Визуализация клеточной адаптации легких во время комбинированного озона и ЛПС-индуцированного острого повреждения легких

Резюме

Комбинированные мыши, подвергшиеся воздействию озона и бактериального эндотоксина, демонстрируют широко распространенную гибель клеток, в том числе нейтрофилов. Мы наблюдали клеточные адаптации, такие как нарушение цитоскелетной ламеллиподии, повышенная клеточная экспрессия комплекса V АТФ-синтазы субъединиц β и ангиостатина в бронхо-альвеолярном лаваже, подавление иммунного ответа легких и задержка набора нейтрофилов.

Аннотация

Легкие постоянно сталкиваются с прямыми и косвенными инсультами в виде стерильных (частицы или реактивные токсины) и инфекционных (бактериальных, вирусных или грибковых) воспалительных состояний. Подавляющая реакция хозяина может привести к скомпрометированному дыханию и острому повреждению легких, которое характеризуется рекрустацией нейтрофилов легких в результате пато-логического ответа хозяина на иммунную, коагулятивную и тканевую реакцию ремоделирования. Чувствительные микроскопические методы визуализации и количественной оценки клеточных адаптаций легких мыша в ответ на низкие дозы (0,05 ppm) озона, мощного загрязнителя окружающей среды в сочетании с бактериальным липополисахаридом, агонистом TLR4, имеют решающее значение для понимания воспалительных и восстановительных механизмов хозяина. Описан комплексный флуоресцентный микроскопический анализ различных легочных и системных компартментов тела, а именно бронхо-альвеолярной лаважной жидкости, перфузата сосудов легких, криосекций левого легкого и перфусата грудинного костного мозга. Показаны повреждения альвеолярных макрофагов, нейтрофилов, паренхималенной ткани легких, а также клеток костного мозга в корреляции с замедленным (до 36-72 ч) иммунным ответом, который характеризуется дискретными градиентами хемокина в анализируемых компартментах. Кроме того, представлены внеклеточные матриксы легких и клеточные цитоскелетные взаимодействия (актин, тубулин), митохондриальные и реактивные формы кислорода, антикоагулятивный плазминоген, его антиангиогенный пептидный фрагмент ангиостатин, субъединицы митохондриального АТФ-синтазы V, α и β. Эти суррогатные маркеры, когда они дополняются адекватными клеточными анализами in vitro и методами визуализации животных in vivo, такими как прижизальная микроскопия, могут предоставить жизненно важную информацию для понимания реакции легких на новые иммуномодулирующие агенты.

Введение

Острое повреждение легких (АЛИ) является важнейшей патологической реакцией легких на инфекционные или другие вредные раздражители, которая характеризуется одновременной активацией коагулятивной, фибринолитической и врожденной иммунной^{систем1.} Нейтрофилы быстро ощущают микробные, а также внутриклеточные повреждения через семейство Toll-подобных рецепторов (TLR)^2,3,4. Нейтрофилы высвобождают предварительно сформированные цитокины и цитотоксическое содержимое гранул, которые затем могут вызвать повреждение коллатерального ткани. Последующее альвеолярное повреждение омрачается вторичной гибелью клеток, приводящей к высвобождению молекул, таких как аденозинтрифосфат (АТФ)^5,тем самым устанавливая порочный круг иммунной дисрегуляции.

Нерешенная проблема в понимании АЛИ связана с вопросом о том, как инициируется травма внутри альвеолярной мембраны. Электронный транспортный комплекс V, F1F0 АТФ-синтаза, представляет собой митохондриальный белок, который, как известно, экспрессируется повсеместно на клеточной (включая эндотелиальную, лейкоцитарную, эпителиальную) плазматической мембране во время воспаления. Клеточный цитоскелет, который состоит из актина и тубулина, содержит много клеточной формы и модуляции функции, а также митохондриальных белков, соответственно. Недавно мы показали, что блокада АТФ-синтазы эндогенной молекулой, ангиостатином, заглушает рекрут нейтрофилов, активацию и липополисахарид (ЛПС) индуцирует воспаление легких^6. Таким образом, как биохимические (АТФ-синтаза), так и иммунные (TLR4) механизмы могут регулировать альвеолярный барьер во время воспаления легких.

Воздействие озона (O_3),загрязнителя окружающей среды, ухудшает функцию легких, повышает восприимчивость к легочным инфекциям, а короткие низкие уровни воздействия O₃ увеличивают риск смертности у людей с основными кардиореспираторными состояниями^{7,8,9,10,11,12,13,14.} Таким образом, воздействие физиологически значимых концентраций_О3 обеспечивает содержательную модель АЛИ для изучения фундаментальных механизмов воспаления^7,8. Наша лаборатория недавно установила мышиную модель низкодозного Индуцированного O₃ ALI^15. После выполнения дозы и временного ответа на низкие концентрации O₃ мы наблюдали, что воздействие 0,05 ppm O 3 в течение₂ ч вызывает острое повреждение легких, которое характеризуется субъединицей β субъединица V атфсинтазы легких (ATPβ) и экспрессией ангиостатина, аналогично модели ЛПС. Прижизненная визуализация легких выявила дезорганизацию альвеолярных актиновых микрофиламентов, указывающих на повреждение легких, и абляцию альвеолярных септальных активных форм кислорода (АФК) (что указывает на отмену исходной клеточной сигнализации) и митохондриального мембранного потенциала (указывающего на острую гибель клеток) после 2 ч воздействия 0,05 ppm O₃^15, что коррелировало с гетерогенным легочным ¹⁸удержанием FDG^16,рекрутированием нейтрофилов и высвобождением цитокинов, в первую очередь IL-16 и SDF-1α. Вывод из наших недавних исследований заключается в том, что O₃ вызывает экспоненциально высокую токсичность при воздействии в концентрациях ниже допустимых пределов 0,063 ppm в течение 8 ч (в день) для воздействия на человека. Важно отметить, что не существует четкого понимания того, могут ли эти субклинические воздействия O₃ модулировать TLR4-опосредованные механизмы, такие как бактериальный эндотоксин^17. Таким образом, мы изучили модель воздействия O₃ и LPS с двойным ударом и наблюдали иммунную и неиммунные клеточные адаптации.

Мы описываем комплексный флуоресцентный микроскопический анализ различных легочных и системных компартментов тела, а именно бронхо-альвеолярной лаважной жидкости (т.е. BAL), которая пробует альвеолярные пространства, перфусат сосудов легких (т.е. LVP), который пробует легочную сосудистую сосудистую систему и альвеолярную перегородку интерстиций в случае компрометированного эндотелиального барьера, криосекций левого легкого, чтобы изучить резидентные паренхиматозные и адгезивные лейкоциты, оставшиеся в лавированной легочной ткани , периферическая кровь, которая представляет собой циркулирующие лейкоциты и перфузаты грудины и бедренного мозга, которые пробуют проксимальные и дистальные участки мобилизации кроветворных клеток во время воспаления, соответственно.

протокол

Дизайн исследования был одобрен Советом по этике исследований животных Университета Саскачевана и соответствовал руководящим принципам Канадского совета по уходу за животными для гуманный использование животных. Были приобретены шести-восьминедельные самцы мышей C57BL/6J. ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпьте любых животных, у которых развивается тяжелая летаргия, респираторный дистресс или другие признаки тяжелого дистресса до запланированной конечной точки.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте следующее: 27-18 г иглы с затуплением (будет зависеть от диаметра трахеи мыши), полиэтиленовую трубку соответствующего размера, чтобы соответствовать тупой игле (сделайте ПЭ-канюлю для каждой мыши), канюлю, 2 острых ножница, 2 тупых щипца (маленькие), 1 острый щипц (маленький), 3 шприца 1 мл, меченые микрофузионные трубки (для сбора перфусата BAL, крови, сосудов и костного мозга) и маркированные флаконы (для фиксации тканей), пакеты для образцов / криовиалы для сбора тканей, рулон хлопчатобумажной нити мясника (разрезанный на лигатуры соответствующего размера). Все химические вещества, используемые для экспериментов, указаны в Таблице материалов.

1. Воздействие озона и ЛПС для индукции повреждения легких мысей

1. Воздействие озона
   1. Подготовьте собственную индукционную коробку O_3. Добавьте корм для мышей, бутылку с водой, игрушки для обогащения и чистую подстилку, чтобы имитировать среду содержания мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги обеспечат мышам свободный доступ к пище и воде при размещении в специальном индукционном ящике и помогут облегчить чрезмерный стресс.
   2. Включите калибратор/генератор O₃ (расположенный по направлению к входному порту) для стабилизации УФ-лампы перед рукой (примерно за 15 минут до экспозиции) и подключитесь к встроенному монитору O_3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор O₃ должен считывать в среднем 0,05 ppm, как проба взята из выходного отверстия при постоянной температуре воздуха в камере (72 ±3 °F) и относительной влажности (50±15%).
   3. Для воздействия_O3 осторожно поместите мышей в специальный индукционный ящик и непрерывно подвергайте мышей воздействию 0,05 ppm O₃ в течение 2 ч.
2. Анестезия и интраназальное введение ЛПС
   1. Подготовьте 10 мг/мл для кетамина и ксилазина отдельно.
   2. Приготовьте коктейль, смешав 20 частей кетамина и 1 часть ксилазина. Если мышь весит X г, введите (X/200) мл коктейля кетамина/ксилазина в брюшинную полость. Для одной мыши приготовьте 1 мл коктейля, состоящего из 1000 мкл запаса кетамина 10 мг/мл и 50 мкл запаса ксилазина. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз в микрофунке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы кетамина и ксилазина могут быть приготовлены за неделю.
   3. Обезболивают мышей под легкой внутрибрюшинной (IP) смесью кетамина (50 мг/кг)/ксилазина (1 мг/кг) (например, для мыши с 25 г вводят 0,125 мл коктейля).
   4. Приготовьте 1 мг/мл раствора ЛПС в физиологическом растворе и заполните 50 мкл раствора в пипетке.
   5. Держите мышь вертикально спиной/спинной стороной на ладони, держа уши той же рукой. Теперь поместите 50 мкл раствора LPS¹⁸ осторожно вне ноздрей (т. Е. 25 мкл на каждую ноздрю или 50 мкл в одну ноздрю; не имеет значения, пока процедура быстрая) и позвольте мышам вдохнуть раствор LPS.
   6. Закапывать контрольным мышам 50 мкл стерильного физиологического раствора.
      Внимание:Не превышайте более 100 мкл для инстилляции, которая может привести к летальному исходу. Слишком меньший объем (т.е. <50 мкл) и существует риск только носового отложения.
   7. После введения ЛПС осторожно уложите мышей либо на живот, либо на спину на насыпь подстилки с головой, слегка наклонено вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такая ориентация продлевает удержание раствора в носовой полости^19.
   8. Через 0, 2, 4, 24, 36 и 72 ч после воздействия обезболивают мышей, т.п., полной дозой кетамина (200 мг/кг)/ксилазина (4 мг/кг) (т.е. Х/50 мл коктейля, где X - вес мыши в граммах или 0,50 мл для мыши весом 25 г).
   9. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не потеряет сознание и правый рефлекс (т.е. не поворачивается назад при укладке в лежачем положении). Теперь проверьте мышь на глубину анестезии, контролируя дыхание (ритмичные экскурсии грудной клетки) и частоту сердечных сокращений, которая должна заметно упасть, через 1-2 минуты.
   10. Затем проверьте наличие педальных рефлексов, то есть зажмите любой из пальцей задних конечностей и наблюдайте за втягиванием конечности, как рефлекс. Если мышь реагирует, пополните их дополнительными инъекциями 0,1 мл или более, по мере необходимости.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы достичь глубокой анестезии, имейте в виду, что определенные штаммы или мыши с ожирением обычно имеют больший объем распределения и, таким образом, могут быть легко передюзоированы, если не допускается достаточное время для полной анестезии (которая может составлять около 10 минут или более). Соответственно, некоторые штаммы могут быть устойчивыми к анестезии и, следовательно, требуют большего пополнения. Эти знания приобретаются после многих практических наблюдений и опыта работы с мышами разных штаммов и возраста. Поскольку несколько пилотных экспериментов также были проведены сразу после воздействия O₃ и LPS (т. Е. В точке времени 2 часа), мы также включили некоторый очень ранний анализ клеток BAL из этих экспериментов, чтобы подчеркнуть непосредственные эффекты комбинированного воздействия O₃^{и LPS.}

2. Сбор образцов

1. Поместите мышь на хирургический лоток. Теперь аккуратно наденьте смазывающую глазную мазь на оба глаза, чтобы избежать потери жидкости, и продезинфицируйте мышь с помощью 70% этанолового спрея.
   1. Сделайте ножницами небольшие надрези через верхнюю и нижнюю оболочки кожи, обнажите трахею и грудную клетку.
   2. Сделайте разрез чуть ниже грудины и обнажите сердце.
2. Пункция сердца
   1. Поместите иглу 25G, прикрепленную к гепаринизированному шприцу, в правый желудочек и проколите кровь путем пункции сердца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь обычно черпает с минимальным плунжерным вытягиванием, если время от воздействия сердца на прокол сердца составляет менее минуты. После сбора около 0,4-0,5 мл может потребоваться пауза на несколько секунд, прежде чем собирать оставшуюся кровь. Это делается для того, чтобы позволить сердцу перекачивать любой оставшийся объем в правую желудочковую камеру. К концу сбора крови сердце перестает качать.
   2. Соберите кровь и храните в микрофьюжных пробирках для дальнейшей обработки.
3. Трахеостомия
   1. Осторожно используйте пинцет / тупые щипцы, чтобы очистить область трахеи от вышележдающей ткани. Используйте руки в перчатках больше, чем хирургические инструменты, чтобы избежать кровотечения. Если сочится много крови, существует риск заражения образцов BAL. Используйте ватные тампоны, если это необходимо, хотя и не предпочтительно. Kimwipes - лучшие альтернативы.
   2. Теперь прорежьте грудную клетку, чтобы обнажить легкие. Опять же, будьте осторожны, чтобы не перерезать грудину и межребрюшные артерии или восходящую аорту; делать меньшие надрезы при продвижении через грудную клетку)
   3. Пропустите ватную лигатуру ниже среза трахеи и оставьте как таковую на время.
   4. Срежьте трахею в подходящем месте в дистальной 1/3-й части, указывая на легкие, чтобы обеспечить доступ для трахеальной канюли 28 г.
   5. Вставьте в трахею канюлю 28 г ПЭ (минимальная длина 3-5 мм и дистальный конец, обрезанный для удобства введения). Следите за концом трахеи перед бифуркацией, а затем потяните около миллиметра назад, чтобы избежать отбора проб только одной доли.
   6. Прочно завяжите хлопчатобумажную лигатуру, чтобы удерживать канюлю на месте. Не разрушайте канюлю.
4. Бронхо-альвеолярное лаваж (BAL)
   1. Заполните 0,5 мл PBS в шприц 1 мл.
   2. Теперь постепенно вводят 0,5 мл ПБС в канюлю с помощью шприца 1 мл.
   3. После инъекции PBS аспирировать шприц до тех пор, пока он не сопротивляется всасыванию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть сопротивление при аспирации жидкости BAL, это указывает на коллапс альвеолярной или бронхиальной ткани. В этом случае оттяните канюлю крошечным способом, чтобы отсоединать канюлю от стенок ткани.
   4. Соберите аспирированную жидкость в меченую микрофьюжную трубку и поместите на лед.
   5. Выполните еще два промывания аналогичным образом, собирая в один и тот же флакон (т.е. в общей сложности 0,5 X 3 = 1,5 мл лаважа).
   6. Измерьте объем собранной жидкости BAL. Восстановление лаважа должно быть близко к 90%.
5. Перфусат сосудов легких (LVP)
   1. Разрезайте нисходящую грудную аорту в месте между грудной и брюшной половинами, чтобы избежать любого резервирования перфузата в легких при перфузии через правый желудочек.
   2. Промокните полость возле разрезанной аорты, свободной от крови.
   3. Затем перфузировать легкие 0,5 мл гепаринизированного физиологического раствора комнатной температуры, вводимого через правый желудочек.
   4. Соберите сосудистую перфусат из полости на разрезанном конце нисходящей грудной аорты, в микрофьюжную трубку, помещенную на лед и измерьте ее объем.
   5. Обливать правый бронх проксимально к его ответвлениям от трахеи (хлопчатобумажной нитью).
6. Фиксация in situ левого легкого
   1. Подключите шприц 1 мл к канюле трахеи, который достаточно длинный, чтобы вставить через предыдущий разрез трахеи.
   2. Оттягивайте воздух в шприц до отметки 0,6 мл.
   3. Затем заполните оставшийся шприц (до самого конца) 2% параформальдегидом при комнатной температуре. Убедитесь, что плунжер готов выскочить, не всасывая обратно воздух из канюли.
   4. Теперь прикрепите шприц скотчем, к вертикальному контейнеру, высотой до 20 см.
   5. Осторожно вытяните поршень наружу, чтобы фиксатор тек к трахее. Если в канюле есть несколько пузырьков воздуха, аккуратно поместите поршень поверх шприца, и жидкость начнет течь через несколько секунд.
   6. Дайте левому легкому надуться до общей емкости insitu, в течение 5 минут, с высоты 20 см, образуя 20 см водяной столб.
   7. Во время этой процедуры обязательно защитите правые доли легких от контакта с параформальдегидом, так как это повлияет на последующие анализы.
   8. Поместите сложенные лабораторные ткани, чтобы поглотить любой параформальдегид, который может вступить в контакт с правыми долями легких.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид очень токсичен. Поэтому не вдыхайте и не контактизовывайте с какими-либо открытыми частями тела. Соблюдайте крайнюю осторожность при обращении.
   9. Во время закапывания параформальдегида дезинфицируют живот.
   10. Отрежьте правые доли легких от трахеи, обязательно удалив любую нить, и немедленно поместите доли в меченый криовиал и опустите его в жидкий азот для последующего молекулярного / биохимического анализа цитокинов / ОТ-ПЦР / анализа вестерн-блотта гомогената легких.
   11. Осторожно обрежьте левое легкое для любой соединительной ткани или плевральных мембран и окуните его в 2% параформальдегид в течение 24 ч при 4 °C.
   12. Встраивание фиксированного легкого в парафин в соответствии со стандартным протоколом встраивания.
       Внимание:Не перегревайте образцы легких.
   13. Отрежьте брюшную часть и скиньте ее с тазовой (тазобедренной) кости.
   14. Отделите левую и правую бедренные кости от тазовой части, в заполненной физиологическим раствором чашке Петри, хранятся на льду.
7. Сбор аспиратов грудинального и бедренного костного мозга
   1. Очистите ткани и мышцы от костей с помощью лабораторных тканей.
   2. Соберите вентральную грудную клетку и грудину в наполненную физиологическим раствором чашку Петри, храняшуюся на льду.
   3. Разрезают дистальные и проксимальные кончики грудинных и бедренных костей.
   4. Перфьмизировать кости 4 раза 0,5 мл физиологического раствора, используя хорошо подогнанные иглы (от 24 до 28 г) на шприцах по 1 мл, и собрать фракции из каждой кости в меченые трубки, снабженные фильтрами и помещенные на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игольчатый датчик варьируется в зависимости от размера животного. После покраснения бедренная кость должна быть прозрачной.
   5. После того, как образцы были собраны, поместите мышь в пластиковый пакет и поместите в морозильную камеру туши животного для надлежащей утилизации в соответствии с руководящими принципами институционального учреждения для животных.

3. Обработка образцов

1. Общее (TLC) и дифференциальное (DLC) количество лейкоцитов
   1. Центрифуги периферической крови, БАЛ, легочного сосудистого перфузата и костного мозга (грудины и бедренной) пробы в течение 10 мин по 500 г.
   2. Соберите супернатанты, заморозьте их и храните при -80 °C до дальнейшего анализа.
   3. Восстановить клетки в минимальном 200 мкл PBS.
   4. Выполняют ТЛЦ путем подсчета БАЛ, крови, перфузата сосудов легких и клеток костного мозга на гемоцитометре.
   5. Окрашивают еще 9 мкл аликвоты БАЛ смесью 1 мкл кальцеина зеленого и красного этидия гомодимера-1 для количественной оценки живых (зеленых) клеток из-за активности внутриклеточной эстеразы и любых поврежденных клеток БАЛ (красным цветом) из-за потери целостности плазматической мембраны.
   6. Добавьте 2% уксусной кислоты для лиза эритроцитов в соотношении 1:10 для TLC крови и 1:2 для сосудистогоperfusate TLC в легких.
      ВНИМАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию клеток путем разбавления в PBS, если концентрация составляет более 1x10⁶ клеток на мл (очень важно для образцов костного мозга).
   7. Центрифугируйте клетки для получения цитоспинов на слайдах и окрашиваниях, как описано ниже для DLC. Подсчитайте минимум 100 клеток для дифференциального количества лейкоцитарных клеток (DLC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, можно приготовить два цитоспина на одном слайде. А после 10-15 минут воздушной сушки приступают к этапу окрашивания.
   8. Разделите собранный BAL от трех пилотных мышей в группе на два цитоспина в каждой и окрашивание актина/ тубулина и митохондрий с активным окислительным фосфорилированием (восстановленный митотрекер). Используйте BAL еще от трех мышей, чтобы разделить их на два цитоспина каждая, для окрашенных слайдов NK1.1 / Gr1 / CX3CR1 и ATPβ / Ki-67 / CD61 / Angiostatin. Разделите BAL еще от трех мышей на два цитоспина каждая, чтобы окрасить для ATPα / Ly6G и CX3CR1 / Siglec-F.
2. Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) и суммарный анализ белка перфузата сосудов легких (LVP)
   1. Чтобы количественно оценить_{возмущения} сосудистого барьера или относительного онкотического давления в двух легочных компартментах (т.е. альвеолярных перегородочных (интерстициальных) и легочных сосудистых перфузатных (сосудистых) компартментах), измерьте общее содержание белка в собранных жидкостях.
   2. Проанализируйте размороженные фракции супернатантов на их общую концентрацию белка с использованием стандартного колориметрического анализа, устойчивого к моющим средствам.
   3. Анализ бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и перфузата сосудов легких (LVP) хемоцина
      1. Затем проанализируйте хемокины в СУПЕРНАТАНТАХ BAL и легочном сосудистом перфусате (LVP) с использованием 33-плексного магнитного иммуноанализа на основе шариков. Это позволит получить информацию о направленности градиентов дыхательных путей/интерстиций по сравнению с сосудистыми хемоцинами, установленными после комбинированных воздействий.
      2. Проанализируйте следующую панель хемокинов: CXCL13 (хемоаттактант В-лимфоцитов), CCL27 (IL-11 R-альфа-локус хемокин (ILC)), CXCL5 (эпителиальный нейтрофильный активирующий пептид 78 (ENA-78)), CCL-11 (эотаксин-1), эотаксин-2 (CCL-24), CX3CL1 (фракталкин), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (интерферон гамма), IL-10 (интерлейкин-10), IL-16 (интерлейкин-16), IL-1β (интерлейкин-1 бета), IL-2 (интерлейкин-2), IL-4 (интерлейкин-4), IL-6 (интерлейкин-6), CXCL-10 (интерферон гамма-индуцированный белок 10 (IP-10)), CXCL11 (интерферон-гамма-индуцируемый белок 9 (IP-9)), KC (кератиноцитарный хемоатрактант), MCP-1 (моноцитарный хемоаттактант-белок-1), MCP-3 (моноцитарный хемоаттрактант-белок-3), MCP-5 (моноцитарный хемоаттрактант-белок-5), MDC (макрофаговый хемокин (CCL22)), MIP-1α (макрофаг воспалительный белок-1 альфа), MIP-1β (макрофаговый воспалительный белок-1 бета), MIP-2 (макрофаговый воспалительный белок-2), MIP-3α (воспалительный белок макрофагов-3 альфа), MIP-3β (макрофаг воспалительный белок-1 бета), MIP-2 (воспалительный белок макрофагов-3 альфа), MIP-3β (макрофаг воспалительный воспалительный белок-3 белок-3 бета), RANTES (регулируется по активации, нормальные Т-клетки экспрессированы и секретированы (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12 / SDF-1альфа (стромальный клеточный фактор 1), TARC (тимус и активация регулируемых хемоцин (TARC)), TECK (Thymus-экспрессированный хемоцин (CCL25)) и TNFα (фактор некроза опухоли альфа).

4. Окрашивание цитоспином и гистология легких

1. Биохимическое окрашивание цитоспином
   1. Окружите цитоспины гидрофобной ручкой, чтобы содержать химические вещества для инкубации во время процедуры.
   2. Регидратировать цитоспины в PBS в течение 5 минут.
   3. Зафиксируйте образцы цитоспина в 2% параформальдегиде в течение 10 минут, промывайте три раза PBS в течение 5 минут каждый.
   4. Пермеабилизировать ледяным холодом 70% ацетона в течение 7 минут и снова трижды промыть PBS по 5 минут каждый.
   5. Окрашивание для актина и тубулина или восстановленного Митотрекера (инкубировать со смесью 2 мкг/50 мкл конъюгированного фаллоидина Alexa 488, показанного зеленым цветом, и 2 мкг/мкл Alexa 555 конъюгированного мышиного противоиндивного α тубулина или восстановленного Митотрекера, показанного красным цветом, соответственно) в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте контрольное антитело к изотипу IgG1 мыши в отдельном цитоспине для проверки протокола окрашивания тубулина. Выполните те же действия, что и в разделе 4.1.1 -4.1.8, но для элементов управления изотипами.
   6. Удалите пятна, аккуратно опрокинули смесь с слайда. Инкубируют слайды с DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в течение 5-10 мин для окрашивания ядер.
   7. Промыть цитоспины 3 раза pBS в течение 5 мин каждый, обтекать анти-выцветшим монтажным носителем и хранить на ночь в темноте при комнатной температуре перед визуализацией.
   8. Получайте изображения под широкоугольным вертикальным микроскопом, оснащенным научной камерой. Обеспечьте стабильное время экспозиции камеры, установленное для различных флуоресцентных каналов при скольжении изображения.
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание цитоспином:
   1. Окружите цитоспины гидрофобной ручкой, чтобы содержать химические вещества для инкубации во время процедуры. Регидратировать цитоспины в PBS в течение 5 минут.
   2. Зафиксируйте образцы цитоспина, инкубируя в 2% параформальдегиде в течение 10 минут, промывайте три раза PBS в течение 5 минут каждый.
   3. Пермеабилизировать 0,1% холодным тритоном Х-100 в течение 2 минут, трижды промыть PBS по 5 мин каждый.
   4. Затем Fc блокируют в течение 15 минут путем инкубации цитоспина с развежением 1:50 запаса антител к блоку Fc (чтобы гарантировать, что первичное мышиное антитело не вступает в перекрестную реакцию не-специфически с антителами Fc мыши).
   5. Опрокидывайте слайды, чтобы удалить блок Fc и изменить до 1% BSA для и инкубировать цитоспин со смесью 3 первичных антител, представляющих интерес (см. Таблицу 1 для различных комбинаций) в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно запускайте контрольные антитела изотипа (инкубируйте с помощью смеси мышиных IgG1 и крысиных IgG2b каппа первичных антител, выполняя шаги 4.2.1 - 4.2.9 и заменяя антитела контролем изотипов) параллельно с соответствующими вторичными антителами, как обсуждалось в нашем недавнем исследовании^20.
   6. Промыть 3 раза PBS по 5 мин каждый. Инкубируйте цитоспины смесью надлежащим образом разработанных вторичных антител (см. Таблицу 1 для получения подробной информации).
   7. Удалите пятна, осторожно опрокинув смесь с горки, инкубируйте с DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в течение 5-10 мин до окрашивания ядер. Промыть 3 раза PBS по 5 мин каждый.
   8. Крышка с антивярающей монтажной средой и хранится на ночь в темноте при комнатной температуре перед визуализацией.
   9. Получайте изображения под широкоугольным вертикальным микроскопом, оснащенным научной камерой. Обеспечьте стабильное время экспозиции камеры, установленное для всех флуорофорных каналов при скольжении изображения.
3. Гематоксилин и эозин (H&E) гистология
   1. Выполните модифицированное окрашивание H&E³ на крио-секциях легких для всех групп.
4. Анализ изображений
   1. Обработка и анализ файлов данных изображений (.tiff) в открытом программном обеспечении Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Проверьте необходимые параметры (Площадь, Периметр, Интегрированная плотность, Дескрипторы формы, Диаметр Фере, Цикличность, Метка дисплея), которые будут записаны на вкладке Анализ и Установить измерения.
   3. Используя менеджер ROI,вручную наметьте около 50-200 ячеек на объединенной панели изображений с помощью инструмента «выбор от руки». Сохраните интересующих области (ROI) с помощью команды Ctrl+T и скопируйте сохраненные ROI для каждой ячейки во все флуорофорные каналы.
   4. Затем нажмите Ctrl+M для измерения заданных параметров для всех флуоресцентных каналов (например, 405 нм (DAPI или ATPβ синим), 488 нм (актин или NK1.1 или Ki-67 зеленым), 568 нм (тубулин или Gr1 или CD61 красный) и 633 нм (CX3CR1 или ангиостатин в пурпурном цвете)).
   5. Сохраните файл Результаты как .csv под соответствующим именем, представляющим анализ. Скопируйте результаты из файла .csv в электронную таблицу и разделите интенсивность флуоресценции (FI) (которая является столбцом «Необработанная интегрированная плотность» из файла результатов) окрашенной молекулы на интенсивность DAPI или CD61 FI в соответствии с дизайном окрашивания. Эти соотношения называются «нормализованными соотношениями FI DAPI или CD61».
   6. Затем постройте график этих нормализованных соотношений, циркулярности, периметра ячейки и диаметра Ферета, чтобы оценить любое изменение размера ячейки после комбинированного воздействия O₃ и LPS.
   7. Используйте соответствующее статистическое программное обеспечение для проверки нормальности собранных данных и проверки нулевой гипотезы (см. раздел статистического анализа ниже).
5. статистический анализ
   1. Выражают результаты как среднее ± SEM. Минимум три мыши использовались в группе.
   2. Для анализа данных хемокина скорректируйте односторонние p-значения ANOVA для скорости ложного обнаружения в соответствии с поправкой Бенджамини и Хошберга.
   3. Анализируйте параметры изображения, клеточность, диаметр Ферета, периметр, dapi или CD61 нормализованные коэффициенты интенсивности флуоресценции с помощью теста Манна-Уитни U (для сравнения двух групп) или теста Крускала Уоллиса (для сравнения нескольких групп), поскольку эти данные обычно не распределялись.
   4. Для остальных экспериментов по визуализации проанализируйте результаты, используя односторонний анализ дисперсии, за которым последуют множественные сравнения Сидака. p-значения <0,05 были признаны значительными.

Результаты

Комбинированноевоздействие O₃ и LPS приводит к системному воспалению и мобилизации костного мозга через 72 ч: количество клеток в разных компартментах выявило значительные изменения в периферической крови и общем количестве клеток бедренного кост...

Обсуждение

Методы, представленные в текущем исследовании, подчеркивают полезность анализа нескольких компартментов для изучения множественных клеточных событий во время воспаления легких. Мы обобщили выводы в таблице 2. Мы и многие лаборатории тщательно изучили реакцию мыша на интрана...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
33-plex Bioplex chemokine panel	Biorad	12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin	Invitrogen	A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Confocal laser scanning microscope	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Invitrogen	D1306	aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope	Olympus	Olympus IX83
Ketamine (Narketan)	Vetoquinol	100 mg/ml	Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Reduced mitotracker orange	Invitrogen	M7511
Xylazine (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock