Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS

Résumé

Les souris exposées à l’ozone et à l’endotoxine bactérienne combinées montrent une mort cellulaire largement répandue, y compris celle des neutrophiles. Nous avons observé des adaptations cellulaires telles que la rupture du lamellipodia cytosquelettique, l’expression cellulaire accrue de la sous-unité complexe de synthase de V ATP β et l’angiostatin dans le lavage broncho-alvéolaire, la suppression de l’immuno-réaction de poumon et le recrutement retardé de neutrophile.

Résumé

Les poumons sont continuellement confrontés à des insultes directes et indirectes sous la forme de conditions inflammatoires stériles (particules ou toxines réactives) et infectieuses (bactériennes, virales ou fongiques). Une réponse écrasante de centre serveur peut avoir comme conséquence la respiration compromise et la lésion pulmonaire aiguë, qui est caractérisée par le recrutement de neutrophile de poumon en raison de la réponse patho-logique de retouche immunisée, coagulative et de tissu de centre serveur. Des méthodes microscopiques sensibles pour visualiser et quantifier les adaptations cellulaires pulmonaires murines, en réponse à une faible dose (0,05 ppm) d’ozone, un puissant polluant environnemental en combinaison avec le lipopolysaccharide bactérien, un agoniste TLR4, sont cruciales pour comprendre les mécanismes inflammatoires et de réparation de l’hôte. Nous décrivons une analyse microscopique fluorescente complète de divers compartiments de poumon et systémiques de corps, à savoir le fluide broncho-alvéolaire de lavage, le perfusat vasculaire de poumon, les cryosections gauches de poumon, et le perfusate sternal de moelle. Nous montrons des dommages des macrophages alvéolaires, des neutrophiles, du tissu parenchymal de poumon, aussi bien que des cellules de moelle en corrélation avec une réponse immunitaire retardée (jusqu’à 36-72 h) qui est marquée par des gradients discrets de chemokine dans les compartiments analysés. En outre, nous présentons la matrice extracellulaire de poumon et les interactions cytosquelettiques cellulaires (actine, tubuline), les espèces mitochondriques et réactives de l’oxygène, le plasminogen anti-coagulatif, son angiostatin anti-angiogénique de fragment de peptide, les sous-unités Mitochondriques de V de complexe de synthase d’ATP, α et β. Ces marqueurs de substitution, lorsqu’ils sont complétés par des essais cellulaires in vitro adéquats et des techniques d’imagerie animale in vivo telles que la microscopie intravitale, peuvent fournir des informations vitales vers la compréhension de la réponse pulmonaire à de nouveaux agents immunomodulateurs.

Introduction

La lésion pulmonaire aiguë (LAI) est une réponse pathologique cruciale des poumons aux stimuli infectieux ou autres stimuli nocifs qui est marquée par l’activation simultanée des systèmes immunitaires coagulatif, fibrinolytique et inné¹. Les neutrophiles détectent rapidement les modèles de dommages microbiens et intracellulaires à travers la famille des récepteurs toll-like (TLR)^2,3,4. Les neutrophiles libèrent des cytokines préformées et le contenu cytotoxique de granule, qui peuvent alors causer des dommages collatéraux de tissu. Les dommages alvéolaires qui s’ensuivent sont gâchés par la mort cellulaire secondaire conduisant à la libération de molécules telles que l’adénosine triphosphate (ATP)⁵, mettant ainsi dans un cercle vicieux d’immuno-dysrégulation.

Un problème non résolu dans la compréhension d’ALI se rapporte à la question de savoir comment les dommages sont initiés dans la membrane alvéolaire. Le complexe de transport d’électrons V, F1F0 ATP synthase, est une protéine mitochondriale connue pour être exprimée de manière omniprésente, sur la membrane plasmique cellulaire (y compris endothéliale, leucocytaire, épithéliale) pendant l’inflammation. Le cytosquelette cellulaire qui est composé d’actine et de tubuline, héberge de nombreuses formes cellulaires et fonction modulant ainsi que des protéines mitochondriales, respectivement. Nous avons récemment montré que le blocage de l’ATP synthase par une molécule endogène, l’angiostatine, réduit au silence le recrutement des neutrophiles, l’activation et le lipopolysaccharide (LPS) induit une inflammation pulmonaire^6. Ainsi, les mécanismes biochimiques (SYNTHASE D’ATP) et immunisés (TLR4) pourraient régler la barrière alvéolaire pendant l’inflammation de poumon.

L’exposition à l’ozone (O_3),un polluant environnemental, altère la fonction pulmonaire, augmente la susceptibilité aux infections pulmonaires, et de faibles niveaux d’exposition à L’O3 augmentent le risque de mortalité chez les personnes atteintes d’affections cardiorespiratoires sous-jacentes^{7,8,9,10,11,12,13,14.} Ainsi, l’exposition à des concentrations physiologiquement pertinentes d’O3 fournit un modèle significatif d’ALI pour étudier les mécanismes fondamentaux de l’inflammation^7,8. Notre laboratoire a récemment établi un modèle murin de faible dose_O3 induite ALI^15. Après avoir effectué une dose et une réponse temporelle à de faibles concentrations_d’O3, nous avons observé que l’exposition à 0,05 ppm_O3 pendant 2 h, induit une lésion pulmonaire aiguë marquée par l’ATP synthase du poumon complexe V sous-unité β (ATPβ) et l’expression de l’angiostatine, similaire au modèle LPS. L’imagerie pulmonaire intravitale a révélé une désorganisation des microfilaments alvéolaires d’actine indiquant des lésions pulmonaires, et l’ablation des niveaux alvéolaires des espèces réactives septales de l’oxygène (ROS) (indiquant l’abrogation de la signalisation cellulaire de base) et du potentiel mitochondrique membranaire (indiquant une mort cellulaire aiguë) après une exposition de 2 h à 0,05 ppm O₃¹⁵ qui était corrélée avec un poumon hétérogène ¹⁸rétention FDG^16,le recrutement des neutrophiles et la libération de cytokines, plus particulièrement IL-16 et SDF-1α. Le message à retenir de nos études récentes est que l’O₃ produit une toxicité exponentiellement élevée lorsqu’il est exposé à des concentrations inférieures aux limites autorisées de 0,063 ppm sur 8 h (par jour) pour l’exposition humaine. Il est important de ne pas comprendre clairement si ces expositions subcliniques à_O3 peuvent moduler les mécanismes médiés par TLR4 tels que l’endotoxine bactérienne^17. Ainsi, nous avons étudié un modèle d’exposition_o3 et LPS à double succès et avons observé les adaptations cellulaires immunitaires et non immunitaires.

Nous décrivons une analyse microscopique fluorescente complète de divers compartiments pulmonaires et systémiques du corps, à savoir le liquide de lavage broncho-alvéolaire (c.-à-d., BAL) qui échantillonne les espaces alvéolaires, le perfusat vasculaire pulmonaire (c.-à-d., LVP) qui échantillonne la vascularisation pulmonaire et l’interstitium septal alvéolaire en cas de barrière endothéliale compromise, cryosections pulmonaires gauches, pour examiner les leucocytes parenchymateux et adhérents résidents laissés dans le tissu pulmonaire lavage , le sang périphérique qui représente les leucocytes circulants et les perfusats sternaux et fémurs qui échantillonnent les sites proximaux et distaux de la mobilisation des cellules hématopoïétiques pendant l’inflammation, respectivement.

Protocole

La conception de l’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche sur les animaux de l’Université de la Saskatchewan et a respecté les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux pour l’utilisation sans cruauté des animaux. Des souris masculines C57BL/6J de six-huit semaines ont été obtenues. NOTA : Euthanasier tout animal qui développe une léthargie sévère, une détresse respiratoire ou d’autres signes de détresse grave avant le point final prévu.

NOTA : Préparez ce qui suit : 27-18 G émoussés à l’aiguille (dépendra du diamètre trachéal de la souris), tubes en PE de taille appropriée pour s’adapter à l’aiguille émoussée (faire une canule pe pour chaque souris), canule, 2 ciseaux tranchants, 2 pinces émoussées (petites), 1 pince tranchante (petite), seringues de 3 1 mL, tubes de microfuges marqués (pour la collecte de BAL, de sang, de perfusat vasculaire et de moelle osseuse) et flacons étiquetés (pour la fixation des tissus), sacs d’échantillons/cryovials pour la collecte des tissus, rouleau de fil de coton de boucher (coupé en ligatures de taille adéquate). Tous les produits chimiques utilisés pour les expériences sont indiqués dans la table des matériaux.

