   3. 이러한 데이터가 일반적으로 배포되지 않았기 때문에 이미지 매개 변수, 셀룰러, 페렛 직경, 둘레, DAPI 또는 CD61 정규화된 형광 강도 비율을 Mann-Whitney U 테스트(두 그룹 비교용) 또는 크루스칼 월리스 테스트(여러 그룹 비교용)에 의해 분석합니다.
   4. 이미징 실험의 나머지 부분에 대 한, 분산의 단방향 분석을 사용 하 여 결과 분석 다음 Sidak의 여러 비교. p-값 <0.05는 중요한 것으로 간주되었습니다.

결과

결합된 O_3및 LPS 노출은 72h에서 전신 염증 및 골수 동원으로 이끌어 냅니다: 다른 구획에 있는 세포 수는 말초 혈액에 있는 중요한 변경을 밝혔고 대퇴골골총 세포는 결합한 O₃ 및 LPS 노출에 근거를 두는 때 계산합니다. 결합된_O3 및 LPS 노출은 총BAL(도 1A)또는 LVP(도1B)세포 수, 다형성형...

토론

현재 연구에서 제시된 방법은 폐 염증 도중 다중 세포 사건을 공부하기 위하여 다중 구획 분석의 유용성을 강조합니다. 표 2의결과를 요약했습니다. 우리와 많은 실험실은 광범위하게 폐 호중구의 급속한 모집에 의해 표시되는 비강 LPS 주입에 뮤린 반응을 연구했습니다, 이는 6-24 시간 사이 피크, 해상도차기. 그리고 최근에는 서브임상_O3(2시간 동안 0.05ppm)만으로도 폐 혈관 구?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock