Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi

Özet

Kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruz fareler nötrofiller de dahil olmak üzere geniş yayılmış hücre ölümü gösterir. Sitoskeletal lamellipodia'nın bozulması, karmaşık V ATP sintaz alt β birliğinin hücresel ekspresyonunun artması ve bronko-alveoler lavajda anjiyostatin, akciğer immün yanıtının baskılanması ve nötrofil alımının gecikmesi gibi hücresel adaptasyonları gözlemledik.

Özet

Akciğerler sürekli olarak steril (parçacıklar veya reaktif toksinler) ve enfeksiyöz (bakteriyel, viral veya mantar) enflamatuar durumlar şeklinde doğrudan ve dolaylı hakaretlerle karşı karşıya kalır. Ezici bir konak yanıtı, pato-mantıksal konak immün, pıhtılaştırıcı ve doku remodeling yanıtının bir sonucu olarak akciğer nötrofil alımı ile karakterize olan solunum ve akut akciğer yaralanması ile sonuçlanabilir. Bir TLR4 agonisti olan bakteriyel lipopolisakkarit ile birlikte güçlü bir çevresel kirletici olan düşük doz (0,05 ppm) ozona yanıt olarak, murine akciğer hücresel adaptasyonlarını görselleştirmek ve ölçmek için hassas mikroskobik yöntemler, konakçı enflamatuar ve onarım mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının, akciğer vasküler perfüzyonunun, sol akciğer kriyoseksiyonlarının ve sternal kemik iliğinin perfüzyonunun kapsamlı bir floresan mikroskobik analizini açıklıyoruz. Analiz edilen bölmelerde ayrık kemokin gradyanları ile işaretlenen gecikmiş (36-72 saate kadar) immün yanıt ile korelasyonda alveoler makrofajlar, nötrofiller, akciğer parenkimal dokusunun yanı sıra kemik iliği hücrelerinin hasarını gösteriyoruz. Ek olarak, akciğer hücre dışı matris ve hücresel sitoskeletal etkileşimler (aktin, tubulin), mitokondriyal ve reaktif oksijen türleri, pıhtı önleyici plazminojen, anti-anjiyojenik peptit parçası anjiyostatin, mitokondriyal ATP sintaz kompleks V alt ünlemleri, α ve β sunuyoruz. Bu taşıyıcı belirteçler, yeterli in vitro hücre bazlı tahliller ve intravital mikroskopi gibi in vivo hayvan görüntüleme teknikleri ile desteklendiğinde, yeni immünomodülatör ajanlara akciğer yanıtını anlamaya yönelik hayati bilgiler sağlayabilir.

Giriş

Akut akciğer hasarı (ALI), pıhtılaştırıcı, fibrinolitik ve doğuştan gelen bağışıklık sistemlerinin eşzamanlı aktivasyonu ile işaretlenen akciğerlerin enfeksiyöz veya diğer zararlı uyaranlara verdiği önemli bir patolojik yanıttır^1. Nötrofiller, Toll benzeri reseptör (TLR) ailesi²,^3,4aracılığıyla mikrobiyal ve hücre içi hasar kalıplarını derhal algılar. Nötrofiller önceden biçimlendirilmiş sitokinleri ve sitotoksik granül içeriğini serbest bırakır ve bu da daha sonra kollateral doku hasarına neden olabilir. Ortaya çıkan alveolar hasar, adenozin trifosfat (ATP)⁵gibi moleküllerin salınmasıyla yol açan ikincil hücre ölümü ile gölgelenir, böylece bağışıklık düzensizliğinin kısır bir döngüsüne girer.

ALI'nin anlaşılmasında çözülmemiş bir sorun, yaralanmanın alveolar membran içinde nasıl başlatıldığı sorusuyla ilgilidir. Elektron taşıma kompleksi V, F1F0 ATP synthase, iltihaplanma sırasında hücre (endotel, lökosit, epitel dahil) plazma zarı üzerinde her yerde ifade edildiği bilinen bir mitokondriyal proteindir. Aktin ve tübulin içeren hücre sitoskeleton, sırasıyla mitokondriyal proteinlerin yanı sıra birçok hücre şekli ve fonksiyon modülasyonunu barındırır. Son zamanlarda atp sintaz endojen molekül tarafından abluka göstermiştir, anjiyostatin, nötrofil işe alımını susturur, aktivasyon ve lipopolisakkarit (LPS) indüklenmiş akciğer iltihabı⁶. Böylece, hem biyokimyasal (ATP sintaz) hem de immün (TLR4) mekanizmalar akciğer iltihabı sırasında alveoler bariyeri düzenleyebilir.

Çevresel bir kirletici olan ozona (O₃₎maruz kalmak akciğer fonksiyonlarını bozar, pulmoner enfeksiyonlara duyarlılığı arttırır ve kısa düşük O₃ maruziyetleri alttaki kardiyorespiratuar koşulları 7 , 8 ,9 ,^10,11,12, 13^,14olanlarda mortalite riskini arttırır. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili O₃ konsantrasyonlarına maruz kalmak, temel inflamasyon mekanizmalarını incelemek için anlamlı bir ALI modeli sağlar^7,8. Laboratuvarımız son zamanlarda düşük doz O₃ indüklenmiş ALI¹⁵bir murine modeli kurmuştur. Düşük O₃ konsantrasyonlarına bir doz ve zaman tepkisi yaptıktan sonra, 2 saat boyunca 0.05 ppm O_3'e maruz kalmanın, LPS modeline benzer şekilde akciğer ATP sintaz kompleks V alt bir β liği (ATPβ) ve anjiyostatin ekspresyosu ile işaretlenen akut akciğer yaralanmasına neden olduğunu gözlemledik. İntravital akciğer görüntülemesi, akciğer hasarına işaret eden alveolar aktiin mikrofilamentlerinin dağınıklığını ortaya çıkardı, ve alveolar septal reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyelerinin (temel hücre sinyalinin kırılmasını gösteren) ve mitokondriyal membran potansiyelinin (akut hücre ölümünü gösteren) heterojen akciğer 18 FDG tutma^16,nötrofil alımı ve sitokin salınımı ile ilişkili olan 0,05 ppm O₃^{15'e 2}saat maruz kaldıktan sonra ablasyonu, özellikle IL-16 ve SDF-1α. Son çalışmalarımızdan eve götür mesajı, O_3'ün insan maruziyeti için 8 saat (günde) üzerinde 0.063 ppm'lik izin verilen sınırların altındaki konsantrasyonlarda maruz kaldığında katlanarak yüksek toksisite ürettiğidir. Daha da önemlisi, bu alt klinik O₃ maruziyetlerinin bakteriyel endotoksin¹⁷gibi TLR4 aracılı mekanizmaları modüle edip etmeyeceği konusunda net bir anlayış yoktur. Böylece, çift isabetli bir O₃ ve LPS maruz kalma modelini inceledik ve immün ve bağışıklık dışı hücresel adaptasyonları gözlemledik.

Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının (yani, BAL) lavajlı akciğer dokusunda kalan yerleşik parankimal ve yapışık lökositlere bakmak için alveolar boşlukları, akciğer damar perfüzyonlarını (yani LVP) örnekleyen akciğer damar perfüzyonu (yani, LVP) endotel bariyerinin tehlikeye girmesi durumunda alveolar septal interstisyumu, sol akciğer kriyoseksiyonlarını örnekleyen , dolaşımdaki lökositleri temsil eden periferik kan ve inflamasyon sırasında hematoetik hücre mobilizasyonunun proksimal ve distal bölgelerini örnekleyen sternal ve femur kemik iliği perfüzyonları.

Protokol

Çalışma tasarımı Saskatchewan Üniversitesi Hayvan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı ve insancır hayvan kullanımı için Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine bağlı kalındı. Altı-sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareler temin edildi. NOT: Planlanan bitiş noktasından önce şiddetli uyuşukluk, solunum sıkıntısı veya diğer şiddetli sıkıntı belirtileri gelişen hayvanları ötenazi edin.

NOT: Aşağıdakileri hazırlayın: 27-18 G iğne körelmiş (fare trakeal çapına bağlı olacaktır), künt iğneye uyacak şekilde uygun boyutta PE boru (her fare için bir PE kanül yapın), kanül, 2 keskin makas, 2 künt forseps (küçük), 1 keskin forseps (küçük), 3 1 mL şırınga, etiketli mikroyakıt tüpleri (BAL, kan, damar ve kemik iliği perfüzyon toplama için) ve etiketli şişeler (doku fiksasyonu için), doku toplama için örnek torbalar / cryovials, kasap pamuk ipliği rulosu (yeterli büyüklükte ligatürlere kesilmiş). Deneyler için kullanılan tüm kimyasallar Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.

1. Murine akciğer hasarının indüksiyonu için ozon ve LPS maruziyetleri

1. Ozon maruziyeti
   1. Özel bir O₃ indüksiyon kutusu hazırlayın. Fare yemi, su şişesi, zenginleştirme oyuncakları ve temiz yatak takımlarını sırayla ekleyin ve farelerin barınma ortamını taklit edin.
      NOT: Bu adımlar, farelerin özel indüksiyon kutusunda barındırıldığında yiyecek ve suya ücretsiz erişmelerini sağlayacak ve gereksiz stresi hafifletmeye yardımcı olacaktır.
   2. UV lambasını elden önce stabilize etmek için O₃ kalibratörünü/jeneratörünü "ON" (giriş portuna doğru yerleştirilmiş) değiştirin (pozlamalardan yaklaşık 15 dakika önce) ve hat içi O₃ monitöre bağlayın.
      NOT: O₃ monitör, sabit oda hava sıcaklığında (72 ±3 °F) ve bağıl nemde (%50±15) çıkıştan örneklenerek ortalama 0±05 ppm okumalıdır.
   3. O₃ pozlamaları için, fareleri özel indüksiyon kutusuna hafifçe yerleştirin ve fareleri sürekli olarak 2 saat boyunca 0,05 ppm O_3'e maruz bırakın.
2. Anestezi ve intranazal LPS yönetimi
   1. Ketamin ve kslazin için ayrı ayrı 10 mg/mL stok hazırlayın.
   2. 20 parça ketamin ve 1 parça ksilazini karıştırarak bir kokteyl hazırlayın. Fare X g ağırlığındaysa, periton boşluğuna (X/200) mL ketamin/ksilazin kokteyli enjekte edin. Bir fare için, 10 mg / mL ketamin stoğunun 1000 μL'sine ve ksilazin stoğunun 50 μL'sine oluşan 1 mL kokteyl hazırlayın. Bir mikro yakıt tüpünde yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
      NOT: Ketamin ve ksilazin stokları bir hafta önceden hazırlanabilir.
   3. Fareleri hafif intraperitoneal (IP) ketamin (50 mg/kg)/ksilazin (1 mg/kg) karışımı altında uyuşturun (örneğin, 25 g fare için kokteylin 0,125 mL'sini enjekte edin).
   4. Salin içinde 1 mg / mL LPS çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin 50 μL'yi bir pipette doldurun.
   5. Fareyi avuç içinde sırt/sırt tarafıyla dik tutun, kulakları aynı elle tutun. Şimdi, LPS çözeltisinin 50 μL'si¹⁸ hafifçe burun deliklerinin dışına yerleştirin (yani, her burun delicinde 25 μL veya bir burun deliğinde 50 μL; prosedür hızlı olduğu sürece önemli değildir) ve farelerin LPS çözeltisini solumasına izin verin.
   6. Kontrol farelerini 50 μL steril salin ile aşıla.
      Dikkat: Aşılama için ölümcül olabilecek 100 μL'den fazla olmayın. Çok az hacim (yani, <50 μL) ve sadece burun birikimi riski vardır.
   7. LPS yönetimini takiben, fareleri yavaşça, midelerine veya sırtlarını başlarını hafifçe aşağı bakacak şekilde yatak yığınına yatırın.
      NOT: Bu yönelim, çözeltinin burun boşluğunda tutulmasını uzatır¹⁹.
   8. Maruziyetten sonra 0, 2, 4, 24, 36 ve 72 saat'te, fareleri tam doz ketamin (200 mg/ kg) / ksilazine (4 mg / kg) karışımı (örneğin, X'in gram olarak fare ağırlığı veya 25 g fare için 0.50 mL olduğu kokteylin X / 50 mL) ile uyuşturun.
   9. Fareyi bilincini ve doğru refleksi kaybedene kadar gözlemleyin (yani, sırtüstü pozisyonda yatırıldığında geri dönmez). Şimdi, 1-2 dakika sonra gözle görülür şekilde düşmesi gereken solunum (ritmik göğüs gezileri) ve kalp atış hızını izleyerek fareyi anestezi derinliği açısından kontrol edin.
   10. Daha sonra, pedal reflekslerini kontrol edin, yani arka uzuv basamaklarından birini kıstırın ve bir refleks olarak uzuvların geri çekilmesini gözlemleyin. Fare yanıt verirse, gerektiğinde ek 0,1 mL enjeksiyonları veya daha fazlası ile yükleme.
       NOT: Derin anestezi elde etmek için, bazı suşların veya obez farelerin genellikle daha büyük bir dağılım hacmine sahip olduğunu ve bu nedenle tam anestezi için yeterli zaman izin verilmezse (yaklaşık 10 dakika veya daha fazla olabilir) kolayca aşırı yapılabilir. Buna göre, bazı suşlar anesteziye karşı dirençli olabilir ve bu nedenle daha fazla yükleme gerektirir. Bu bilgi, farklı suşlardan ve yaştaki farelerle birçok pratik gözlem ve deneyimden sonra edinilir. O 3 ve LPS maruziyetlerinden hemen sonra (yani₂ saat zaman noktasında) birkaç pilot deney de yapıldığı için, kombine O₃^{ve LPS maruziyetinin} hemen etkilerini vurgulamak için bu deneylerden bazı çok erken BAL hücre analizlerini de dahil ettik.

2. Örnek toplama

1. Fareyi cerrahi tepsiye yerleştirin. Şimdi, sıvı kaybını önlemek ve fareyi% 70 etanol spreyi ile sterilize etmek için her iki göze de yağlama göz merhemini hafifçe koyun.
   1. Trakea ve toraksı ortaya çıkarmak için üst ve alt deri zarlarını makasla küçük kesikler yapın.
   2. Göğüs kemiğinin hemen altında bir kesik yapın ve kalbi açığa çıkarın.
2. Kardiyak delinme
   1. Heparinize şırıngaya bağlı bir 25G iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve kalp delinmesi ile kan alın.
      NOT: Kalbi kalp delinmesine maruz kalma süresi bir dakikanın altındaysa, kan genellikle minimum piston çekilmesi ile çekilir. Yaklaşık 0.4-0.5 mL topladıktan sonra, kalan kanı toplamadan önce birkaç saniye duraklamanız gerekebilir. Bu, kalbin kalan herhangi bir hacmi sağ ventrikül odasına pompalamasına izin vermek için yapılır. Kan toplamanın sonunda, kalp pompalamak için durur.
   2. Kanı toplayın ve daha fazla işlem için mikroyapı tüplerinde saklayın.
3. Trakeostomi
   1. Trakeal bölgeyi aşırı dokudan temizlemek için cımbız /künt tokmakları dikkatlice kullanın. Kanamayı önlemek için eldivenli elleri cerrahi aletlerden daha fazla kullanın. Çok fazla kan sızıyorsa, BAL örneklerini kirletme riski vardır. Tercih olmasa da gerekirse pamuklu çubuk kullanın. Kimwipes daha iyi alternatifler.
   2. Şimdi, akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Yine, sternumu ve interkostal arterleri veya yükselen aortu kesmemek için dikkatli olun; göğüs kafesi boyunca ilerlerken daha küçük kesikler yapmak)
   3. Nefes borusunun altına pamuklu bir bağ geçirin ve şimdilik bu şekilde bırakın.
   4. 28 G trakeal bir kolayın erişimine izin vermek için nefes borusunun distal 1/3^rd kısmında akciğerlere doğru işaret ederek uygun bir yerde kırpın.
   5. Nefes borusuna 28 G PE'lik bir kolayil (minimum 3-5 mm uzunluğunda ve takma kolaylığı için kesilmiş distal uç) yerleştirin. Çatallanmadan önce nefes borusunun ucuna dikkat edin ve ardından sadece tek lob örneklemeyi önlemek için yaklaşık bir mm geri çekin.
   6. Kanülü yerinde tutmak için pamuk bağını sıkıca bağlayın. Canülleri çökertme.
4. Bronko-alveolar lavaj (BAL)
   1. 0,5 mL PBS'yi 1 mL şırınna doldurun.
   2. Şimdi yavaş yavaş 1 mL şırınna yardımıyla 0,5 mL PBS'yi kanolaya enjekte edin.
   3. PBS enjekte ettikten sonra, emişe direnmediği sürece şırınnayı epire edin.
      NOT: BAL sıvısını çıkarırken direnç varsa, bu alveolar veya bronş dokusunun çökmesini gösterir. Bu durumda, kanolün doku duvarlarını ayırmak için bir miniscule tarafından kanolü geri çekin.
   4. Aspire sıvıyı etiketli bir mikroyakıt tüpünde toplayın ve buza yerleştirin.
   5. Aynı şişede toplamada benzer şekilde iki lavaj daha gerçekleştirin (yani, toplam 0,5 X 3 = 1,5 mL lavaj).
   6. Toplanan BAL sıvısının hacmini ölçün. Lavaj iyileşmesi % 90'a yakın olmalıdır.
5. Akciğer vasküler perfüzyon (LVP)
   1. Sağ ventrikülden perfüzyon yaparken akciğerlerde perfüzyonun herhangi bir şekilde yedeklenmemesi için, torasik ve karın yarıları arasındaki bir yerde alçalan torasik aortu kesin.
   2. Kesilen aort ucunun yakınındaki boşluğu kansız olarak lekele.
   3. Daha sonra, akciğerleri sağ ventrikülden enjekte edilen 0,5 mL oda sıcaklığında heparinize salin ile perfuse edin.
   4. Vasküler perfüzyonu, azalan torasik aortun kesik ucundaki boşluktan, buza yerleştirilmiş bir mikrofuge tüpünde toplayın ve hacmini ölçün.
   5. Sağ bronş proksimalini trakeadan dallanmalarına kadar (pamuk ipliği ile) ligat edin.
6. In situ sol akciğer fiksasyonu
   1. 1 mL'lik bir şırınnayı trakeal kanamaya bağlayın, bu da önceki trakeal kesiden geçecek kadar uzundur.
   2. Şırınnada 0,6 mL işaretine kadar havayı geri çekin.
   3. Daha sonra, kalan şırınnayı (sonuna kadar) oda sıcaklığında% 2 paraformaldehit ile doldurun. Pistonun kanülden herhangi bir hava emmeden çıkmaya hazır olduğundan emin olun.
   4. Şimdi, şırınnayı 20 cm yüksekliğe kadar ölçülen dik bir kaba bir viski bandı ile yapıştırın.
   5. Yavaş yavaş, sabitleyicinin nefes borusuna doğru akmasını sağlamak için pistonu dışarı çekin. Kanonda birkaç hava kabarcığı olması durumunda, pistonu şırıncığın üzerine hafifçe yerleştirin ve sıvı birkaç saniye sonra akmaya başlayacaktır.
   6. Sol akciğerin 20 cm'lik bir su sütunu oluşturan 20 cm yükseklikten 5 dakikaboyunca toplam kapasitesine in situ şişmesine izin verin.
   7. Bu işlem sırasında, sağ akciğer loblarını paraformaldehit ile temas etmesini önleyin, çünkü bu durum aşağı akış testlerini etkileyecektir.
   8. Sağ akciğer loblarıyla temas edebilecek herhangi bir paraformaldehiti emmek için katlanmış laboratuvar dokuları yerleştirin.
      DİkKAT: Paraformaldehit oldukça zehirlidir. Bu nedenle, vücudun maruz kalan herhangi bir yerine soluma veya temas etmeyin. Kullanım yaparken çok dikkatli olun.
   9. Paraformaldehit aşılaması sırasında, karnı sterilize edin.
   10. Herhangi bir ipliği çıkardığınızdan emin olarak sağ akciğer loblarını trakeadan kesin ve lobları hemen etiketli bir cryovial içine koyun ve akciğer homojenliğinin aşağı akış moleküler / biyokimyasal sitokin analizi / RT-PCR / batı blot analizi için sıvı nitrojene bırakın.
   11. Herhangi bir bağ dokusu veya plevral membran için sol akciğeri dikkatlice kesin ve 4 °C'de 24 saat boyunca% 2 paraformaldehit içine batırın.
   12. Sabit akciğeri standart gömme protokolüne göre parafin içine gömün.
       Dikkat: Akciğer örneklerini aşırı ısıtmayın.
   13. Karın kısmını kesin ve pelvik (kalça) kemikten derisini sönümleyin.
   14. Sol ve sağ uyluk kemiği kemiklerini pelvik kısımdan, buzda tutulan tuzlu su dolu bir petri kabında ayırın.
7. Sternal ve femur kemik iliği aspirat koleksiyonu
   1. Laboratuvar dokularını kullanarak kemiklerin dokusunu ve kaslarını temizleyin.
   2. Ventral göğüs kafesi ve sternumu buzda tutulan tuzlu su dolu petri kabına toplayın.
   3. Sternal ve femur kemiklerinin distal ve proksimal uçlarını kesin.
   4. Kemikleri 1 mL şırıngaya iyi yerleştirilmiş iğneler (24 ila 28 G) kullanarak 0,5 mL salin ile 4 kez perfuse edin ve her kemikten fraksiyonları filtrelerle donatılmış ve buza yerleştirilmiş etiketli tüplere toplayın.
      NOT: İğne göstergesi hayvan boyutu arasında değişir. Kızardıktan sonra, uyluk kemiği şeffaf gösterilmelidir.
   5. Numuneler toplandıktan sonra, fareyi plastik bir torbaya koyun ve kurumsal hayvan tesisinin yönergelerine uygun şekilde uygun şekilde bertaraf edilmek üzere bir hayvan karkası dondurucusunda koyun.

3. Örnek işleme

1. Toplam (TLC) ve diferansiyel (DLC) lökosit sayımları
   1. Santrifüj periferik kan, BAL, akciğer vasküler perfüzyon ve kemik iliği (sternal ve femur) örnekleri 10 dakika boyunca 500 g.
   2. Süpernatantları toplayın, flaşla dondurun ve bir sonraki analize kadar -80 ° C'de saklayın.
   3. Hücreleri en az 200 μL PBS içinde yeniden inşa edin.
   4. Hemositometrede BAL, kan, akciğer vasküler perfüzat ve kemik iliği hücrelerini sayarak TLC yapın.
   5. Hücre içi esteraz aktivitesi nedeniyle canlı (yeşil) hücreleri ve plazma zar bütünlüğünün kaybı nedeniyle zarar görmüş BAL hücrelerini (kırmızı) ölçmek için bal'ın 9 μL'lik bir aliquotunu 1 μL'lik bir kalsein yeşili ve kırmızı ethidium homodimer-1 karışımı ile lekelenin.
   6. Lyse RBC'lere% 2 asetik asit ekleyin, kan TLC için 1:10 oranında ve akciğer vaskülerperfüzat TLC için 1:2 oranında.
      DİkKAT: Konsantrasyon mL başına 1x10⁶ hücreden fazlaysa (kemik iliği örnekleri için çok önemlidir) PBS'de seyrelterek hücre konsantrasyonlarını ayarlayın.
   7. DLC'ler için aşağıda açıklandığı gibi slaytlarda ve lekelerde sitospinler hazırlamak için hücreleri santrifüjleyin.
      NOT: Genellikle, bir slaytta iki sitospin hazırlanabilir. Ve 10-15 dakika hava kuruduktan sonra, lekeleme adımı ile devam edin.
   8. Toplanan BAL'ı grup başına üç pilot fareden her biri iki sitospin ve aktif oksidatif fosforilasyonlu (azaltılmış mitotracker) aktin/ tübülin ve mitokondri lekesine bölün. NK1.1/Gr1/CX3CR1 ve ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin lekeli slaytlar için bal'ı üç fareden daha kullanarak her biri iki sitospin'e bölün. BAL'ı üç fareden daha atpα/Ly6G ve CX3CR1/Siglec-F için leke yapmak üzere iki sayaca bölün.
2. Bronkoalveoler lavaj (BAL) ve Akciğer Vasküler Perfüzyon (LVP) toplam protein nicelemesi
   1. İki pulmoner bölmedeki (yani alveolar septal (interstisyel) ve akciğer vasküler perfüzyon (vasküler) bölmelerdeki vasküler bariyerin O₃ ve LPS kaynaklı pertürbasyonlarını veya bağıl onkotik basıncı ölçmek için toplanan sıvılardaki toplam protein içeriğini ölçün.
   2. Çözülen süpernatant fraksiyonları, standart bir deterjana dayanıklı kolorimetrik test kullanarak toplam protein konsantrasyonları için analiz edin.
   3. Bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer vasküler perfüzyon (LVP) kemokin analizi
      1. Daha sonra, BAL ve akciğer vasküler perfüzyon (LVP) süpernatantlarındaki kemokinleri 33 yönlü manyetik boncuk bazlı bir immünoassay kullanarak analiz edin. Bu, kombine maruziyetlerden sonra kurulan hava yolu/intersitium vs vasküler kemokin gradyanlarının yönü hakkında bilgi verecektir.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (aktivasyonda düzenlenir, normal T hücresi eksprese edilmiş ve salgılanmış (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromal hücre türevi faktör 1), TARC (timus ve aktivasyon düzenlenmiş kemokin (TARC)), TECK (Timus Eksprese Edilmiş Kemokin (CCL25)) ve TNFα (tümör nekroz faktörü alfa).

4. Sitospin lekeleme ve akciğer histolojisi

1. Sitospin biyokimyasal boyama
   1. İşlem sırasında inkübasyon için kimyasalları içermek için sitospinleri hidrofobik bir kalemle çevrele.
   2. Sitospinleri PBS'de 5 dakika boyunca yeniden sulayın.
   3. Sitospin örneklerini 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehitte sabitleyin, her biri 5 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
   4. Buz gibi % 70 aseton ile 7 dakika permeabilize edin ve tekrar PBS ile her biri 5 dakika üç kez yıkayın.
   5. Actin ve tubulin veya azaltılmış Mitotracker için leke (yeşil renkte gösterilen 2 μg/50 μL Alexa 488 konjuge phalloidin karışımı ile kuluçkaya yatır ve 2 μg/μL Alexa 555 konjuge fare anti-α tubulin veya azaltılmış Mitotracker, kırmızı ile gösterilir) 15 dakika boyunca.
      NOT: Tübulin boyama protokolünü doğrulamak için ayrı bir sitospin içinde fare IgG1 izotip kontrol antikoru kullanın. 4.1.1 ile 4.1.8 arasında açıklanan adımları uygulayın, ancak izotip kontrolleri için.
   6. Karışımı slayttan hafifçe devirerek lekeleri çıkarın. Slaytları DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) ile 5-10 dakika boyunca nuclei lekeleyin.
   7. Sitospinleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, solmaya karşı montaj ortamı ile kapakçık yapın ve görüntülemeden önce oda sıcaklığında gece boyunca karanlıkta saklayın.
   8. Bilimsel bir kamera ile donatılmış geniş alanlı dik mikroskop altında görüntüler elde edin. Slaytları görüntülerken farklı floresan kanallar için tutarlı kamera pozlama sürelerinin ayarlandığından emin olun.
2. Sitospin immün floresan boyama:
   1. İşlem sırasında inkübasyon için kimyasalları içermek için sitospinleri hidrofobik bir kalemle çevrele. Sitospinleri PBS'de 5 dakika boyunca yeniden sulayın.
   2. Sitospin örneklerini 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehitte inkübe ederek sabitleyin, her biri 5 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
   3. 2 dakika boyunca% 0.1 soğuk triton X-100 ile permeabilize edin, pbs ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   4. Daha sonra, Fc blok antikor stoğunun 1:50 seyreltilmesi ile sitospin inkübe ederek 15 dakika boyunca Fc bloğu (birincil fare antikorunun özellikle fare Fc antikorları ile çapraz tepki vermemesini sağlamak için).
   5. Fc bloğunu çıkarmak ve 30 dakika boyunca 3 birincil ilgi antikoru (çeşitli kombinasyonlar için Tablo 1'e bakın) karışımıyla sitospin için% 1 BSA'ya değiştirmek ve kuluçkaya yatırmak için slaytlara bahşiş verin.
      NOT: Son çalışmamızda tartışıldığı gibi karşılık gelen ikincil antikorlara paralel olarak izotip kontrol antikorlarını (4.2.1 ila 4.2.9 adımlarını gerçekleştirerek ve antikorları izotip kontrolleriyle değiştirerek bir karışım fare IgG1 ve sıçan^IgG2bkappa primer antikorları ile kuluçkaya yatırmayı unutmayın) çalıştırın.
   6. PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Sitospinleri uygun şekilde tasarlanmış ikincil antikorların bir karışımıyla kuluçkaya yatırın (ayrıntılar için lütfen Tablo 1'e bakın).
   7. Karışımı slayttan hafifçe devirerek lekeleri çıkarın, çekirdekleri lekelendirmek için 5-10 dakika boyunca DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) ile kuluçkaya yatırın. PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
   8. Solmaya karşı montaj ortamına sahip kapakçık ve görüntülemeden önce gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
   9. Bilimsel bir kamera ile donatılmış geniş alanlı dik mikroskop altında görüntüler elde edin. Slaytları görüntülerken tüm florofor kanalları için tutarlı kamera pozlama sürelerinin ayarlandığından emin olun.
3. Hematoksilin ve eozin (H&E) histolojisi
   1. Tüm gruplar için akciğer kriyo bölümlerinde değiştirilmiş H&E boyama³ gerçekleştirin.
4. Görüntü analizi
   1. Fiji ImageJ açık yazılımındaki (https://imagej.net/Fiji/Downloads) görüntü verilerini (.tiff) işleyin ve analiz edin.
   2. Analiz sekmesi ve Ölçümleri Ayarlaaltında kaydedilecek gerekli parametreleri (Alan, Çevre, Tümleşik Yoğunluk, Şekil tanımlayıcıları, Feret çapı, Döngüsellik, Ekran etiketi) kontrol edin.
   3. Yatırım getirisi yöneticisinikullanarak, "serbest seçimler" aracını kullanarak birleştirilmiş görüntü panelinde yaklaşık 50-200 hücreyi manuel olarak özetleyin. Ctrl+T komutuyla ilgi alanlarını (ROI) kaydedin ve her hücre için kaydedilen ROI'leri tüm florofor kanallarına kopyalayın.
   4. Ardından, tüm floresan kanalların önceden ayarlanmış parametrelerini ölçmek için Ctrl+M tuşlarına basın (örn. 405 nm (mavide DAPI veya ATPβ), 488 nm (actin veya NK1.1 veya ki-67 yeşil), 568 nm (tubulin veya Gr1 veya CD61 kırmızı) ve 633 nm (macenta'da CX3CR1 veya angiostatin)).
   5. Sonuçları, çözümleminizi temsil eden uygun bir adla .csv dosyası olarak kaydedin. sonuçları .csv dosyasından bir elektronik tabloya kopyalayın ve lekeli molekülün floresan yoğunluğunu (SONUÇLAR dosyasından Ham Entegre Yoğunluk sütunu olan) boyama tasarımına göre DAPI veya CD61 FI'ye bölün. Bu oranlar "DAPI veya CD61 normalleştirilmiş FI oranları" olarak terimlendirilir.
   6. Daha sonra, kombine O₃ ve LPS maruziyeti sonrasında hücre boyutundaki herhangi bir değişikliği değerlendirmek için bu normalleştirilmiş oranları, döngüselliği, hücre çevresini ve Feret çapını çizin.
   7. Toplanan verilerin normalliğini kontrol etmek ve boş hipotezi test etmek için uygun istatistiksel yazılımı kullanın (lütfen aşağıdaki istatistiksel analiz bölümüne bakın).
5. İstatistiksel Analiz
   1. Sonuçları SEM ± ortalama olarak ifade edin. Grup başına en az üç fare kullanıldı.
   2. Kemokin veri analizi için, Benjamini ve Hoshberg düzeltmesine göre yanlış keşif oranı için tek yönlü ANOVA p değerlerini ayarlayın.
   3. Görüntü parametrelerini, hücreselliği, Feret çapı, çevreyi, DAPI veya CD61 normalleştirilmiş floresan yoğunluk oranlarını Mann-Whitney U testi (iki grubu karşılaştırmak için) veya Kruskal Wallis testi (birden fazla grubu karşılaştırmak için) ile analiz edin, çünkü bu veriler normalde dağıtılmamıştır.
   4. Görüntüleme deneylerinin geri kalanı için, sonuçları Sidak'ın çoklu karşılaştırmalarının ardından tek yönlü bir varyans analizi kullanarak analiz edin. p-değerleri <0.05 önemli kabul edildi.

Sonuçlar

Kombine O₃ ve LPS maruziyeti 72 saatte sistemik inflamasyona ve kemik iliği mobilizasyona yol açar: Farklı bölmelerdeki hücre sayıları periferik kanda önemli değişiklikler ve kombine O₃ ve LPS maruziyetlerinde uyluk kemiği iliği toplam hücre sayılarında önemli değişiklikler olduğunu ortaya koydu. Kombine O₃ ve LPS maruziyetleri toplam BAL (Şekil 1A) veya LVP ( Şekil

Tartışmalar

Mevcut çalışmada sunulan yöntemler, akciğer iltihabı sırasında birden fazla hücresel olayı incelemek için çoklu bölme analizinin yararlılığını vurgulamaktadır. Bulguları Özetledik Tablo 2. Biz ve birçok laboratuvar, akciğer nötrofillerinin hızlı bir şekilde işe alınmasıyla işaretlenen intranazal LPS aşılamasına verilen murine yanıtı kapsamlı bir şekilde inceledik, bu da 6-24 saat arasında zirve yaptı ve ardından çözünürlük devreye girer. Ve son zamanlarda, al...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock