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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.

Zusammenfassung

Die Lunge ist ständig mit direkten und indirekten Beleidigungen in Form von sterilen (Partikeln oder reaktiven Toxinen) und infektiösen (bakteriellen, viralen oder pilzlichen) Entzündlichenzuständen konfrontiert. Eine überwältigende Wirtsreaktion kann zu einer beeinträchtigten Atmung und einer akuten Lungenverletzung führen, die durch lungenneutrophile Rekrutierung als Folge der pathologischen Immun-, Koagulativ- und Gewebeumbaureaktion des Wirts gekennzeichnet ist. Empfindliche mikroskopische Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Anpassungen der Mauslunge als Reaktion auf niedrig dosiertes (0,05 ppm) Ozon, einen starken Umweltschadstoff in Kombination mit bakteriellem Lipopolysaccharid, einem TLR4-Agonisten, sind entscheidend, um die Entzündungs- und Reparaturmechanismen des Wirts zu verstehen. Wir beschreiben eine umfassende fluoreszierende mikroskopische Analyse verschiedener Lungen- und systemischer Körperkompartimente, nämlich der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit, des Lungengefäßperfusats, der kryosektionen linken Lunge und des sternalen Knochenmarkperfusatsats. Wir zeigen Schäden an alveolären Makrophagen, Neutrophilen, Lungenparenchymgewebe sowie Knochenmarkzellen in Korrelation mit einer verzögerten (bis zu 36-72 h) Immunantwort, die durch diskrete Chemokingradienten in den analysierten Kompartimenten gekennzeichnet ist. Darüber hinaus präsentieren wir lungenextrazelluläre Matrix und zelluläre zytoskelettale Interaktionen (Aktin, Tubulin), mitochondriale und reaktive Sauerstoffspezies, antikoagulatives Plasminogen, sein antiangiogenes Peptidfragment Angiostatin, die mitochondrialen ATP-Synthase-Komplex-V-Untereinheiten, α und β. Diese Surrogatmarker können, wenn sie mit adäquaten zellbasierten In-vitro-Assays und In-vivo-Tierbildgebungsverfahren wie intravitaler Mikroskopie ergänzt werden, wichtige Informationen zum Verständnis der Lungenreaktion auf neuartige immunmodulatorische Wirkstoffe liefern.

Einleitung

Akute Lungenverletzung (ALI) ist eine entscheidende pathologische Reaktion der Lunge auf infektiöse oder andere schädliche Reize, die durch die gleichzeitige Aktivierung des koagulativen, fibrinolytischen und angeborenen Immunsystems gekennzeichnet ist1. Neutrophile erkennen sofort mikrobielle sowie intrazelluläre Schädigungsmuster durch die Toll-like-Rezeptor (TLR) Familie2,3,4. Neutrophile setzen vorgeformte Zytokine und zytotoxische Granulatinhalte frei, die dann Kollateralgewebeschäden verursachen können. Die daraus resultierende Alveolarschädigung wird durch sekundären Zelltod getrübt, der zur Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat (ATP)5führt und damit in einen Teufelskreis der Immundysregulation einleitet.

Ein ungelöstes Problem im Verständnis von ALI bezieht sich auf die Frage, wie die Verletzung innerhalb der Alveolarmembran ausgelöst wird. Der Elektronentransportkomplex V, F1F0 ATP-Synthase, ist ein mitochondriales Protein, von dem bekannt ist, dass es während einer Entzündung ubiquitär auf der Plasmamembran von Zellen (einschließlich Endothel, Leukozyten, Epithel) exprimiert wird. Das Zellzytoskelett, das aus Aktin und Tubulin besteht, beherbergt viele zellform- und funktionsmodulierende sowie mitochondriale Proteine. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Blockade der ATP-Synthase durch ein endogenes Molekül, Angiostatin, die Rekrutierung, Aktivierung und Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Lungenentzündung zum Schweigen bringt6. So könnten sowohl biochemische (ATP-Synthase) als auch Immunmechanismen (TLR4) die Alveolarbarriere während einer Lungenentzündung regulieren.

Die Exposition gegenüber Ozon (O3), einemUmweltschadstoff, beeinträchtigt die Lungenfunktion, erhöht die Anfälligkeit für Lungeninfektionen, und kurze niedrige O3-Expositionen erhöhen das Mortalitätsrisiko bei Personen mit zugrunde liegenden kardiorespiratorischen Erkrankungen7,8,9,10,11,12,13,14. Somit liefert die Exposition gegenüber physiologisch relevanten Konzentrationen vonO3 ein aussagekräftiges Modell von ALI zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entzündung7,8. Unser Labor hat kürzlich ein murines Modell von niedrig dosiertemO3 induziertem ALI15etabliert. Nach Durchführung einer Dosis- und Zeitreaktion auf niedrigeO3-Konzentrationen beobachteten wir, dass die Exposition bei 0,05 ppm O3 für 2 h eine akute Lungenverletzung induziert, die durch die AtP-Synthase-Komplex-V-Untereinheit β (ATPβ) und die Angiostatinexpression gekennzeichnet ist, ähnlich dem LPS-Modell. Die intravitale Lungenbildgebung zeigte eine Desorganisation der alveolären Aktin-Mikrofilamente, die auf eine Lungenschädigung hinweisen, und eine Ablation der Alveolarseptum-REAKTIVSauerStoffspezies (ROS) (was auf eine Aufhebung der Ausgangszellsignalisierung hinweist) und das mitochondriale Membranpotential (was auf einen akuten Zelltod hinweist) nach 2 h Exposition bei 0,05 ppm O315, was mit einer heterogenen Lungen-18-FDG-Retention16,Neutrophilenrekrutierung und Zytokinfreisetzung, insbesondere IL-16 und SDF-1α, korrelierte. Die Botschaft aus unseren jüngsten Studien ist, dass O 3 eine exponentiell hoheToxizität erzeugt, wenn es bei Konzentrationen unterhalb der zulässigen Grenzwerte von 0,063 ppm über 8 h (pro Tag) für die Exposition des Menschen exponiert wird. Wichtig ist, dass es kein klares Verständnis darüber gibt, ob diese subklinischen O3-Expositionen TLR4-vermittelte Mechanismen wie durch bakterielles Endotoxin17modulieren können. Daher untersuchten wir einDual-Hit-O-3- und LPS-Expositionsmodell und beobachteten die immun- und nicht-immunen zellulären Anpassungen.

Wir beschreiben eine umfassende fluoreszierende mikroskopische Analyse verschiedener Lungen- und systemischer Körperkompartimente, nämlich der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit (d.h. BAL), die die alveolären Räume beprobt, der Lungengefäßdifugelat (d.h. LVP), der das Lungengefäßgefäß abstimmt, und des alveolären septalen Interstitiums im Falle einer kompromittierten Endothelbarriere, der linken Lungenkriosektionen, um die im lavatierten Lungengewebe verbleibenden parenchymalen und adhärenten Leukozyten zu untersuchen , peripheres Blut, das die zirkulierenden Leukozyten darstellt, und das Sternal- und Femurknochenmark perfusiert, die die proximalen bzw. distalen Stellen der hämatopoetischen Zellmobilisierung während der Entzündung abtasten.

Protokoll

Das Studiendesign wurde vom Animal Research Ethics Board der University of Saskatchewan genehmigt und entsprach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care für den humanen Tiergebrauch. Sechs bis acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden beschafft. HINWEIS: Euthanasiern Sie alle Tiere, die vor dem geplanten Endpunkt schwere Lethargie, Atemnot oder andere Anzeichen schwerer Belastung entwickeln.

HINWEIS: Bereiten Sie Folgendes vor: 27-18 G nadelabstumpft (hängt vom Trachealdurchmesser der Maus ab), PE-Schlauch in geeigneter Größe, um die stumpfe Nadel zu passen (machen Sie eine PE-Kanüle für jede Maus), Kanüle, 2 scharfe Schere, 2 stumpfe Zange (klein), 1 scharfe Zange (klein), 3 1 ml Spritzen, markierte Mikrofugenröhrchen (für BAL-, Blut-, Gefäß- und Knochenmarkperfusatsammlung) und markierte Fläschchen (zur Gewebefixierung), Probenbeutel / Kryoviale zur Gewebeentnahme, Baumwollfadenrolle des Metzgers (in ausreichend große Ligaturen geschnitten). Alle für die Experimente verwendeten Chemikalien sind in der Materialtabelle angegeben.

1. Ozon- und LPS-Expositionen zur Induktion von Lungenverletzungen bei Der Maus

  1. Ozonbelastung
    1. Bereiten Sie eine benutzerdefinierte O3 Induktionsbox vor. Fügen Sie Mausfutter, Wasserflasche, Anreicherungsspielzeug und saubere Bettwäsche hinzu und ahmen Sie die Wohnumgebung der Mäuse nach.
      HINWEIS: Diese Schritte stellen sicher, dass die Mäuse freien Zugang zu Nahrung und Wasser haben, wenn sie in der benutzerdefinierten Induktionsbox untergebracht sind, und helfen, übermäßigen Stress zu lindern.
    2. Schalten Sie den O3 Kalibrator/Generator "ON" (in Richtung Einlassöffnung platziert), um die UV-Lampe vor der Hand zu stabilisieren (ca. 15 min vor der Belichtung) und verbinden Sie ihn mit dem Inline-O3 Monitor.
      HINWEIS: Der O3-Monitor sollte durchschnittlich 0,05 ppm ablesen, wie er vom Auslass bei konstanter Kammerlufttemperatur (72 ±3 °F) und relativer Luftfeuchtigkeit (50±15%) abgetastet wird.
    3. Legen Sie die Mäuse bei O3-Expositionen vorsichtig in die benutzerdefinierte Induktionsbox und setzen Sie die Mäuse 2 h lang kontinuierlich 0,05 ppm O3 aus.
  2. Anästhesie und intranasale LPS-Verabreichung
    1. Bereiten Sie 10 mg / ml Bestände für Ketamin und Xylazin separat vor.
    2. Bereiten Sie einen Cocktail zu, indem Sie 20 Teile Ketamin und 1 Teil Xylazin mischen. Wenn die Maus X g wiegt, injizieren Sie (X/200) ml Ketamin/Xylazin-Cocktail in die Peritonealhöhle. Bereiten Sie für eine Maus 1 ml Cocktail vor, der aus 1000 μL des 10 mg/ml Ketaminstocks und 50 μL des Xylazinstocks besteht. Gut mischen, indem Sie in einem Mikrofugenröhrchen auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Die Ketamin- und Xylazin-Bestände können eine Woche im Voraus zubereitet werden.
    3. Betäuben Sie die Mäuse unter leichter intraperitonealer (IP) Ketamin (50 mg/kg)/Xylazin (1 mg/kg) Mischung (z. B. für eine 25 g Maus, injizieren Sie 0,125 ml des Cocktails).
    4. Bereiten Sie eine 1 mg / ml LPS-Lösung in Kochsalzlösung vor und füllen Sie 50 μL der Lösung in eine Pipette.
    5. Halten Sie die Maus aufrecht mit ihrer Rücken- / Rückenseite auf der Handfläche und halten Sie die Ohren mit derselben Hand. Legen Sie nun 50 μL der LPS-Lösung18 vorsichtig außerhalb der Nasenlöcher (d. H. 25 μL auf jedes Nasenloch oder 50 μL in einem Nasenloch; spielt keine Rolle, solange der Vorgang schnell ist) und lassen Sie die Mäuse die LPS-Lösung einatmen.
    6. Instillieren Sie Kontrollmäusen mit 50 μL steriler Kochsalzlösung.
      Vorsicht:Überschreiten Sie nicht mehr als 100 μL für die Instillation, die tödlich sein kann. Zu wenig Volumen (d.h. <50 μL) und es besteht die Gefahr, dass nur Nasenablagerungen entstehen.
    7. Legen Sie die Mäuse nach der LPS-Verabreichung vorsichtig entweder auf den Bauch oder den Rücken auf den Einstreuhügel mit leicht nach unten geneigten Kopf.
      HINWEIS: Diese Orientierung verlängert die Retention der Lösung in der Nasenhöhle19.
    8. Bei 0, 2, 4, 24, 36 und 72 h nach der Exposition betäuben Sie die Mäuse i.p. mit der vollen Dosis Ketamin (200 mg/ kg) / Xylazin (4 mg / kg) Mischung (dh X / 50 ml des Cocktails, wobei X das Mausgewicht in Gramm oder 0,50 ml für eine 25 g Maus ist).
    9. Beobachten Sie die Maus, bis sie das Bewusstsein und den rechten Reflex verliert (d.h. sich nicht umdreht, wenn sie in Rückenlage liegt). Überprüfen Sie nun die Maus auf die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Atmung (rhythmische Brustausschläge) und die Herzfrequenz überwachen, die nach 1-2 Minuten merklich sinken sollte.
    10. Als nächstes überprüfen Sie auf Pedalreflexe, dh kneifen Sie eine der Hintergliedmaßenziffern und beobachten Sie das Zurückziehen der Extremität als Reflex. Wenn die Maus reagiert, werden Sie je nach Bedarf mit zusätzlichen Injektionen von 0,1 ml oder mehr aufgeladen.
      HINWEIS: Um eine Tiefenanästhesie zu erreichen, beachten Sie, dass bestimmte Stämme oder fettleibige Mäuse in der Regel ein größeres Verteilungsvolumen haben und daher leicht überdosiert werden können, wenn genügend Zeit für eine Vollnarkose (die etwa 10 Minuten oder mehr dauern kann) nicht vorgesehen ist. Dementsprechend können einige Stämme gegen Anästhesie resistent sein und erfordern daher mehr Aufzüge. Dieses Wissen wird nach vielen praktischen Beobachtungen und Erfahrungen mit Mäusen unterschiedlicher Stämme und Alters erworben. Da einige Pilotexperimente auch unmittelbar nachO-3- und LPS-Expositionen (d.h. zum 2-Stunden-Zeitpunkt) durchgeführt wurden, schlossen wir auch einige sehr frühe BAL-Zellanalysen aus diesen Experimenten ein, um die unmittelbaren Auswirkungen der kombiniertenO3-und LPS-Exposition hervorzuheben.

2. Probenentnahme

  1. Legen Sie die Maus auf das OPERATIONSTABLETT. Tragen Sie nun sanft schmierende Augensalbe auf beide Augen auf, um Flüssigkeitsverlust zu vermeiden, und desinfizieren Sie die Maus mit 70% Ethanolspray.
    1. Machen Sie kleine Schnitte durch die oberen und unteren Hautmembranen mit einer Schere, um die Luftröhre und den Thorax freizulegen.
    2. Machen Sie einen Schnitt direkt unter dem Brustbein und legen Sie das Herz frei.
  2. Herzpunktion
    1. Legen Sie eine 25G-Nadel, die an einer heparinisierten Spritze befestigt ist, in den rechten Ventrikel und ziehen Sie Blut durch Herzpunktion.
      HINWEIS: Blut zieht normalerweise mit minimaler Kolbenzugzug, wenn die Zeit von der Exposition des Herzens bis zur Herzpunktion weniger als eine Minute beträgt. Nach dem Sammeln von etwa 0,4-0,5 ml muss man möglicherweise einige Sekunden pausieren, bevor man das verbleibende Blut sammelt. Dies geschieht, damit das Herz das verbleibende Volumen in die rechte Kammer pumpen kann. Am Ende der Blutentnahme hört das Herz auf zu pumpen.
    2. Sammeln Sie das Blut und lagern Sie es in Mikrofugenröhrchen zur weiteren Verarbeitung.
  3. Tracheostomy
    1. Verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette / stumpfe Pinzette, um die Trachealregion von darüber liegendem Gewebe zu befreien. Verwenden Sie behandschuhte Hände mehr als die chirurgischen Instrumente, um Blutungen zu vermeiden. Wenn viel Blut austritt, besteht die Gefahr, dass die BAL-Proben kontaminiert werden. Verwenden Sie bei Bedarf Wattestäbchen, wenn auch nicht bevorzugt. Kimwipes sind bessere Alternativen.
    2. Schneiden Sie nun den Brustkorb durch, um die Lunge freizulegen. Seien Sie auch hier vorsichtig, das Brustbein und die Interkostalarterien oder die aufsteigende Aorta nicht zu schneiden; kleinere Schnitte machen, während man durch den Brustkorb vordringt)
    3. Eine Baumwollligatur unterhalb der Trachealschnipsel passieren und vorerst als solche belassen.
    4. Snipsen Sie die Luftröhre an einer geeigneten Stelle im distalen 1/3. Teil, der auf die Lunge zeigt, um den Zugang zu einer 28 G Trachealkanüle zu ermöglichen.
    5. Legen Sie eine 28 G PE-Kanüle (eine minimale Länge von 3-5 mm und distales Ende, das für ein einfaches Einsetzen getrimmt ist) in die Luftröhre ein. Achten Sie vor der Verzweigung auf das Ende der Luftröhre und ziehen Sie dann etwa einen Millimeter zurück, um zu vermeiden, dass nur ein einzelner Lappen beprobt wird.
    6. Binden Sie die Baumwollligatur fest, um die Kanüle an Ort und Stelle zu halten. Brechen Sie die Kanüle nicht zusammen.
  4. Broncho-Alveolarspülung (BAL)
    1. Füllen Sie 0,5 ml PBS in eine 1 ml Spritze.
    2. Jetzt nach und nach 0,5 ml PBS mit Hilfe einer 1 ml Spritze in die Kanüle injizieren.
    3. Nach der Injektion von PBS saugen Sie die Spritze aus, solange sie dem Absaugen nicht widersteht.
      HINWEIS: Wenn beim Absaugen der BAL-Flüssigkeit Widerstand herrscht, deutet dies auf einen Kollaps des Alveolar- oder Bronchialgewebes hin. In diesem Fall ziehen Sie die Kanüle um ein Winziges zurück, um die Kanüle von den Wänden des Gewebes zu lösen.
    4. Sammeln Sie die abgesaugte Flüssigkeit in einem markierten Mikrofugenröhrchen und legen Sie es auf Eis.
    5. Führen Sie zwei weitere Spülungen auf ähnliche Weise durch und sammeln Sie in derselben Durchstechflasche (d. h. insgesamt 0,5 x 3 = 1,5 ml Lavage).
    6. Messen Sie das Volumen der gesammelten BAL-Flüssigkeit. Die Lavage-Erholung sollte nahe bei 90% liegen.
  5. Lungengefäßperfusat (LVP)
    1. Schneiden Sie die absteigende thorakale Aorta an einer Stelle zwischen der Brust- und Bauchhälfte, um eine Wiederaufschärfung von Perfusat in der Lunge zu vermeiden, während Sie durch den rechten Ventrikel perfusieren.
    2. Tupfen Sie die Höhle in der Nähe des geschnittenen Aortenendes ab, frei von Blut.
    3. Als nächstes perfundieren Sie die Lunge mit 0,5 ml raumtemperatur-heparinisierter Kochsalzlösung, die durch den rechten Ventrikel injiziert wird.
    4. Sammeln Sie das vaskuläre Perfusat aus der Höhle am geschnittenen Ende der absteigenden thorakalen Aorta in einem Mikrofugenröhrchen, das auf Eis gelegt wird, und messen Sie sein Volumen.
    5. Ligatieren Sie den rechten Bronchus proximal zu seiner Verzweigung von der Luftröhre (mit Baumwollfaden).
  6. In-situ-Fixierung der linken Lunge
    1. Verbinden Sie eine 1-ml-Spritze mit der Trachealkanüle, die lang genug ist, um durch den vorherigen Trachealschnitt eingeführt zu werden.
    2. Ziehen Sie luft in der Spritze bis zu 0,6 ml Mark zurück.
    3. Dann füllen Sie die restliche Spritze (bis zum Ende) mit 2% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass der Kolben bereit ist, herauszuspringen, ohne Luft aus der Kanüle anzusaugen.
    4. Befestigen Sie nun die Spritze mit einem Klebeband an einem aufrechten Behälter, der bis zu 20 cm hoch ist.
    5. Ziehen Sie den Kolben vorsichtig heraus, damit das Fixiermittel in Richtung Luftröhre fließen kann. Falls sich einige Luftblasen in der Kanüle befinden, legen Sie den Kolben vorsichtig auf die Spritze und die Flüssigkeit beginnt nach einigen Sekunden zu fließen.
    6. Lassen Sie die linke Lunge insitu für 5 Minuten aus einer Höhe von 20 cm auf ihre Gesamtkapazität aufblasen und bilden Sie eine 20 cm große Wassersäule.
    7. Stellen Sie während dieses Verfahrens sicher, dass die richtigen Lungenlappen vor dem Kontakt mit Paraformaldehyd geschützt sind, da dies die nachgeschalteten Assays beeinträchtigt.
    8. Legen Sie gefaltetes Laborgewebe, um Paraformaldehyd zu absorbieren, das mit den rechten Lungenlappen in Kontakt kommen könnte.
      ACHTUNG: Paraformaldehyd ist hochgiftig. Atmen Sie daher nicht ein oder stellen Sie keinen Kontakt zu exponierten Körperteilen auf. Seien Sie bei der Handhabung äußerst vorsichtig.
    9. Während der Zeit der Paraformaldehyd-Instillation den Bauch desinfizieren.
    10. Schneiden Sie die rechten Lungenlappen von der Luftröhre ab, um sicherzustellen, dass Sie jeden Faden entfernen und die Lappen sofort in ein markiertes Kryovial legen und in flüssigen Stickstoff für die nachgeschaltete molekulare / biochemische Zytokinanalyse / RT-PCR / Western Blot-Analyse von Lungenhomogenat fallen lassen.
    11. Schneiden Sie die linke Lunge vorsichtig für Bindegewebe oder Pleuramembranen ab und tauchen Sie sie 24 h lang bei 4 °C in 2% Paraformaldehyd.
    12. Betten Sie die feste Lunge gemäß dem Standard-Einbettungsprotokoll in Paraffin ein.
      Achtung:Überhitzen Sie die Lungenproben nicht.
    13. Schneiden Sie den Bauchteil ab und enthäuten Sie ihn vom Beckenknochen (Hüftknochen).
    14. Trennen Sie die linken und rechten Oberschenkelknochen vom Beckenteil in einer mit Kochsalzlösung gefüllten Petrischale, die auf Eis gehalten wird.
  7. Sternal- und Femurknochenmark-Aspirat-Sammlung
    1. Reinigen Sie das Gewebe und die Muskeln von den Knochen, indem Sie Laborgewebe verwenden.
    2. Sammeln Sie den ventralen Brustkorb und das Brustbein in einer mit Kochsalzlösung gefüllten Petrischale, die auf Eis gehalten wird.
    3. Schneiden Sie die distalen und proximalen Spitzen der Sternal- und Femurknochen ab.
    4. Die Knochen 4 mal mit 0,5 ml Kochsalzlösung durchziehen, mit gut sitzenden Nadeln (24 bis 28 G) auf 1 ml Spritzen und die Fraktionen von jedem Knochen in markierten Röhrchen sammeln, die mit Filtern ausgestattet und auf Eis gelegt werden.
      HINWEIS: Das Nadelmessgerät variiert je nach Tiergröße. Nach der Spülung sollte der Oberschenkelknochen transparent erscheinen.
    5. Sobald die Proben gesammelt wurden, beuteln Sie die Maus in eine Plastiktüte und legen Sie sie zur ordnungsgemäßen Entsorgung gemäß den Richtlinien der institutionellen Tiereinrichtung in einen Tierkörpergefrierschrank.

3. Probenverarbeitung

  1. Gesamt- (TLC) und differentielle (DLC) Leukozytenzahl
    1. Zentrifugen-peripheres Blut, BAL, Lungengefäßperfusat und Knochenmarkproben (Sternal und Femur) für 10 min bei 500 g.
    2. Sammeln Sie die Überstände, frieren Sie sie blitzgefroren und lagern Sie sie bei -80 °C bis zur weiteren Analyse.
    3. Rekonstituieren Sie die Zellen in mindestens 200 μL PBS.
    4. Führen Sie TLC durch, indem Sie BAL-, Blut-, Lungengefäßperfusat- und Knochenmarkzellen auf einem Hämozytometer zählen.
    5. Färben Sie weitere 9 μL Aliquot von BAL mit einer 1 μL Mischung aus Calcein grün und rotem Ethidium Homodimer-1, um lebende (grüne) Zellen aufgrund der intrazellulären Esteraseaktivität und beschädigte BAL-Zellen (in rot) aufgrund des Verlusts der Plasmamembranintegrität zu quantifizieren.
    6. Fügen Sie 2% Essigsäure hinzu, um RBCs zu lysieren, in einem Verhältnis von 1: 10 für Blut TLC und 1: 2 Verhältnis für Lungengefäßperfusat TLC.
      ACHTUNG: Passen Sie die Zellkonzentrationen durch Verdünnung in PBS an, wenn die Konzentration mehr als 1x106 Zellen pro ml beträgt (sehr wichtig für die Knochenmarkproben).
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen, um Zytospins auf Objektträgern vorzubereiten und zu färben, wie unten für DLCs erläutert. Zählen Sie mindestens 100 Zellen für differentielle Leukozytenzellzahlen (DLCs).
      HINWEIS: Normalerweise kann man zwei Zytospinen auf einem Objektträger vorbereiten. Und nach 10-15 Minuten Lufttrocknung fahren Sie mit dem Färbeschritt fort.
    8. Teilen Sie das gesammelte BAL von drei Pilotmäusen pro Gruppe in jeweils zwei Zytospine auf und färben Sie Esin/Tubulin und Mitochondrien mit aktiver oxidativer Phosphorylierung (reduzierter Mitotracker) an. Verwenden Sie die BAL von drei weiteren Mäusen, um sich in jeweils zwei Zytospine für NK1.1 / Gr1 / CX3CR1 und ATPβ / Ki-67 / CD61 / Angiostatin-gefärbte Dias aufzuteilen. Teilen Sie die BAL von drei weiteren Mäusen in jeweils zwei Zytospine auf, um sie für ATPα/Ly6G und CX3CR1/Siglec-F zu färben.
  2. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) und Lung Vascular Perfusate (LVP) Gesamtproteinquantifizierung
    1. UmO3- und LPS-induzierte Störungen der Gefäßbarriere oder des relativen onkotischen Drucks in den beiden Lungenkompartimenten (d.h. den alveolären Septum- (interstitiellen) und lungenvaskulären Perfusat-Kompartimenten (vaskulär) zu quantifizieren, messen Sie den Gesamtproteingehalt in den gesammelten Flüssigkeiten.
    2. Analysieren Sie die aufgetauten Überstandsfraktionen auf ihre Gesamtproteinkonzentration mit einem standardwaschmittelresistenten kolorimetrischen Assay.
    3. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) und Lungengefäßperfusat (LVP) Chemokinanalyse
      1. Als nächstes analysieren Sie die Chemokine in BAL- und LVP-Überständen (Lung Vascular Perfusate) mit einem 33-Plex-Immunoassay auf Basis magnetischer Perlen. Dies wird über die Richtungsalität von Atemwegen / Interstitium vs. vaskulären Chemokingradienten informieren, die nach kombinierten Expositionen festgestellt wurden.
      2. Analysieren Sie die folgende Chemokinplatte: CXCL13 (B-Lymphozyten-Chemoattraktant), CCL27 (IL-11 R-alpha-Locus-Chemokin (ILC)), CXCL5 (epithelial-abgeleitetes neutrophilaktivierendes Peptid 78 (ENA-78)), CCL-11 (Eotaxin-1), Eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (Fractalkin), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (Interferon gamma), IL-10 (Interleukin-10), IL-16 (Interleukin-16), IL-1β (Interleukin-1 beta), IL-2 (Interleukin-2), IL-4 (Interleukin-4), IL-6 (Interleukin-6), CXCL-10 (Interferon gamma-induziertes Protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-induzierbares Protein 9 (IP-9)), KC (Keratinozyten-Chemoattraktant), MCP-1 (Monozyten-Chemoattractant Protein-1), MCP-3 (Monozyten-Chemoattractant Protein-3), MCP-5 (Monozyten-Chemoattractant Protein-5), MDC (Makrophagen-abgeleitetes Chemokin (CCL22)), MIP-1α (Makrophagen-Entzündungsprotein-1 alpha), MIP-1β (Makrophagen-Entzündungsprotein-1 beta), MIP-2 (Makrophagen-Entzündungsprotein-2), MIP-3α (Makrophagen-Entzündungsprotein-3 alpha), MIP-3β (Makrophagen-Inflammatory Proteiny Protein-3 beta), RANTES (reguliert bei Aktivierung, normale T-Zelle exprimiert und sezerniert (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (Stromazell-abgeleiteter Faktor 1), TARC (Thymus und Aktivierung reguliertes Chemokin (TARC)), TECK (Thymus-Exprimiertes Chemokin (CCL25)) und TNFα (Tumornekrosefaktor alpha).

4. Cytospin-Färbung und Lungenhistologie

  1. Cytospin biochemische Färbung
    1. Umschließen Sie die Zytospine mit einem hydrophoben Pen, um die Chemikalien für die Inkubation während des Verfahrens zu enthalten.
    2. Rehydrieren Sie die Zytospins in PBS für 5 Minuten.
    3. Fixieren Sie die Cytospin-Proben in 2% Paraformaldehyd für 10 Minuten, waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
    4. Mit eiskaltem 70% Aceton für 7 Minuten permeabilisieren und erneut dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten waschen.
    5. Färbung für Aktin und Tubulin oder reduziertes Mitotracker (inkubieren mit einer Mischung aus 2 μg/50 μL Alexa 488 konjugierigem Phalloidin in grün und 2 μg/μL Alexa 555 konjugiertem Maus-Anti-α Tubulin bzw. reduziertem Mitotracker in Rot) für 15 Minuten.
      HINWEIS: Verwenden Sie den IgG1-Isotypkontrollantikörper der Maus in einem separaten Cytospin, um das Tubulin-Färbeprotokoll zu validieren. Führen Sie die gleichen Schritte aus wie von 4.1.1 bis 4.1.8 beschrieben, jedoch für Isotypsteuerelemente.
    6. Entfernen Sie die Flecken, indem Sie die Mischung vorsichtig vom Dia kippen. Inkubieren Sie die Objektträger mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) für 5-10 min, um die Kerne zu färben.
    7. Die Zytospine 3 mal mit PBS für jeweils 5 min waschen, mit Anti-Fade-Montagemedien abdecken und vor der Bildgebung über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren.
    8. Erfassen Sie Bilder unter einem aufrechten Weitfeldmikroskop, das mit einer wissenschaftlichen Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie bei der Abbildung von Dias konsistente Kamerabelichtungszeiten für die verschiedenen Fluoreszenzkanäle sicher.
  2. Cytospin immunfluoreszierende Färbung:
    1. Umschließen Sie die Zytospine mit einem hydrophoben Pen, um die Chemikalien für die Inkubation während des Verfahrens zu enthalten. Rehydrieren Sie die Zytospins in PBS für 5 Minuten.
    2. Fixieren Sie die Cytospin-Proben, indem Sie sie 10 Minuten lang in 2% Paraformaldehyd inkubieren, dreimal mit PBS für jeweils 5 minuten waschen.
    3. Permeabilisieren Sie mit 0,1% kaltem Triton X-100 für 2 Minuten, waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 min.
    4. Als nächstes blockieren Sie fc für 15 Minuten, indem Sie den Cytospin mit 1:50 Verdünnung des Fc-Block-Antikörperbestands inkubieren (um sicherzustellen, dass der primäre Maus-Antikörper nicht unspezifisch mit den Fc-Antikörpern der Maus kreuzreagiert).
    5. Kippen Sie die Objektträger, um den Fc-Block zu entfernen und wechseln Sie zu 1% BSA für und inkubieren Sie den Cytospin mit einer Mischung aus 3 primären Antikörpern von Interesse (siehe Tabelle 1 für die verschiedenen Kombinationen) für 30 Minuten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Isotyp-Kontrollantikörper (inkubieren Sie mit einer Mischung aus Maus IgG1 und Ratten IgG2b Kappa Primären Antikörpern, indem Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.9 ausführen und die Antikörper durch Isotypkontrollen ersetzen) parallel zu entsprechenden sekundären Antikörpern ausführen, wie in unserer aktuellen Studie20beschrieben.
    6. 3 mal mit PBS für je 5 min waschen. Inkubieren Sie die Zytospine mit einer Mischung aus entsprechend entwickelten sekundären Antikörpern (siehe Tabelle 1 für die Details).
    7. Entfernen Sie die Flecken, indem Sie die Mischung vorsichtig vom Objektträger kippen, inkubieren Sie sie mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) für 5-10 minuten, um die Kerne zu färben. 3 mal mit PBS für je 5 min waschen.
    8. Coverslip mit Anti-Fade-Montagemedien und vor der Bildgebung über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren.
    9. Erfassen Sie Bilder unter einem aufrechten Weitfeldmikroskop, das mit einer wissenschaftlichen Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie bei der Abbildung von Dias konsistente Kamerabelichtungszeiten für alle Fluorophorkanäle sicher.
  3. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Histologie
    1. Führen Sie eine modifizierte H &E-Färbung 3 an Lungen-Kryo-Abschnitten für alle Gruppen durch.
  4. Bildanalyse
    1. Verarbeiten und analysieren Sie Bilddatendateien (.tiff) in Der offenen Software Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Überprüfen Sie die erforderlichen Parameter (Fläche, Umfang, integrierte Dichte, Formdeskriptoren, Feret-Durchmesser, Zirkularität, Display-Label), die auf der Registerkarte Analysieren und Messen festlegen aufgezeichnet werden sollen.
    3. Mit dem ROI-Managerkönnen Sie mit dem Werkzeug "Freihandauswahl" manuell etwa 50-200 Zellen im zusammengeführten Bildfenster skizzieren. Speichern Sie die Regionen von Interesse (ROI) mit dem Befehl Strg+T und kopieren Sie die gespeicherten ROIs für jede Zelle auf alle Fluorophorkanäle.
    4. Drücken Sie anschließend Strg+M, um die voreingestellten Parameter für alle fluoreszierenden Kanäle zu messen (z. B. 405 nm (DAPI oder ATPβ in blau), 488 nm (Aktin oder NK1.1 oder Ki-67 in grün), 568 nm (Tubulin oder Gr1 oder CD61 in rot) und 633 nm (CX3CR1 oder Angiostatin in Magenta)).
    5. Speichern Sie die Ergebnisse als .csv Datei unter einem geeigneten Namen, der Ihre Analyse darstellt. Kopieren Sie die Ergebnisse aus der .csv-Datei in eine Tabelle und teilen Sie die Fluoreszenzintensität (FI) (die Spalte Raw Integrated Density aus der Ergebnisdatei) des gefärbten Moleküls durch die von DAPI oder CD61 FI gemäß Färbedesign. Diese Verhältnisse werden als "DAPI- oder CD61-normalisierte FI-Verhältnisse" bezeichnet.
    6. Als nächstes zeichnen Sie diese normalisierten Verhältnisse, Zirkularität, Zellumfang und Feretdurchmesser auf, um jede Änderung der Zellgröße nach der kombiniertenO3- und LPS-Exposition zu bewerten.
    7. Verwenden Sie geeignete statistische Software, um die Normalität der gesammelten Daten zu überprüfen und die Nullhypothese zu testen (siehe Abschnitt zur statistischen Analyse unten).
  5. statistische Analyse
    1. Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± SEM aus. Pro Gruppe wurden mindestens drei Mäuse verwendet.
    2. Für die Chemokin-Datenanalyse passen Sie die Einweg-ANOVA-p-Werte für die Falscherkennungsrate gemäß der Benjamini- und Hoshberg-Korrektur an.
    3. Analysieren Sie Bildparameter, Zellularität, Feret-Durchmesser, Perimeter, DAPI oder CD61 normalisierte Fluoreszenzintensitätsverhältnisse durch Mann-Whitney U-Test (zum Vergleich von zwei Gruppen) oder Kruskal Wallis-Test (zum Vergleich mehrerer Gruppen), da diese Daten nicht normal verteilt waren.
    4. Für den Rest der bildgebungsexperimente Analysieren Sie die Ergebnisse mit einer Einseitigen Varianzanalyse, gefolgt von Sidaks mehrfachen Vergleichen. p-Werte <0,05 wurden als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Kombinierte O3- und LPS-Exposition führt zu systemischen Entzündungen und Knochenmarkmobilisierung nach 72 h: Zellzählungen in verschiedenen Kompartimenten zeigten signifikante Veränderungen im peripheren Blut und der Gesamtzellzahlen des Femurknochenknochenmarks bei kombinierten O3- und LPS-Expositionen. Obwohl kombinierteO3- und LPS-Expositionen keine Veränderungen der Gesamtzellzahl von BAL (Abbildu...

Diskussion

Die in der aktuellen Studie vorgestellten Methoden unterstreichen die Nützlichkeit der Multikompartimentanalyse zur Untersuchung mehrerer zellulärer Ereignisse während einer Lungenentzündung. Wir haben die Ergebnisse in Tabelle 2zusammengefasst. Wir und viele Labore haben die murine Reaktion auf die intranasale LPS-Instillation umfassend untersucht, die durch eine schnelle Rekrutierung von Lungenneutrophilen gekennzeichnet ist, die zwischen 6-24 Stunden ihren Höhepunkt erreicht, woraufhin die Auflö...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder Offenlegungen vorzunehmen.

Danksagungen

Die durchgeführte Forschung wird durch den NSERC-Zuschuss des Präsidenten sowie durch Start-up-Mittel des Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finanziert. Das Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation wird von Innovation Saskatchewan finanziert. Die Fluoreszenzbildgebung wurde im WCVM Imaging Centre durchgeführt, das von NSERC finanziert wird. Jessica Brocos (MSc Student) und Manpreet Kaur (MSc Student) wurden aus den Start-up-Mitteln des Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
33-plex Bioplex chemokine panelBiorad12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectivesLeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11002
Alexa 488 conjugated phalloidinInvitrogenA12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)InvitrogenA21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)InvitrogenA11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)InvitrogenA21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL/6 J MiceJackson Laboratories64
Confocal laser scanning microscopeLeicaLeica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)InvitrogenD1306aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscopeOlympusOlympus IX83
Ketamine (Narketan)Vetoquinol100 mg/mlDilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kitInvitrogenL3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)Invitrogen459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)InvitrogenA-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)Invitrogen16-5941-82
Pierce 660 nm protein assayThermoscientific22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgGAbcamab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)Invitrogen14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappaInvitrogen14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)Invitrogen16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)Invitrogen53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)BD Pharmingen553142
Reduced mitotracker orangeInvitrogenM7511
Xylazine (Rompun)Bayer20 mg/mlDilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

Referenzen

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