1. Expositions à l’ozone et au LPS pour l’induction d’une lésion pulmonaire murine

1. Exposition à l’ozone
   1. Préparez une boîte d’induction O₃ personnalisée. Ajoutez de l’alimentation pour souris, une bouteille d’eau, des jouets d’enrichissement et une literie propre dans l’ordre et imitez l’environnement de logement des souris.
      REMARQUE: Ces étapes garantiront que les souris ont un accès gratuit à la nourriture et à l’eau lorsqu’elles sont logées dans la boîte à induction personnalisée et aideront à atténuer le stress excessif.
   2. Allumez l’étalonneur/générateur O₃ « ON » (placé vers le port d’entrée) pour stabiliser la lampe UV avant la main (environ 15 min avant les expositions) et connectez-vous avec le moniteur O₃ en ligne.
      NOTA : Le moniteur O₃ doit indiquer une moyenne de 0,05 ppm, tel qu’échantillonné à la sortie à température de l’air de la chambre (72 ±3 °F) et humidité relative (50 ±15 %).
   3. Pour les expositions à_l’O3, placez délicatement les souris dans la boîte à induction personnalisée et exposez continuellement les souris à 0,05 ppm_O3 pendant 2 h.
2. Anesthésie et administration intranasale de LPS
   1. Préparer séparément des stocks de 10 mg/mL pour la kétamine et la xylazine.
   2. Préparez un cocktail en mélangeant 20 parties de kétamine et 1 partie de xylazine. Si la souris pèse X g, injecter (X/200) mL de cocktail kétamine/xylazine dans la cavité péritonéale. Pour une souris, préparer 1 mL de cocktail comprenant 1000 μL du stock de kétamine à 10 mg/mL et 50 μL du bouillon de xylazine. Bien mélanger en pipetant de haut en bas dans un tube de microfuge.
      REMARQUE: Les stocks de kétamine et de xylazine peuvent être préparés une semaine à l’avance.
   3. Anesthésier les souris sous un léger mélange intrapéritonéal (IP) kétamine (50 mg/kg)/xylazine (1 mg/kg) (p. ex., pour une souris de 25 g, injecter 0,125 mL du cocktail).
   4. Préparer une solution à 1 mg/mL de LPS, dans une solution saline, et remplir 50 μL de la solution dans une pipette.
   5. Tenez la souris debout avec son dos / côté dorsal sur la paume, tenant les oreilles avec la même main. Maintenant, placez 50 μL de la solution LPS¹⁸ doucement à l’extérieur des narines (c.-à-d. 25 μL sur chaque narine ou 50 μL sur une narine; peu importe tant que la procédure est rapide) et laissez les souris inhaler la solution LPS.
   6. Instiller des souris témoins avec 50 μL de solution saline stérile.
      Attention: Ne pas dépasser plus de 100 μL pour l’instillation, qui pourrait être fatale. Trop peu de volume (c.-à-d. <50 μL) et il y a un risque de dépôt nasal seulement.
   7. Après l’administration de LPS, posez doucement les souris, soit sur leur ventre ou leur dos sur le monticule de litière avec leur tête inclinée légèrement vers le bas.
      NOTE : Cette orientation prolonge la rétention de la solution dans la cavité nasale^19.
   8. À 0, 2, 4, 24, 36 et 72 h après l’exposition, anesthésier les souris i.p. avec une dose complète de mélange de kétamine (200 mg/kg)/xylazine (4 mg/kg) (c.-à-d. X/50 mL du cocktail, où X est le poids de la souris en grammes ou 0,50 mL pour une souris de 25 g).
   9. Observez la souris jusqu’à ce qu’elle perde conscience et le bon réflexe (c.-à-d. qu’elle ne se retourne pas lorsqu’elle est couchée en décubitus dorsal). Maintenant, vérifiez la souris pour la profondeur de l’anesthésie, en surveillant la respiration (excursions thoraciques rythmiques) et la fréquence cardiaque, qui devrait tomber sensiblement, après 1-2 minutes.
   10. Ensuite, vérifiez les réflexes de pédale, c’est-à-dire pincez l’un ou l’autre des doigts du membre postérieur et observez la rétraction du membre, comme un réflexe. Si la souris répond, rechargez avec des injections supplémentaires de 0,1 mL ou plus, au besoin.
       REMARQUE: Pour obtenir une anesthésie profonde, gardez à l’esprit que certaines souches ou souris obèses ont généralement un plus grand volume de distribution et peuvent donc être facilement surdosées, si suffisamment de temps si elles ne sont pas autorisées pour une anesthésie complète (qui peut être d’environ 10 minutes ou plus). En conséquence, certaines souches peuvent être résistantes à l’anesthésie et nécessitent donc plus de recharges. Ces connaissances sont acquises après de nombreuses observations pratiques et expériences avec des souris de différentes souches et de différents âges. Comme quelques expériences pilotes ont également été réalisées immédiatement après les expositions à_O3 et à LPS (c.-à-d. au point de temps de 2 h), nous avons également inclus une analyse très précoce des cellules BAL de ces expériences pour mettre en évidence les effets immédiats de l’exposition combinée à O₃^{et À LPS.}

2. Prélèvement d’échantillons

1. Placez la souris sur le plateau chirurgical. Maintenant, mettez doucement une pommade lubrification sur les deux yeux pour éviter la perte de liquide et désinfectez la souris avec un spray éthanol à 70%.
   1. Faites de petites coupures à travers les membranes supérieures et inférieures de la peau avec des ciseaux, pour exposer la trachée et le thorax.
   2. Faites une coupe juste en dessous du sternum et exposez le cœur.
2. Ponction cardiaque
   1. Placez une aiguille 25G attachée à une seringue héparinisée dans le ventricule droit et prélevez du sang par ponction cardiaque.
      REMARQUE: Le sang tire généralement avec un tirage minimal du piston, si le temps entre l’exposition du cœur à une ponction cardiaque est de moins d’une minute. Après avoir recueilli environ 0,4 à 0,5 mL, il peut être nécessaire de faire une pause de quelques secondes avant de recueillir le sang restant. Ceci est fait pour laisser le cœur pomper tout volume restant dans la chambre ventriculaire droite. À la fin de la collecte de sang, le cœur s’arrête pour pomper.
   2. Recueillir le sang et stocker dans des tubes de microfuges pour un traitement ultérieur.
3. Trachéotomie
   1. Utilisez soigneusement une pince à épiler/pince émoussé pour dégager la région trachéale du tissu qui se délite. Utilisez les mains gantées plus que les instruments chirurgicaux pour éviter les saignements. Si beaucoup de sang suinte, il y a un risque de contamination des échantillons de BAL. Utilisez des cotons-tiges, si nécessaire, mais pas préféré. Les kimwipes sont de meilleures alternatives.
   2. Maintenant, coupez à travers la cage thoracique pour exposer les poumons. Encore une fois, soyez prudent de ne pas couper le sternum et les artères intercostales ou l’aorte ascendante; faire des coupes plus petites tout en avançant à travers la cage thoracique)
   3. Passez une ligature de coton sous l’herbe trachéale et laissez-la telle pour le moment.
   4. Pincez la trachée à un endroit approprié dans la partie distale 1/3^rd, pointant vers les poumons, pour permettre l’accès à une canule trachéale de 28 G.
   5. Insérez une canule PE de 28 G (d’une longueur minimale de 3 à 5 mm et une extrémité distale coupée pour faciliter l’insertion) dans la trachée. Méfiez-vous de l’extrémité de la trachée avant la bifurcation, puis tirez environ un mm en arrière pour éviter d’échantillonner un seul lobe.
   6. Attachez fermement la ligature de coton pour maintenir la canule en place. Ne pas effondrer la canule.
4. Lavage broncho-alvéolaire (BAL)
   1. Remplissez 0,5 mL de PBS dans une seringue de 1 mL.
   2. Maintenant, injectez progressivement 0,5 mL de PBS dans la canule à l’aide d’une seringue de 1 mL.
   3. Après avoir injecté du PBS, aspirez la seringue tant qu’elle ne résiste pas à l’aspiration.
      REMARQUE: S’il y a une résistance lors de l’aspiration du liquide BAL, cela indique un effondrement du tissu alvéolaire ou bronchique. Dans ce cas, retirez la canule par une minuscule pour détacher la canule des parois du tissu.
   4. Recueillir le liquide aspiré dans un tube de microfuge marqué et le placer sur la glace.
   5. Effectuer deux autres lavages de la même façon en recueillant dans le même flacon (c.-à-d. un total de 0,5 X 3 = lavage de 1,5 mL).
   6. Mesurer le volume de liquide BAL collecté. La récupération du lavage devrait être proche de 90%.
5. Perfusat vasculaire pulmonaire (LVP)
   1. Couper l’aorte thoracique descendante à un endroit entre les moitiés thoracique et abdominale, pour éviter tout recul de perfusat dans les poumons tout en perfusant à travers le ventricule droit.
   2. Éponger la cavité près de l’extrémité de l’aorte coupée, exempte de sang.
   3. Ensuite, perfuser les poumons avec 0,5 mL de solution saline héparinisée à température ambiante injectée à travers le ventricule droit.
   4. Recueillir le perfusat vasculaire de la cavité à l’extrémité coupée de l’aorte thoracique descendante, dans un tube de microfuge, placé sur de la glace et mesurer son volume.
   5. Lilaguer la bronche droite proximale à sa ramification de la trachée (avec du fil de coton).
6. Fixation in situ du poumon gauche
   1. Connectez une seringue de 1 mL à la canule trachéale, qui est assez longue pour s’insérer à travers l’incision trachéale précédente.
   2. Aspirez l’air dans la seringue jusqu’à 0,6 mL.
   3. Ensuite, remplissez la seringue restante (jusqu’à la toute fin) avec du paraformaldéhyde à 2% à température ambiante. Assurez-vous que le piston est prêt à sortir sans aspirer l’air de la canule.
   4. Maintenant, fixez la seringue avec un scotch, sur un récipient vertical, mesure jusqu’à 20 cm de hauteur.
   5. Retirez doucement le piston pour laisser s’écouler la fixatrice vers la trachée. Dans le cas où il y a quelques bulles d’air dans la canule, placez doucement le piston sur le dessus de la seringue et le liquide commencera à s’écouler après quelques secondes.
   6. Laisser le poumon gauche gonfler à sa capacité totale insitu, pendant 5 minutes, à partir d’une hauteur de 20 cm formant une colonne d’eau de 20 cm.
   7. Au cours de cette procédure, assurez-vous de protéger les lobes pulmonaires droits contre le contact avec le paraformaldéhyde, car cela affectera les tests en aval.
   8. Placez les tissus de laboratoire pliés pour absorber tout paraformaldéhyde qui pourrait entrer en contact avec les lobes pulmonaires droits.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est très toxique. Par conséquent, n’inhalez pas et ne placez pas de contact avec les parties exposées du corps. Faites preuve d’une extrême prudence lors de la manipulation.
   9. Pendant le temps de l’instillation du paraformaldéhyde, désinfectez l’abdomen.
   10. Couper les lobes pulmonaires droits de la trachée en vous assurant d’enlever n’importe quel fil et mettre immédiatement les lobes dans un cryovial marqué et le laisser tomber dans de l’azote liquide pour l’analyse moléculaire / biochimique en aval des cytokines / RT-PCR / analyse western blot de l’homogénat pulmonaire.
   11. Coupez soigneusement le poumon gauche pour tout tissu conjonctif ou membrane pleurale et trempez-le dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 24 h à 4 °C.
   12. Incorporez le poumon fixe dans la paraffine conformément au protocole d’incorporation standard.
       Attention: Ne pas trop chauffer les échantillons pulmonaires.
   13. Coupez la partie abdominale et dépeint de l’os pelvien (hanche).
   14. Séparez les os gauche et droit du fémur de la partie pelvienne, dans une boîte de Pétri remplie de solution saline conservée sur la glace.
7. Collecte aspirée de moelle osseuse sternale et fémur
   1. Nettoyez les tissus et les muscles des os à l’aide de tissus de laboratoire.
   2. Recueillir la cage thoracique ventrale et le sternum dans une boîte de Petri remplie de solution saline conservée sur la glace.
   3. Couper les extrémités distales et proximales des os sternaux et fémurs.
   4. Impréner les os 4 fois avec 0,5 mL de solution saline, à l’aide d’aiguilles bien ajustées (24 à 28 G) sur des seringues de 1 mL, et recueillir les fractions de chaque os dans des tubes étiquetés munis de filtres et placés sur de la glace.
      REMARQUE: La jauge à aiguille varie selon la taille de l’animal. Après le rinçage, l’os du fémur devrait apparaître transparent.
   5. Une fois les échantillons prélevés, mettez la souris dans un sac en plastique et mettez-la dans un congélateur de carcasse d’animal pour une élimination appropriée, conformément aux lignes directrices de l’établissement pour animaux de l’établissement pour animaux de l’établissement.

3. Traitement des échantillons

1. Nombre total (CCM) et différentiel (DLC) de leucocytes
   1. Centrifuger les échantillons de sang périphérique, de BAL, de perfusat vasculaire pulmonaire et de moelle osseuse (sternale et fémur) pendant 10 min à 500 g.
   2. Recueillir les surnageants, les congeler instantanément et les stocker à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
   3. Reconstituer les cellules dans un minimum de 200 μL de PBS.
   4. Effectuer la CCM en comptant le BAL, le sang, le perfusat vasculaire pulmonaire et les cellules de moelle osseuse sur un hémocytomètre.
   5. Colorer une autre aliquote de 9 μL de BAL avec un mélange de 1 μL de vert calcéine et d’éthidium homodimer-1 rouge pour quantifier les cellules vivantes (vertes) en raison de l’activité de l’estérase intracellulaire et de toutes les cellules BAL endommagées (en rouge) en raison de la perte d’intégrité de la membrane plasmique.
   6. Ajouter 2% d’acide acétique aux globules rouges de lyse, dans un rapport de 1:10 pour le TLC de sang et de rapport de 1:2 pour le TLC de vasculaire de poumon.
      ATTENTION : Ajuster les concentrations cellulaires en diluant dans le PBS si la concentration est supérieure à 1x10⁶ cellules par mL (très important pour les échantillons de moelle osseuse).
   7. Centrifuger les cellules pour préparer des cytospins sur les lames et la tache comme expliqué ci-dessous pour les DLC. Comptez un minimum de 100 cellules pour le compte différentiel de cellules de leucocyte (DLC).
      REMARQUE: Typiquement, on peut préparer deux cytospins sur une lame. Et après 10-15 minutes de séchage à l’air, procédez à l’étape de coloration.
   8. Divisez le BAL collecté de trois souris pilotes par groupe en deux cytospins chacun et tachez l’actine/tubuline et les mitochondries avec phosphorylation oxydative active (mitotracker réduit). Utilisez la BAL de trois souris supplémentaires pour diviser en deux cytospins chacune, pour les lames colorées par NK1.1/Gr1/CX3CR1 et ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatine. Diviser la BAL de trois souris supplémentaires en deux cytospins chacune pour tacher l’ATPα/Ly6G et le CX3CR1/Siglec-F.
2. Lavage bronchoalvéolaire (BAL) et quantification des protéines totales du perfusat vasculaire pulmonaire (LVP)
   1. Afin de quantifier les perturbations induites par_O3 et LPS de la barrière vasculaire ou de la pression oncotique relative dans les deux compartiments pulmonaires (c.-à-d. les compartiments septaux alvéolaires (interstitiels) et vasculaires pulmonaires (vasculaires)), mesurer la teneur totale en protéines dans les fluides collectés.
   2. Analyser les fractions surnageantes décongelées pour leur concentration totale en protéines à l’aide d’un test colorimétrique standard résistant aux détergents.
   3. Lavage bronchoalvéolaire (BAL) et analyse des chimiokines du perfusat vasculaire pulmonaire (LVP)
      1. Ensuite, analysez les chimiokines dans les surnageants bal et de perfusate vasculaire pulmonaire (LVP) utilisant un immunoessai à base de perles magnétiques de 33-plex. Cela renseignera sur la directionnalité des gradients de chimiokines des voies respiratoires/interstitium par rapport aux chimiokines vasculaires établies après des expositions combinées.
      2. Analyser le panel suivant de chimiokines : CXCL13 (chimioattractant des lymphocytes B), CCL27 (chimiokine IL-11 R-alpha-locus (ILC)), CXCL5 (peptide 78 activant les neutrophiles dérivé de l’épithélial (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interféron gamma), IL-10 (interleukine-10), IL-16 (interleukine-16), IL-1β (interleukine-1 bêta), IL-2 (interleukine-2), IL-4 (interleukine-4), IL-6 (interleukine-6), CXCL-10 (protéine induite par l’interféron gamma 10 (IP-10)), CXCL11 (protéine inductible interféron-gamma 9 (IP-9)), KC (kératinocytes chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory 1 protéine-3 bêta), RANTES (régulé lors de l’activation, cellule T normale exprimée et sécrétée (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (facteur 1 dérivé des cellules stromales), TARC (thymus et chimiokine régulée d’activation (TARC)), TECK (Thymus-Expressed Chemokine (CCL25)) et TNFα (facteur de nécrose tumorale alpha).

4. Coloration cytospin et histologie pulmonaire

1. Coloration biochimique de cytospin
   1. Entourez les cytospins d’un stylo hydrophobe pour contenir les produits chimiques pour l’incubation pendant la procédure.
   2. Réhydratez les cytospins dans le PBS pendant 5 minutes.
   3. Fixer les échantillons de cytospin dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 10 minutes, laver trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
   4. Perméabiliser avec de l’acétone glacée à 70% pendant 7 minutes et laver à nouveau trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
   5. Coloration pour l’actine et la tubuline ou Mitotracker réduit (incuber avec un mélange de 2 μg/50 μL de phalloïde conjuguée Alexa 488 en vert et 2 μg/μL de souris conjuguée Alexa 555 anti-α de tubuline ou de Mitotracker réduit représenté en rouge, respectivement) pendant 15 minutes.
      REMARQUE: Utilisez l’anticorps de contrôle d’isotype IgG1 de souris, dans un cytospin séparé, pour valider le protocole de coloration de la tubuline. Effectuer les mêmes étapes que celles expliquées des sections 4.1.1 à 4.1.8, mais pour les contrôles d’isotype.
   6. Enlevez les taches en faisant basculer doucement le mélange de la lame. Incuber les lames avec DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) pendant 5-10 min pour colorer les noyaux.
   7. Laver les cytospins 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacune, la lamelle de couverture avec un support de montage anti-fondu et conserver pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante avant l’imagerie.
   8. Acquérir des images sous un microscope droit à large champ équipé d’une caméra scientifique. Assurez des temps d’exposition de caméra cohérents définis pour les différents canaux fluorescents lors de l’imagerie des diapositives.
2. Coloration cytospin immunisée-fluorescente:
   1. Entourez les cytospins d’un stylo hydrophobe pour contenir les produits chimiques pour l’incubation pendant la procédure. Réhydratez les cytospins dans le PBS pendant 5 minutes.
   2. Fixer les échantillons de cytospin en incubant dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 10 minutes, laver trois fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
   3. Perméabiliser avec 0,1% de triton froid X-100 pendant 2 minutes, laver trois fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
   4. Ensuite, fc bloquer pendant 15 minutes en incubant le cytospin avec une dilution 1:50 du stock d’anticorps bloc Fc (pour s’assurer que l’anticorps primaire de souris ne réagit pas de manière non spécifique avec les anticorps fc de souris).
   5. Faites basculer les lames pour enlever le bloc Fc et passer à 1% BSA pour et incuber le cytospin avec un mélange de 3 anticorps primaires d’intérêt (voir le tableau 1 pour les différentes combinaisons) pendant 30 minutes.
      REMARQUE: Assurez-vous d’exécuter des anticorps de contrôle d’isotype (incuber avec un mélange d’anticorps primaires IgG1 de souris et de kappa IgG2b de rat en effectuant les étapes 4.2.1 à 4.2.9 et en remplaçant les anticorps par des contrôles d’isotype) en parallèle avec les anticorps secondaires correspondants comme discuté dans notre étude récente^20.
   6. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Incuber les cytospins avec un mélange d’anticorps secondaires bien conçus (veuillez vous référer au tableau 1 pour les détails).
   7. Enlevez les taches en faisant basculer doucement le mélange de la lame, incuber avec du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylétoïne) pendant 5-10 min pour tacher les noyaux. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
   8. Lamelle de couverture avec support de montage anti-fondu et conserver pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante avant l’imagerie.
   9. Acquérir des images sous un microscope droit à large champ équipé d’une caméra scientifique. Assurez des temps d’exposition de caméra cohérents pour tous les canaux de fluorophores lors de l’imagerie des diapositives.
3. Hématoxyline et histologie de l’éosine (H&E)
   1. Effectuer une coloration H&E modifiée³ sur les cryo-sections pulmonaires pour tous les groupes.
4. Analyse d’image
   1. Traiter et analyser les fichiers image data (.tiff) dans le logiciel ouvert Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Vérifiez les paramètres requis (Surface, Périmètre, Densité intégrée, Descripteurs de forme, Diamètre du feret, Circularité, Étiquette d’affichage) à enregistrer sous l’onglet Analyser et Définir les mesures.
   3. À l’aide du gestionnaire de retour sur investissement,décrivez manuellement environ 50 à 200 cellules dans le panneau d’images fusionnées à l’aide de l’outil « sélections à main levée ». Enregistrez les régions d’intérêt (ROI) avec la commande Ctrl+T et copiez les ROIs enregistrés pour chaque cellule sur tous les canaux de fluorophore.
   4. Appuyez ensuite sur Ctrl+M pour mesurer les paramètres prédéfinis pour tous les canaux fluorescents (par exemple, 405 nm (DAPI ou ATPβ en bleu), 488 nm (actine ou NK1.1 ou Ki-67 en vert), 568 nm (tubuline ou Gr1 ou CD61 en rouge) et 633 nm (CX3CR1 ou angiostatine en magenta)).
   5. Enregistrez les résultats en tant que fichier .csv sous un nom approprié qui représente votre analyse. Copiez les résultats du fichier .csv dans une feuille de calcul et divisez l’intensité de fluorescence (FI) (qui est la colonne Densité intégrée brute du fichier de résultats) de la molécule colorée par celle de DAPI ou CD61 FI, selon la conception de coloration. Ces ratios sont appelés « ratios FI normalisés DAPI ou CD61 ».
   6. Ensuite, tracez ces rapports normalisés, la circularité, le périmètre cellulaire et le diamètre du férode, pour évaluer tout changement dans la taille de la cellule après l’exposition combinée à O₃ et À LPS.
   7. Utilisez un logiciel statistique approprié pour vérifier la normalité des données recueillies et pour tester l’hypothèse nulle (veuillez vous référer à la section analyse statistique ci-dessous).
5. analyse statistique
   1. Exprimer les résultats sous forme de moyenne ± SEM. Un minimum de trois souris ont été employées par groupe.
   2. Pour l’analyse des données de chimiokines, ajustez les valeurs de p de l’ANOVA unidirectionnelle pour le taux de fausses découvertes en fonction de la correction de Benjamini et de Hoshberg.
   3. Analyser les paramètres de l’image, la cellularité, le diamètre du feret, le périmètre, les rapports d’intensité de fluorescence normalisés DAPI ou CD61 par test U de Mann-Whitney (pour comparer deux groupes) ou test de Kruskal Wallis (pour comparer plusieurs groupes) car ces données n’étaient pas distribuées normalement.
   4. Pour le reste des expériences d’imagerie, analysez les résultats à l’aide d’une analyse à sens unique de la variance suivie des comparaisons multiples de Sidak. Les valeurs de p <0,05 ont été jugées significatives.

Résultats

L’exposition combinée d’O₃ et de LPS mène à l’inflammation systémique et à la mobilisation de moelle à 72 h : Les comptes de cellules dans différents compartiments ont indiqué des changements significatifs dans le sang périphérique et les comptes totaux de cellules de moelle fémur sur des expositions combinées d’O₃ et de LPS. Bien que les expositions combinées à l’O3 et au LPS n’aient induit aucun chan...

Discussion

Les méthodes présentées dans l’étude actuelle mettent en évidence l’utilité de l’analyse de compartiments multiples pour étudier des événements cellulaires multiples pendant l’inflammation de poumon. Nous avons résumé les constatations dans le tableau 2. Nous et beaucoup de laboratoires avons étudié intensivement la réponse murine à l’instillation intranasale de LPS, qui est marquée par le recrutement rapide des neutrophiles de poumon, qui culmine entre 6-24 h suivant quoi, la r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock