Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.

Abstract

הריאות מתמודדות ללא הרף עם עלבונות ישירים ועקיפים בצורה של סטרילי (חלקיקים או רעלנים תגובתי) ומצבים דלקתיים זיהומיות (חיידקיות, ויראליות או פטרייתיות). תגובה מארחת מוחצת עלולה לגרום לנשימה נפגעת ופגיעה חריפה בריאות, המאופיינת בגיוס נויטרופילים לריאות כתוצאה מתגובת החיסון, הקרישה ושיפוץ הרקמות של המארח הפתולוגי. שיטות מיקרוסקופיות רגישות כדי לדמיין ולכמת התאמות תאיות ריאות מורין, בתגובה למינון נמוך (0.05 עמודים לדקה) אוזון, מזהם סביבתי רב עוצמה בשילוב עם lipopolysaccharide חיידקי, אגוניסט TLR4, הם חיוניים כדי להבין את המארח דלקתי ומנגנוני תיקון. אנו מתארים ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי מקיף של תאי ריאות ותאי גוף מערכתיים שונים, כלומר נוזל שטיפת הברונכו-מכתשים, זלוף כלי הדם בריאה, קריוסקציות ריאות שמאליות ומח עצם החזה מחלחל. אנו מראים נזק של מקרופאגים מכתשיים, נויטרופילים, רקמת פרמנצ'ימלית ריאות, כמו גם תאי מח עצם בקורלציה עם תגובה חיסונית מושהית (עד 36-72 שעות) המאופיינת על ידי שיפוע כימוקין דיסקרטי בתאים המנותחים. בנוסף, אנו מציגים מטריצה חוץ תאית ריאות ואינטראקציות ציטוסקטליות תאיות (אקטין, טובולין), מיני חמצן מיטוכונדריאליים ומגיבים, פלסמינוגן אנטי-קרישה, אנגיוסטין שבר פפטיד אנטי אנגיוגני שלה, ATP מיטוכונדריאלי קומפלקס V subunits, α β. סמנים פונדקאיים אלה, כאשר בתוספת מבחנים מבוססי תאים במבחנה נאותה וטכניקות הדמיה של בעלי חיים vivo כגון מיקרוסקופיה תוך חיים, יכול לספק מידע חיוני לקראת הבנת תגובת הריאות לסוכנים immunomodulatory הרומן.

Introduction

פגיעה חריפה בריאות (ALI) היא תגובה פתולוגית מכרעת של ריאות לגירויים זיהומיים או מזיקים אחרים אשר מסומן על ידי הפעלה בו זמנית של מערכת חיסונית קרישה, fibrinolytic ו מולד1. נויטרופילים חשים מיד דפוסי נזק מיקרוביאליים, כמו גם תאיים דרך משפחת קולטן דמוי אגרה (TLR)2,3,4. נויטרופילים משחררים ציטוקינים מעוצבים מראש ותכולת גרגירים ציטוטוקסית, אשר לאחר מכן יכול לגרום נזק לרקמות משניות. הנזק מכתש שלאחר מכן הוא נפגם עם מוות תאי משני המוביל לשחרור של מולקולות כגון אדנוזין טריפוספט (ATP)5, ובכך להגדיר במחזור קסמים של dysregulation החיסון.

בעיה בלתי פתורה בהבנת עלי נוגעת לשאלה כיצד הפציעה מתחילה בתוך קרום מכתסם. קומפלקס הובלת האלקטרונים V, F1F0 ATP סינתאז, הוא חלבון מיטוכונדריאלי הידוע להתבטא בכל מקום, על התא (כולל אנדותל, לויקוציטים, אפיתל) קרום פלזמה במהלך דלקת. ציטוסקלטון התא אשר מורכב actin ו tubulin, מטפח צורת תאים רבים ותפקוד אפנון, כמו גם חלבונים מיטוכונדריאליים, בהתאמה. לאחרונה הראינו כי המצור של סינתאז ATP על ידי מולקולה אנדוגנית, אנגיוסטין, משתיק גיוס נויטרופילים, הפעלה lipopolysaccharide (LPS) הנגרמת דלקת ריאות6. לכן, הן ביוכימי (ATP סינתאז) והן מנגנוני החיסון (TLR4) עשויים לווסת את מחסום מכתש במהלך דלקת ריאות.

חשיפה לאוזון (O3), מזהם סביבתי, פוגע בתפקוד הריאות, מגביר את הרגישות לזיהומים ריאתיים, ורמות נמוכות קצרות של חשיפות O3 מגבירות את הסיכון לתמותה אצל אלה עם תנאים קרדיו-ריזפירטוריים בסיסיים7,8,9,10,11,12,13,14. לכן, חשיפה לריכוזים רלוונטייםמבחינה פיזיולוגית של O 3 מספק מודל משמעותי של ALI ללמוד מנגנונים בסיסיים של דלקת7,8. המעבדה שלנו הקימה לאחרונה מודל מורין של Oבמינון נמוך 3 המושרה ALI15. לאחר ביצוע מינון וזמן תגובה לריכוזים נמוכים O3, ראינו כי חשיפה 0.05 עמודים לדקה O3 עבור 2 שעות, גורם לפגיעה ריאות חריפה המסומנת על ידי ריאות ATP סינתאז קומפלקס V subunit β (ATPβ) וביטוי אנגיוסטטין, בדומה לדגם LPS. הדמיית ריאות תוך-וורידית גילתה חוסר ארגון של מיקרופילמנטים מכתש המעידים על נזק לריאות, אבלציה של מינים תגובתיים מחמצת מכתשית (ROS) רמות (המציין ביטול של איתות תאים בסיסי) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (המציין מוות תאי חריף) לאחר 2 h חשיפה 0.05 עמודים לדקה O315 אשר בקורלציה עם ריאה הטרוגנית 18שימור FDG16, גיוס נויטרופילים ושחרור ציטוקינים, בעיקר IL-16 ו SDF-1α. המסר לקחת הביתה מהמחקרים האחרונים שלנו הוא כי O3 מייצר רעילות גבוהה אקספוננציאלית כאשר נחשף בריכוזים מתחת לגבולות המותרים של 0.063 עמודים לדקה מעל 8 שעות (ליום) לחשיפה אנושית. חשוב לציין, אין הבנה ברורה על האם אלה תת קליני O3 חשיפות יכול לווסת מנגנונים בתיווך TLR4 כגון על ידי אנדוטוקסין חיידקי17. לכן, חקרנו מודל חשיפה O3 ו- LPS כפול וראינו את ההתאמות התאיות החיסוניות והלא חיסוניות.

אנו מתארים ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי מקיף של תאי ריאות ותאי גוף מערכתיים שונים, כלומר נוזל שטיפת ברונכו-מכתש (כלומר, BAL) אשר מדגם את החללים מכתשיים, כלי הדם הריאה perfusate (כלומר, LVP) כי דגימות כלי הדם ריאתי ואת interstitium מחיצה מכתשי במקרה של מחסום אנדותל בסכנה, קריוסקציות ריאות שמאל, להסתכל לתוך לויקוציטים parenchymal תושב חסידים שנותרו ברקמת הריאה שטיפת דם היקפי המייצג את הלויקוציטים במחזור ואת מח העצם ועצם הירך perfusates כי מדגם את האתרים הפרוקסימליים והדיסטליים של גיוס תאים hematopoietic במהלך דלקת, בהתאמה.

Protocol

תכנון המחקר אושר על ידי מועצת האתיקה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת ססקצ'ואן ודבק בהנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לשימוש אנושי בבעלי חיים. שישה-שמונה שבועות זכר C57BL / 6J עכברים הושגו. הערה: המתת חסד לכל בעלי חיים המפתחים עייפות חמורה, מצוקה נשימתית או סימנים אחרים של מצוקה חמורה לפני נקודת הסיום המתוכננת.

הערה: הכן את הדברים הבאים: 27-18 G מחט קהה (יהיה תלוי בקוטר קנה הנשימה של העכבר), צינורות PE בגודל מתאים כדי להתאים את המחט קהה (לעשות צינורית PE עבור כל עכבר), קנולה, 2 מספריים חדים, 2 מלקחיים קהים (קטנים), 1 מלקחיים חדים (קטנים), 3 מזרקים 1 מ"ל, צינורות microfuge שכותרתו (עבור BAL, דם, כלי דם ואוסף מח עצם perfusate) ובקבוקונים שכותרתו (עבור קיבוע רקמות), שקיות מדגם / cryovials לאיסוף רקמות, חוט כותנה של הקצב רול (לחתוך ליגטורות בגודל נאות). כל הכימיקלים המשמשים לניסויים מסומנים בטבלת החומרים.

1. חשיפות לאוזון ול-LPS לאינדוקציה של פגיעה בריאה מורין

  1. חשיפה לאוזון
    1. הכן תיבת אינדוקציה מותאמת אישית של O3. מוסיפים הזנת עכברים, בקבוק מים, צעצועי העשרה ומצעים נקיים לפי הסדר ומחקים את סביבת הדיור של העכברים.
      הערה: שלבים אלה יבטיחו כי לעכברים תהיה גישה חופשית למזון ומים כאשר הם שוכנים בתיבת האינדוקציה המותאמת אישית ויסייעו להקל על הלחץ המיותר.
    2. החלף את קליברטור O 3 /גנרטור "ON" (ממוקם לכיוון יציאת הכניסה) כדי לייצב את מנורת UV לפני היד (סביב 15 דקות לפני החשיפות) ולהתחבר עם צג O3 בשורה.
      הערה: צג O3 צריך לקרוא בממוצע 0.05 עמודים לדקה, כפי שנדגם מהשקע בטמפרטורת אוויר קאמרית קבועה (72 ±3 °F) ולחות יחסית (50±15%).
    3. לחשיפות O3, הניחו בעדינות עכברים בתיבת האינדוקציה המותאמת אישית וחשפו את העכברים ללא הרף ל-0.05 עמודים לדקה O3 למשך 2 שעות.
  2. הרדמה וניהול LPS תוך-אנסלי
    1. הכן 10 מ"ג / מ"ל מניות קטמין ו xylazine, בנפרד.
    2. הכינו קוקטייל על ידי ערבוב 20 חלקים של קטמין וחלק אחד של קסילאזין. אם העכבר שוקל X g, להזריק (X/200) מ"ל של קוקטייל קטמין / xylazine לתוך חלל הצפק. עבור עכבר אחד, להכין 1 מ"ל של קוקטייל הכולל 1000 μL של 10 מ"ג / מ"ל קטמין מלאי ו 50 μL של מלאי xylazine. מערבבים היטב על ידי pipeting למעלה ולמטה בצינור microfuge.
      הערה: ניתן להכין את מניות הקטמין והשילאזין שבוע מראש.
    3. הרדמה העכברים תחת אור תוך-פריטוניאלי (IP) קטמין (50 מ"ג/ק"ג)/xylazine (1 מ"ג/ק"ג) לערבב (למשל, עבור עכבר 25 גרם, להזריק 0.125 מ"ל של הקוקטייל).
    4. הכן 1 מ"ג / מ"ל פתרון של LPS, מלוחים, ולמלא 50 μL של הפתרון פיפטה.
    5. החזק את העכבר זקוף עם הגב / הגב בצד על כף היד, מחזיק את האוזניים באותה יד. עכשיו, מקום 50 μL של פתרון LPS18 בעדינות מחוץ נחיריים (כלומר, 25 μL על כל נחיר או 50 μL בנחיר אחד; לא משנה כל עוד ההליך הוא מהיר) ולאפשר לעכברים לשאוף את פתרון LPS.
    6. להחדיר עכברים שליטה עם 50 μL של מלוחים סטריליים.
      זהירות: אין לחרוג יותר מ- 100 μL להטמעה, אשר עלול להיות קטלני. יותר מדי נפח (כלומר, <50 μL) ויש סיכון של תצהיר האף בלבד.
    7. לאחר ניהול LPS, בעדינות להניח את העכברים, או על הבטן שלהם או את הגב שלהם על התל של מצעים עם הראש שלהם זווית מעט כלפי מטה.
      הערה: אוריינטציה זו מאריכה את השמירה על הפתרון בחלל האף19.
    8. בשעה 0, 2, 4, 24, 36 ו 72 שעות לאחר החשיפה, הרדמה את העכברים i.p. עם מנה מלאה של קטמין (200 מ"ג / קילוגרם)/ xylazine (4 מ"ג / קילוגרם) לערבב (כלומר, X /50 מ"ל של הקוקטייל, שבו X הוא משקל העכבר בגרמים או 0.50 מ"ל עבור עכבר 25 גרם).
    9. התבונן בעכבר עד שהוא מאבד את ההכרה ואת הרפלקס הנכון (כלומר, אינו חוזר כאשר הניח בתנוחה סופית). עכשיו, לבדוק את העכבר עבור עומק של הרדמה, על ידי ניטור הנשימה (טיולים בחזה קצבי) ואת קצב הלב, אשר צריך לרדת באופן ניכר, לאחר 1-2 דקות.
    10. לאחר מכן, בדוק אם יש רפלקסים לדוושה, כלומר, צבוט אחת מהספרות האחוריות של הגפיים והתבונן בנסיגה של האיבר, ררפלקס. אם העכבר מגיב, מלמעלה למעלה עם זריקות נוספות של 0.1 מ"ל או יותר, כנדרש.
      הערה: כדי להשיג הרדמה עמוקה, יש לזכור כי זנים מסוימים או עכברים שמנים בדרך כלל יש נפח גדול יותר של הפצה ולכן ניתן בקלות במינון יתר, אם מספיק זמן אם לא מותר הרדמה מלאה (אשר יכול להיות סביב 10 דקות או יותר). לפיכך, זנים מסוימים יכולים להיות עמידים בפני הרדמה ובכך דורשים יותר קופצים. ידע זה נרכש לאחר תצפיות מעשיות רבות וניסיון עם עכברים של זנים וגיל שונים. כמו כמה ניסויים טייס בוצעו גם מיד לאחר חשיפות O3 ו LPS (כלומר, בנקודת זמן 2 שעות), כללנו גם כמה ניתוח מוקדם מאוד של תאי BAL מניסויים אלה כדי להדגיש את ההשפעות המיידיות של החשיפה המשולבת O3ו- LPS.

2. אוסף לדוגמה

  1. מניחים את העכבר על מגש כירורגי. עכשיו, בעדינות לשים משחת עיניים סיכה על שתי העיניים כדי למנוע אובדן נוזלים לחטא את העכבר עם 70% תרסיס אתנול.
    1. לעשות חתכים קטנים דרך קרום העור העליון והתחתון עם מספריים, כדי לחשוף את קנה הנשימה ואת בית החזה.
    2. לעשות חתך ממש מתחת לעצם החזה ולחשוף את הלב.
  2. ניקוב לב
    1. מניחים מחט 25G מחובר מזרק הפריניזציה לתוך החדר הימני ולשאוב דם על ידי ניקוב לב.
      הערה: דם בדרך כלל שואב עם תיקו בוכנה מינימלית, אם הזמן מחשיפת הלב לנקב לב הוא פחות מדקה. לאחר איסוף סביב 0.4-0.5 מ"ל, ייתכן שיהיה צורך לעצור למשך כמה שניות לפני איסוף הדם הנותר. זה נעשה כדי לאפשר ללב לשאוב כל נפח שנותר לתא החדר הימני. עד סוף איסוף הדם, הלב מפסיק לשאוב.
    2. לאסוף את הדם ולאחסן בצינורות microfuge לעיבוד נוסף.
  3. כריתת קנה הנשימה
    1. יש להשתמש בזהירות בפינצטה/מלקחיים קהים כדי לפנות את אזור קנה הנשימה מרקמה מוגזמת. השתמש בידיים כפפה יותר מאשר מכשירים כירורגיים כדי למנוע דימום. אם הרבה דם נוטף, קיים סיכון של זיהום דגימות BAL. השתמש ספוגיות כותנה, במידת הצורך, אם כי לא מועדף. קימפיפס הם חלופות טובות יותר.
    2. עכשיו, תחתוך דרך בית החזה כדי לחשוף את הריאות. שוב, להיות זהיר לא לחתוך את עצם החזה ואת העורקים הבין צלעיים או את העורקים העולים; לעשות חתכים קטנים יותר תוך התקדמות דרך כלוב הצלעות)
    3. מעבירים קשירה מכותנה מתחת לקליפת קנה הנשימה ומשאירים ככאלה לעת עתה.
    4. לצלוף את קנה הנשימה במיקום מתאים בחלק 1/3 הדיסטלי, הצבעהלכיוון הריאות, כדי לאפשר גישה קנולה קנה הנשימה 28 G.
    5. הכנס קנולה 28 G PE (אורך מינימלי של 3-5 מ"מ וסוף דיסטלי קצוץ כדי להקל על החדרה) לתוך קנה הנשימה. היזהרו מקצה קנה הנשימה לפני bifurcation ולאחר מכן למשוך על מ"מ בחזרה, כדי למנוע דגימה רק אונה אחת.
    6. בחוזקה, לקשור קשירה כותנה להחזיק את הצינורית במקום. אל תמוטט את הצינורית.
  4. שטיפת ברונכו-מכתש (BAL)
    1. מלא 0.5 מ"ל של PBS במזרק 1 מ"ל.
    2. עכשיו בהדרגה להזריק 0.5 מ"ל של PBS לתוך הצינורית בעזרת מזרק 1 מ"ל.
    3. לאחר הזרקת PBS, לשאוף את המזרק כל עוד זה לא להתנגד היניקה.
      הערה: אם יש התנגדות בעת שאיפת נוזל BAL החוצה, זה מצביע על התמוטטות של רקמת מכתח או הסימפונות. במקרה זה, למשוך בחזרה את הצינורית על ידי זעום לנתק את הצינורית טופס הקירות של הרקמה.
    4. לאסוף את הנוזל שאיפה בצינור microfuge שכותרתו ומניחים על קרח.
    5. בצע שני שטיפת עוד באופן דומה איסוף באותו בקבוקון (כלומר, סך של 0.5 X 3 = 1.5 שטיפת מ"ל).
    6. למדוד את הנפח של נוזל BAL שנאסף. התאוששות Lavage צריך להיות קרוב ל 90%.
  5. זלוף כלי דם ריאה (LVP)
    1. חותכים את העורקים החזיים היורדים במיקום בין חצאי בית החזה והבטן, כדי למנוע כל גיבוי של perfusate בריאות תוך זלוף דרך החדר הימני.
    2. כתם את החלל ליד קצה אב העורקים לחתוך, ללא דם.
    3. לאחר מכן, לעיין בריאות עם 0.5 מ"ל של תמיסת מלח הפריניזציה זמנית החדר מוזרק דרך החדר הימני.
    4. לאסוף את כלי הדם לחלחל מן החלל בקצה החתך של אב העורקים היורד, בצינור microfuge, להציב על קרח ולמדוד את נפחו.
    5. Ligate הסימפונות הימנית proximal שלה הסתעפות מקנה הנשימה (עם חוט כותנה).
  6. במקום קיבעון ריאות שמאל
    1. חבר מזרק 1 מ"ל לקנולה קנה הנשימה, וזה מספיק זמן כדי להכניס דרך חתך קנה הנשימה הקודם.
    2. משוך בחזרה אוויר במזרק עד 0.6 מ"ל סימן.
    3. לאחר מכן, למלא את המזרק הנותר (עד הסוף) עם 2% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר. ודא כי הבוכנה מוכנה לצוץ החוצה מבלי למצוץ בחזרה כל אוויר מן הצינורית.
    4. עכשיו, להדביק את המזרק עם סרט ויסקי, למיכל זקוף, נמדד עד 20 ס"מ גובה.
    5. בעדינות, למשוך את הוכנה החוצה כדי לאפשר את הזרימה מתקנת לכיוון קנה הנשימה. במקרה שיש כמה בועות אוויר בקנולה, מניחים בעדינות את הבוכנה על גבי המזרק והנוזל יתחיל לזרום לאחר מספר שניות.
    6. תן לריאה השמאלית לנפח לקיבולת הכוללת שלה באתרו, במשך 5 דקות, מגובה של 20 ס"מ ויוצרים עמוד מים 20 ס"מ.
    7. במהלך הליך זה, הקפד להגן על אונות הריאה הימנית מפני יצירת קשר עם paraformaldehyde כמו זה ישפיע על מבחני במורד הזרם.
    8. מניחים רקמות מעבדה מקופלות לספוג כל paraformaldehyde שעלול לבוא במגע עם אונות הריאה הימנית.
      התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד. לכן, אין לשאוף או ליצור קשר עם חלקים חשופים כלשהם בגוף. יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול.
    9. במהלך החדרת paraformaldehyde, לחטא את הבטן.
    10. חותכים את אונות הריאה הימנית מקנה הנשימה ומוודאים להסיר כל חוט ומיד לשים את האונות ב cryovial שכותרתו ושחרר אותו חנקן נוזלי לניתוח ציטוקינים מולקולריים / ביוכימיים במורד הזרם / RT-PCR / ניתוח כתם מערבי של הומופובי ריאה.
    11. בזהירות לקצץ את הריאה השמאלית עבור כל רקמת חיבור או קרום pleural ולטבול אותו 2% paraformaldehyde עבור 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    12. הטבע את הריאה הקבועה בפרפין לפי פרוטוקול הטבעה סטנדרטי.
      זהירות: אין לחמם יתר על ה-כך את דגימות הריאות.
    13. חותכים את חלק הבטן ומפרקים אותו מעצם האגן (הירך).
    14. מפרידים את עצמות עצם הירך השמאלית והימנית מחלק האגן, בצלחת פטרי ממולאת מלוחים שנשמרה על קרח.
  7. אוסף שאיפת מח עצם סטרנל ועצם הירך
    1. לנקות את הרקמה והשרירים את העצמות באמצעות רקמות מעבדה.
    2. אוספים את צלעות הגחון ועצם החזה לתוך צלחת פטרי ממולאת מלוחים שנשמרו על קרח.
    3. חותכים את קצות דיסטלי proximal של עצמות עצם החזה ועצם הירך.
    4. לעיין בעצמות 4 פעמים עם 0.5 מ"ל של מלוחים, באמצעות מחטים מצויד היטב (24 עד 28 G) על 1 מזרקים מ"ל, ולאסוף את השברים מכל עצם לתוך צינורות שכותרתו מצויד מסננים והניח על קרח.
      הערה: מד המחט משתנה בין גודל החיה. לאחר הסמקה, עצם הירך צריכה להופיע שקופה.
    5. לאחר איסוף הדגימות, יש לארוז את העכבר בשקית ניילון ולהכניס למקפיא פגר של בעלי חיים לסילוק נאות, בהתאם להנחיות מתקן בעלי החיים המוסדי.

3. עיבוד לדוגמה

  1. ספירת לויקוציטים כוללת (TLC) ודיפרנציאלית (DLC)
    1. צנטריפוגה דם היקפי, BAL, כלי דם ריאות perfusate ומח עצם (עצם החזה ועצם הירך) דגימות במשך 10 דקות ב 500 גרם.
    2. לאסוף את supernatants, פלאש להקפיא אותם ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.
    3. לשקם את התאים במינימום של 200 μL של PBS.
    4. בצע TLC על ידי ספירת BAL, דם, כלי דם ריאות perfusate ותאי מח עצם על המוציטרומטר.
    5. כתם עוד 9 μL aliquot של BAL עם 1 μL תערובת של קלצין ירוק ואדום אתידיום homodimer-1 לכמת תאים חיים (ירוקים) עקב פעילות אסטראז תאיים וכל תאי BAL פגום (באדום) עקב אובדן שלמות קרום פלזמה.
    6. הוסף 2% חומצה אצטית ליס RBCs, ביחס 1:10 עבור TLC בדם ו 1:2 יחס עבור כלי דם ריאה TLC.
      התראה: התאם את ריכוזי התאים על ידי דילול ב- PBS אם הריכוז הוא יותר מ 1x106 תאים ל- mL (חשוב מאוד עבור דגימות מח העצם).
    7. צנטריפוגה התאים להכין ציטוספין על שקופיות וכתמים כפי שמוסבר להלן עבור DLCs. לספור מינימום של 100 תאים עבור ספירת תאים לויקוציטים דיפרנציאלי (DLCs).
      הערה: בדרך כלל, ניתן להכין שני ציטוספין בשקופית אחת. ואחרי 10-15 דקות של ייבוש אוויר, להמשיך עם צעד מכתים.
    8. לפצל את BAL שנאספו משלושה עכברים טייס לכל קבוצה לשני ציטוספין כל כתם עבור actin / tubulin ומיטוכונדריה עם זרחון חמצוני פעיל (מיטוסטרקר מופחת). השתמש BAL משלושה עכברים נוספים לפצל לשני ציטוספין כל אחד, עבור NK1.1/Gr1/CX3CR1 ו ATPβ / Ki-67 / CD61 / אנגיוסטין מוכתם שקופיות. לפצל את BAL משלושה עכברים נוספים לשני ציטוספין כל אחד כדי כתם עבור ATPα / Ly6G ו CX3CR1 / סיגלק-F.
  2. שטיפת ברונכולבולר (BAL) וכלי דם ריאות Perfusate (LVP) כימות החלבון הכולל
    1. על מנת לכמת O3 ו LPS המושרה הפרעות של מחסום כלי הדם או הלחץ האונקוטי היחסי בשני תאי הריאות (כלומר, מחיצה מכתשית (ביניים) וכלי דם ריאות perfusate (כלי דם) תאים), למדוד את תכולת החלבון הכוללת בנוזלים שנאספו.
    2. לנתח את שברי supernatant מופשר עבור ריכוז החלבון הכולל שלהם באמצעות בדיקת צבע עמידים בדטרגנט סטנדרטי.
    3. שטיפת ברונכולבולר (BAL) וכלי דם ריאה perfusate (LVP) ניתוח כימוקין
      1. לאחר מכן, לנתח את הכימוקינים ב BAL וכלי דם ריאות perfusate (LVP) supernatants באמצעות אימונואסיה מבוססת חרוזים מגנטיים 33-plex. זה יודיע על הכיווניות של דרכי הנשימה / interstitium לעומת שיפוע כימוקין כלי הדם הוקמה לאחר חשיפות משולבות.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory חלבון-3 בטא), RANTES (מוסדר על ההפעלה, תא T רגיל מבוטא ומופרש (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (גורם נגזר תא סטרומה 1), TARC (תימוס והפעלה מוסדר כימוקין (TARC)), TECK (כימוקין מבוטא תימוס (CCL25)) ו TNFα (אלפא גורם נמק הגידול).

4. כתמי ציטוספין והיסטולוגיה של הריאות

  1. כתמים ביוכימיים ציטוספיים
    1. להקיף את cytospins עם עט הידרופובי להכיל את הכימיקלים עבור דגירה במהלך ההליך.
    2. מחזרים את הציטופינים ב-PBS למשך 5 דקות.
    3. לתקן את דגימות ציטוספין ב 2% paraformaldehyde במשך 10 דקות, לשטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    4. לחלחל עם קר כקרח 70% אצטון במשך 7 דקות ושוב לשטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    5. כתם על אקטין ו tubulin או מופחת Mitotracker (דגירה עם תערובת של 2 מיקרוגרם / 50 μL של אלקסה 488 פאלודין מצומד המוצג בירוק, ו 2 מיקרוגרם / μL של אלקסה 555 עכבר מצומד נגד α טובולין או Mitotracker מופחת מוצג באדום, בהתאמה) במשך 15 דקות.
      הערה: השתמש בעכבר IgG1 נוגדן בקרת isotype, ב cytospin נפרד, כדי לאמת את פרוטוקול הכתמת טובולין. בצע את אותם שלבים כפי שהוסבר מ- 4.1.1 עד 4.1.8, אך עבור פקדי isotype.
    6. הסר את הכתמים על-ידי הטיית התערובת בעדינות מהשקופית. דגירה שקופיות עם DAPI (4′,6-diamidino-2-פנילינדול) במשך 5-10 דקות כדי להכתים גרעינים.
    7. לשטוף את cytospins 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד, coverslip עם מדיה הרכבה נגד עמעום ולאחסן לילה בחושך בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה.
    8. לרכוש תמונות תחת מיקרוסקופ זקוף שדה רחב מצויד במצלמה מדעית. ודאו זמני חשיפה עקביים למצלמה שהוגדרו לערוצי הפלואורסצנט השונים בשעת החלקות דימות.
  2. כתם פלואורסצנטי חיסוני ציטוספין:
    1. להקיף את cytospins עם עט הידרופובי להכיל את הכימיקלים עבור דגירה במהלך ההליך. מחזרים את הציטופינים ב-PBS למשך 5 דקות.
    2. לתקן את דגימות ציטוספין על ידי דגירה ב 2% paraformaldehyde במשך 10 דקות, לשטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    3. לחלחל עם 0.1% קר טריטון X-100 במשך 2 דקות, לשטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    4. לאחר מכן, Fc לחסום במשך 15 דקות על ידי דגירה cytospin עם 1:50 דילול של מלאי נוגדנים בלוק Fc (כדי להבטיח כי נוגדן העכבר העיקרי אינו להצליב לא במיוחד עם העכבר נוגדנים Fc).
    5. להטות את השקופיות כדי להסיר את בלוק Fc ולשנות 1% BSA עבור הדגירה cytospin עם שילוב של 3 נוגדנים עיקריים של עניין (עיין בטבלה 1 עבור שילובים שונים) במשך 30 דקות.
      הערה: הקפד להפעיל נוגדני בקרת isotype (דגירה עם עכבר תערובת IgG1 וחולדה IgG2b קאפה נוגדנים ראשוניים על ידי ביצוע שלבים 4.2.1 כדי 4.2.9 והחלפת הנוגדנים עם פקדי isotype) במקביל נוגדנים משניים המקביל כפי שנדון במחקר האחרון שלנו20.
    6. לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. דגירה cytospins עם תערובת של נוגדנים משניים שתוכננו כראוי (אנא עיין בטבלה 1 לפרטים).
    7. הסר את הכתמים על ידי הטיית התערובת בעדינות מהשקופית, דגירה עם DAPI (4′,6-diamidino-2-פנילינדול) במשך 5-10 דקות כדי להכתים גרעינים. לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    8. כיסוי עם מדיה הרכבה נגד עמעום ולאחסן לילה בחושך בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה.
    9. לרכוש תמונות תחת מיקרוסקופ זקוף שדה רחב מצויד במצלמה מדעית. ודאו זמני חשיפה עקביים למצלמה שהוגדרו לכל ערוצי הפלואורופור בשעת החלקות דימות.
  3. המטוקסילין והיסטולוגיה של אאוסין (H&E)
    1. בצע כתמי H&Eמותאמים 3 על ניתוחי קריו ריאות לכל הקבוצות.
  4. ניתוח תמונה
    1. לעבד ולנתח קבצי נתוני תמונה (.tiff) בפיג'י ImageJ לפתוח תוכנה (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. בדוק את הפרמטרים הנדרשים (שטח, היקף, דחיסות משולבת, מתארי צורות, קוטר Feret, מעגליות, תווית תצוגה) שיירשמו תחת הכרטיסיה ניתוח והגדר מידות.
    3. באמצעות מנהל ההחזר על ההשקעה, מתאר ידנית סביב 50-200 תאים בחלונית התמונה הממוזגת באמצעות הכלי "בחירות ביד חופשית". שמור את אזורי העניין (ROI) באמצעות הפקודה Ctrl+T והעתק את ההחזרים על ההשקעה שנשמרו עבור כל תא בכל ערוצי הפלואורופור.
    4. לאחר מכן הקש Ctrl+M כדי למדוד את הפרמטרים המוגדרים מראש עבור כל ערוצי הפלואורסצנט (למשל, 405 ננומטר (DAPI או ATPβ בכחול), 488 ננומטר (אקטין או NK1.1 או Ki-67 בירוק), 568 ננומטר (טובולין או Gr1 או CD61 באדום) ו 633 ננומטר (CX3CR1 או אנגיוסטין במגנטה)).
    5. שמור את הקובץ 'תוצאות כקובץ .csv' תחת שם מתאים המייצג את הניתוח שלך. העתק את התוצאות מקובץ .csv לגיליון אלקטרוני וחלק את עוצמת הפלואורסצנטיות (FI) (שהיא העמודה Raw Integrated Density מקובץ התוצאות) של המולקולה המוכתמת על-ידי זו של DAPI או CD61 FI, בהתאם לעיצוב הכתמים. יחסים אלה נקראים "יחסי DAPI או CD61 FI מנורמלים".
    6. לאחר מכן, התווה את היחסים המנורמלים האלה, המעגליות, היקף התא וקוטר Feret, כדי להעריך כל שינוי בגודל התא לאחר החשיפה המשולבת O3 ו- LPS.
    7. השתמש בתוכנה סטטיסטית מתאימה כדי לבדוק את הנורמליות של הנתונים שנאספו ולבדוק את השערת האפס (עיין בסעיף הניתוח הסטטיסטי להלן).
  5. ניתוח סטטיסטי
    1. תוצאות אקספרס כ- SEM ± ממוצע. לפחות שלושה עכברים שימשו לכל קבוצה.
    2. לניתוח נתוני כימוקין, התאם ערכי P חד-כיווניים של ANOVA עבור שיעור גילוי כוזב בהתאם לתיקון של בנימיני והושברג.
    3. לנתח פרמטרים תמונה, תאיות, קוטר Feret, היקפי, DAPI או CD61 מנורמל יחס עוצמת הפלואורסצנטיות על ידי מבחן מאן ויטני U (להשוואת שתי קבוצות) או Kruskal וואליס מבחן (להשוואת קבוצות מרובות) כמו נתונים אלה לא הופצו בדרך כלל.
    4. במשך שאר ניסויי ההדמיה, נתח את התוצאות באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות ואחריו ההשוואות המרובות של סידק. ערכי p <0.05 נחשבו משמעותיים.

תוצאות

חשיפה משולבת O3 ו- LPS מובילה לדלקת מערכתית וגיוס מח עצם במהירות של 72 שעות: ספירת תאים בתאים שונים חשפה שינויים משמעותיים בדם ההיקפי וספירת תאי מח העצם בסך הכל על חשיפות משולבות של O3 ו- LPS. למרות שחשיפות משולבות של O3 ו- LPS לא גורם לשינויים בספיר...

Discussion

השיטות המוצגות במחקר הנוכחי מדגישות את התועלת של ניתוח תאים מרובים כדי לחקור אירועים תאיים מרובים במהלך דלקת ריאות. סיכמנו את הממצאים בטבלה 2. אנחנו ומעבדות רבות חקרנו בהרחבה את התגובה המורינית להטמעת LPS תוך-ענפית, המאופיינת בגיוס מהיר של נויטרופילים לריאות, אשר מגיע לשיאו בין 6-24 ...

Disclosures

המחברים אין ניגודי עניינים או גילויים לעשות.

Acknowledgements

המחקר שנערך ממומן על ידי מענק NSERC של הנשיא, כמו גם קרנות הזנק מהמרכז הקנדי סילביה פדורוך לחדשנות גרעינית. המרכז הקנדי לחדשנות גרעינית ע"ש סילביה פדורק ממומן על ידי חדשנות ססקצ'ואן. הדמיית פלואורסצנטיות בוצעה במרכז ההדמיה WCVM, הממומן על ידי NSERC. ג'סיקה ברוקוס (סטודנטית לתואר שני) ומנטורט קאור (סטודנטית לתואר שני) מומנו על ידי קרנות הסטארט-אפ מהמרכז הקנדי לחדשנות גרעינית ע"ש סילביה פדורק.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
33-plex Bioplex chemokine panelBiorad12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectivesLeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11002
Alexa 488 conjugated phalloidinInvitrogenA12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)InvitrogenA21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)InvitrogenA11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)InvitrogenA21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL/6 J MiceJackson Laboratories64
Confocal laser scanning microscopeLeicaLeica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)InvitrogenD1306aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscopeOlympusOlympus IX83
Ketamine (Narketan)Vetoquinol100 mg/mlDilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kitInvitrogenL3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)Invitrogen459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)InvitrogenA-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)Invitrogen16-5941-82
Pierce 660 nm protein assayThermoscientific22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgGAbcamab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)Invitrogen14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappaInvitrogen14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)Invitrogen16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)Invitrogen53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)BD Pharmingen553142
Reduced mitotracker orangeInvitrogenM7511
Xylazine (Rompun)Bayer20 mg/mlDilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169LPSF1F0 ATP VIL 16

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved